博 士 （ 歯 学 ） 福 島 久 夢
学 位 論 文 題 名
● I
Effect of compresslVeforCeonoSteOClaStogeneSlS （ 圧 縮 カ が 破 骨 細 胞 分 化 に 与 え る 影 響 ）
学位論文内容の要旨
【 緒 言 】
歯 科 矯 正 治 療 の 目 的 は 歯 を移 動 し 個 体 にと っ て 最 適 な咬 合 を 確 立 す るこ と で あ る ．歯 科 矯 正 治 療で 歯 の 移 動 を 行 う際 に は ， 矯 正カ が メ カ ニ カル ス卜 レスと して， 骨組織 を形成 して いる骨 細胞， 骨芽細 胞， 破骨細 胞 お よ び 歯 根膜 由 来(PDL)細 胞 など の 細 胞 群 に作 用 し ， こ れら の 細 胞 群 が メカ ニ カ ル ス トレ ス を 感 受 し， 生 体 反 応 が 生 じ た 結 果 ， 破 骨 細 胞 によ る 骨 吸 収 と 骨芽 細 胞 に よ る骨 添 加 が 生 じ， 歯 が 移 動 する ． 近 年 ， 骨 芽細 胞 やPDL細 胞 に メ カ ニ カ ル ス 卜 レ ス と し て 圧 縮 カ を 作 用さ せ る と 破 骨 細胞 分 化 誘 導 因子 が 増 加 す ると の 報 告 は あ る が ， 破 骨 細 胞 分 化 誘 導 系 に 直 接 圧 縮 カ を 作 用 さ せ た 報 告 は な い． 本 研 究 の 目的 は ， 破 骨 細 胞分 化 誘 導 系 に直 接 圧 縮 カ を作 用 さ せ ， その 影 響 を 検 索す る こ と で あ る．
【 材 料 と 方法 】
最 終 濃 度50 ng/mlのRANKLを 添 加 し たaMEM培 養 液 を 用 い て ，RAW264.7 (RAW)細 胞 を6穴 プ レ ー ト に て 培 養し ， 圧 縮 カ とし て 細 胞 層 上に シ リ コ ン 製の 円 筒 を 乗 せ た， 重 さ の 調 節は 円筒 内にス テン レスス チ ー ′ レ を 入れ ， 圧 縮カは0．5，1.0 g/cm2，作用 時間は0，15，30，60および90分と し，培 養3，4，5日目に それ ぞ れ 持 続 的 に 作 用 さ せ た ． 圧 縮 カ を 作 用 さ せ た 群 をCF群 ， 作 用 さ せ ない 群 を 対 照 群と し た ． 一 定期 間 培 養 後 ， 圧 縮カ を 作 用 さ せた 後 ， 酒 石 酸耐 性 酸 性 ホ スフ ァ タ ー ゼ(TRAP)染 色 し ， 破 骨 細胞 数 （2核 以上 ） お よ び 巨 大 破 骨 細 胞 数 （8核 以 上 ） を 測 定 し た ． ま た ，RANKL非 添 加 のRAW細 胞 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ ， 細 胞内 ATP量 を 測 定 し た ． 次 に ， 培 養5日 目 に1.0 g/cm2の 圧 縮 カ を 作 用 さ せ たCF群 に つ い て ， ア ポ ト ー シ ス 関 連 因 子 の 発 現 状 況 をreal time PCR法 で 検 索 す る と と も に ， ネ ク ロ ー シ ス の 発 現 状 況 を 乳 酸 脱水 素 酵 素 (LDH)量 で 検 索 した ．
【 結 果 】
培 養 日 程3日 目 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ た 場 合 ， 対 照 群 と 比 較 しCF群 で は ， い ず れ の 圧 縮 カ お よび 圧 縮 時 間 に お い て も 総 破 骨 細 胞 数 に 有 意 な 差 を 認 め な か っ た ， 培 養4日 目 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ た 場 合 ，CF群 で は ，1.0 g/cmzの 圧 縮 カ を30分 間 以 上 作 用 さ せ る と ， 総 破 骨 細 胞 数 が 減 少 し た ． 培養5日 目 に 圧縮 カ を 作 用 さ せ た 場 合 ， い ず れ のCF群 に お い て も ， 総 破 骨 細 胞 数 は 有 意 に 減 少 し1.0 g/cm2の 圧 縮 カ を90分 間 作 用 さ せ た 群 で は 対 照 群 の 約60%に 減 少 し た ， 巨 大 破 骨 細 胞 数 も 培 養4，5日 目 のCF群(0.5，1.0 g/cm2)に お い て 有 意 に 減 少 し た ． ま た ， 培 養3日 目 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ そ の 後48時 間 培 養 を 続 け た 場 合 ，総 破 骨 細 胞 数 に 有 意 な 差 を 認 め な か っ た ． ま た ，RANKL非 添 加 のRAW細 胞 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ ， 生 存 細 胞 内 ATP量 に よ り 生 存 細 胞 数 を 測定 し た と こ ろ，CF群 と 対照 群 と の 問 に有 意 な 差 を 認め な か っ た ．培 養5日 目 に 1.0 g/cmzの 圧 縮 カ を 作用 さ せ たCF群 お よ ぴ 対 照群 の ア ポ ト ーシ ス 関 連 因 子の 発 現 状 況 を 検索 し た と こ ろ，
ア ポ ト ー シ ス 誘 導 因 子 で あ るFasお よ びBaxはCF群 に お い て ，mRNAの 発 現 が 有 意 に 上 昇 し た ． し か し ， ア ポ ト ー シス 誘 導 因 子 であ るCaspase3お よ ぴ8の 発現 は 有 意 な 差 を認 め な か っ た， さ ら に ， アポ ト ー シ ス 抑 制 因 子 で あ るBc卜2の 発 現 も 有 意 な 差 を 認 め な か っ た が ， 同 様 に ア ポ ト ー シ ス 抑 制 因 子 で あ るBcトxLの
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mRNAの 発 現 はCF群 で 有 意 に 上 昇 し た ． ま た ，5日 日 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ たCF群 に お い てLDH量 の 変 化 に つ い て 検 討 を 行 っ た と こ ろ ，CF群 と 対 照 群 と の 問 にLDH量 の 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た ．
【 考 察】
骨 芽 細 胞 な ら び にPDL細 胞 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ る 実 験 と し て ， こ れ ま で1.0ー5.0 g/cm2程 度 の 圧 縮 カ が 用 い ら れ て い た ． そ こ で ， 予 備 実 験と して ， はじ めに1.0，2.0お よ び4.0 g/cmzの 各 圧縮 カを0，15，30，60 お よ ぴ90分 間 持 続 的 に 作 用 さ せ ， 総 破 骨 細 胞 数 を 計 測 し た ． 2.0あ る い は4.0 g/cm2の 圧 縮 カ を ，15分 間 作 用 さ せ た 場 合 ， 対 照 群 と 比 較 しCF群 で は 総 破 骨 細 胞 数 が 約20%に 減 少 し た ． す な わ ち ， 破 骨 細 胞 は 圧 縮 カ に よ り そ の 数 が 減 少 し ， 分 化 誘導 は抑 制 され るこ と が示 唆さ れ た． 2.0 g/cmz以上 の 圧縮 カで は 細胞 へ の 障 害 が 非 常 に 大 き い こ と か ら ，RAW細 胞 お よ び 破 骨 細 胞 に 用 い る 圧 縮 カ の 強 さ は0.5あ る い は1.0 g/cm2 を 用 い る の が 有 効 で あ る と 考 え ， 本 研 究 で は こ れ ら の 圧 縮 カ に 対 す るRAW細 胞 お よ び 破 骨 細 胞 の 反 応 を 観 察 し た ， 培 養3日 目 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ た 場 合 ， 破 骨 細 胞 数 は 圧 縮 カ の 影 響 を 受 け な か っ た が ， 分 化 ・ 融 合 が 進 ん だ 培 養4日 目 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ たCF群 （1.0 g/cm2)で 総 破 骨 細 胞 数 が 減 少 し ， さ ら にCF 群(0.5，l.Og/cm2)に お い て 巨 大 破 骨 細 胞 数 が 減 少 し た ． 培 養5日 目 で は い ず れ の 圧 縮 カ に お い て も ， 総 破 骨 細 胞 数 お よ び 巨 大 破 骨 細 胞 数 が 減 少 し た ． こ れ ら の 結 果 か ら ， 破 骨 細 胞 数 の 減少 は ，圧 縮カ に よる 破 骨 細 胞 の 融 合 に よ る 数 の 減 少 で は な い こ と が 示 さ れ た ． ま た ， 破 骨 細 胞 分 化 ・ 融 合の 初 期段 階で は 圧縮 カ に よ る細 胞数 へ の影 響は 少 なく ，よ り 分化 ・融 合 が進 むこ と で， その 影 響を 受け る こと が示 唆 された ，破骨細 胞 前 駆 細 胞 で あ るRAW細 胞 が 圧 縮 カ に よ る 影 響 を 受 け る の か を 検 討 し た 結 果 ， い ず れ の 圧 縮 カ に お い て も ， 細 胞 内ATP量 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら ，RANKL非 添 加 のRAW細 胞 数 に は 圧 縮 カ は 影 響 し な い こ と が 示 唆 さ れ た ． ま た 培 養3日 目 に 圧 縮 カ を 作 用 さ せ そ の 後48時 間 培 養 を 続 け た 場 合 ， 総 破 骨 細 胞 数 に 有 意 な 差 を 認 め な か っ た こ と か ら ， 培 養 初 期 に ， 圧 縮 カ を 作 用 さ せ た 場 合は 誘 導さ れる 破 骨細 胞 数 へ の 影 響 は な い こ と が 明 ら か に な っ た ， 次 に ， 培 養 後 期 に 破 骨 細 胞 数 が 減 少 す る原 因 が細 胞死 に よる も の か を 分 析 し た ．real time PCR法 で ア ポ ト ー シ ス 関 連 因 子 の発 現 状況 を検 索 した 結果 ， 圧縮 カを 作 用さ せ る と ，Fasお よ びBaxのmRNAの 発 現 は 上 昇 し た が ，Caspase3お よ ぴ8の 発 現 は ， 有 意 な 差 を 認 め な か っ た ， わ ず か15分 間 圧 縮 カ を 作 用 さ せ る だ け で ， 総 破 骨 細 胞 数 が 減 少 し て お り ，mRNAか ら タ ン パ ク 質 に 翻 訳 さ れる 時間 的 な背 景か ら ，総 破骨 細 胞数 の減 少 はア ポト ー シス によ る もの では な いと 推察 し た，ま た，総破 骨 細 胞 数 の 減 少 が ネ ク ロ ー シ ス に よ る も の か を 考 察 す る た め ，LDH量 の 測 定 を 行 っ た ． 細 胞 が 細 胞 膜 破 壊 を 伴 う 細 胞 死 に 至 る とLDHが 細 胞 外 に 流 出 し ， ネ ク ロ ー シ ス に お い て ， 細 胞 外 に 流 出 す るLDH量 が 上 昇 す る と いわ れて い るが ，CF群 と対 照群 を 比較 した と ころ ，LDH量に 有 意な 差は 認めら れなかった．このこ とから，
培 養 後 期 に 破 骨 細 胞 数 が 減 少 し た 原 因 は ネ ク ロ ー シ ス に よ る 細 胞 死 で あ る 可 能 性 は 低 い と 考 え ら れ た ，
【 結 諭】
RAW細 胞 な ら び に 破 骨 細 胞 に メ カ ニ カ ル ス ト レ ス と し て 圧 縮カ を 作用 させ た 場合 ，以 下 のこ とが 明 らか と な っ た．
1． RAW細 胞数 お よび 培養 初 期の 破骨 細 胞数 は圧 縮 カの 影響 を 受け にく い ．
2． 培 養 後 期 の 破 骨 細 胞 は 圧 縮 カ の 影 響 に よ り ， そ の 数 が 減 少 す る ． 特 に ， 巨 大 破 骨 細 胞 数 は 圧 縮 カ の影 響を 受 けや すい ．
3． 培 養 後 期 の 総 破 骨 細 胞 数 お よ び 巨 大 破 骨 細 胞 数 が 圧 縮 カ に よ り 減 少 し た 原 因 は ， ア ポ ト ー シ ス や ネク ロー シ スに よる 細 胞死 が原 因 であ る可 能 性が 低い ，
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学 位論文審査の要旨 主査 教授 飯田順一郎 副 査 教 授 鈴 木 邦 明 副査 ′ 教授 土門卓文
学 位 論 文 題 名
Effect of compressive force on osteoclastogenesis （ 圧 縮 カ が 破 骨 細 胞 分 化 に 与 え る 影 響 ）
審査は審査員全員出席の下で行った。まず申請者に提出論文要旨の説明を求めると ともに、適宜提出論文の内容に関する説明を求め、その後口頭試問の形式で内容およ び 関 連 分 野 に っ い て 試 問 し た 。 ま ず 申 請 者 か ら 以 下 の 説 明 が な さ れ た 。
【緒言】
近年、骨芽細胞や歯根膜線維芽細胞にメカニカルストレスとして圧縮カを作用させると破 骨細胞分化誘導因子が増加するとの報告はあるが、破骨細胞分化誘導系に直接圧縮カを 作用させた報告は未だされていない。本研究の目，的は，破骨細胞分化誘導系に直接圧縮 カを作用させ，その影響を検索することである，
【材料と方法】
RANKL 添 加培 養液 を用 いて RAW264.7 細 胞 (RAW 細 胞） を6 穴プ レート にて培養し、圧 縮カとして細胞層上にシリコン製の円筒を乗せた。重さの調節は円筒内にステンレススチー ルを入れ、圧縮カは0.5 、l.Og/cm2 、作用時間は0 、15 、30 、60 、90 分とした。一定期間培養 後、圧縮カを作用させ、破骨細胞数および巨大破骨細胞数（8 核以上）を測定した。圧縮カ を作用させない群を対照群、圧縮カを作用させた群をCF 群とした。一定期間培養後、圧縮 カを作用させた後、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP) 染色し、破骨細胞数（2 核以上）
および巨大破骨細胞数（8 核以上）を測定した。また，RANKL 非添加のRAW 細胞に圧縮カ を作用させ、細胞内ATP 量を測定した。次に，培養5 日目に1.0 g/cm2 の圧縮カを作用さ せたCF 群についてアポトーシス関連因子の発現状況をreal time PCR 法で検索するととも に 、 ネ ク ロ ー シ ス の 発 現 状 況 を 乳 酸 脱 水 素 酵 素 (LDH) 量 で 検 索 し た 。
【結果・考察】
培養期間3 日間ではいずれの圧縮カにおいても，、対照群とCF 群の間に総破骨細胞数 に有意な差を認めなかったが、培養期間5 日間ではCF 群では圧縮カおよび作用時間依存 的に総破骨細胞数が減少した。また、同日程で巨大破骨細胞数を計測したところ、培養5 日間ではCF 群で巨大破骨細胞数が有意に減少したことから、細胞融合により総破骨細胞 数が減少したのではないことが示された。また培養期間5 日間で3 日目に圧縮カを作用さ
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せ、 その後圧 縮カなしで培養を続けた場合、破骨細胞数およぴ巨大破骨細胞数は有意な 差を認めず、培養初期に圧縮カを作用させても破骨細胞数に影響がないことが示された。
RANKL 非 添加 の RAW 細 胞 に 圧縮 カ を作 用 さ せ、 生 存細 胞 内 ATP 量 に よ り生 存 細胞 数 を 測 定 し た と こ ろ 、 有 意 な 差を 認 めず 、 圧 縮カ に よる 影 響 は認 め られ な か った 。 圧縮 カにより 破骨細胞数が減少する原因は細胞死によるものかを解明するため、real time PCR 法でアポトーシス関連遺伝子の発現状況を検索した。Bax 、Fas 、Bc トxL は上昇し たがCaspase は上昇せず、破骨細胞死が生じるまでの時間的な背景から、アポトーシスによ る細胞死の可能性は低いと示唆された。また、LDH 法によルネクローシスの検出を行った。
対照群とCF 群の間に有意な差を認めなかったことから、破骨細胞数が減少する原因はネク ローシスではない可能性が示唆された。
【結論】
RAW 細胞ならびに破骨細胞にメカニカルストレスとして圧縮カを作用させた場合。以下の ことが明らかとなった。
1 ． RAW 細 胞 数 お よ ぴ 培 養 初 期 の 破 骨 細 胞 数 は 圧 縮 カ の影 響 を 受け に くい 。 2 ．培養後期の破骨細胞は圧縮カの影響により、その数が減少する。特に、巨大破骨 細胞数は圧縮カの影響を受けやすい。
3 ．培養後期の総破骨細胞数およぴ巨大破骨細胞数が圧縮カにより減少した原因は、
ア ポ ト ー シ ス や ネ ク ロ ー シ ス に よ る 細 胞 死 が 原 因 で あ る 可 能 性 が 低 い 。
以上の 論述に引 き続き、以下の項目を中心に口頭試問を行った。
1 ．細胞 に対する 圧迫刺激 の方法につ いて 2 ．機械 的刺激に よる細胞 死の種類に ついて
3 ． ア ポ ト ー シ ス 、 ネ ク ロ ー シ ス の 判 定 方 法 に っ い て 4. 今後の 研究の展 開につい て
矯正 カによる 歯の移動 の機構に 関しては多 くの研究 が為されているが、破骨細胞が 直接 圧迫刺激 を受けた 際にどの ような様相 を示すか について は、未だに明らかにされ てい なかった 。本研究 では破骨 細胞に直接 圧迫刺激 を加える 方法を開発し、圧迫刺激 を加 えた際の 破骨細胞 数、また その減少の メカニズ ムを検討 している。その成果によ り、 圧迫側歯 根膜にお いて一度 増加する破 骨細胞が 次第に減 少していくメカニズムに 関し て、その 一端が明 らかにさ れ、有効な 矯正カの 付与方法 などの解明に重要な情報 を与 えたもの と高く評 価できる 。加えて、 試問に対 する回答 は適切なものであり、申 請者 は本研究 に直接関 係する事 項のみなら ず、関連 分野にお ける基礎的な広い学識を 有し ていると 認められ た。また 、今後益々 本研究を 発展させ て行く可能性があるもの と評 価された 。よって 審査担当 者全員は、 申請者は 博士（歯 学）の学位を授与される 資格 を有する と認めた 。
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