酵母

J='uF排

究

酵母 S

s i ae の DNA 修復機能欠損株 を 用 いた化学物質の造伝毒性評価への利用

青 山 動

緒 言

近 年,有 害化 学物質 に よ る環境 汚染 は 人間 を含 む あ らゆ る生 命体 の存亡 に も係 わ る塵 要 な問題 とな りつつあ る.化 学物 質 の毒 性 試験 の ため に さ ま ざまな生 物 が その 日的 に よ って 使 い分 け られ てい る.例 えばAmesTestや Rec‑assayは原核 生物 であ るバ クテ リア類 を 用 いた環境変 異 原性 試験 法 として よ く知 られ て い る(Kadaetal.1972,Amesetal,1975, Matsui,1980,Andersonetal.1981,Williams,1985,Bhatiaetal.1987).人間 を含 む よ り高等 な生物 に対 す る迫伝毒 性 に関す る情報 を得 るため に は, その原理 に お い て同 じで あ る とは言 え, 正枝 生物 に対 す る冶 伝毒性 の 試験 法 を確 立 してお くこ とは鮭め て重 要 であ る と考 え る.

本研 究 の 目的 は真核微 生物 酵母 を環境変 異原性試験 に用 い る可 能性 に つ い て検 討 す るこ とであ る.近年 , 酵母 は生理 学や 迫伝学 の分 野 にお い て広 く研 究 材料 と して用 い られ て い る.酵 母は柏 物 プ ラン ク トンに比べ て,培養 が容 易 であ り,特 別 な実験 設備 t,必要 とせ ず, 安価 で,迅 速性 もあ り,毒 性 試験 の供 試生物 と して も用 い られ るよ うに な って きた(BlttOn etalリ1984,Kwansniewskaeta1.,1984,Eckerdteta1.,1985,Aoyamaeta1.,1986).酵 母 は切 り出 し修 復, 突然変 異修 復 お よび組 換 え修復 の3つの独 立 なDNA修復 機能 を有 し てい る. それ故酵母の DNAが化 学物質 に よって手刷藩を受 け た時, それ は上 に述べ た3つ のDNA修 復機 能 の どれか, あ るいは全 てが機 能 して修 復 を受 け, 酵母 の細 胞 は増 殖 を続 け るこ とに な る, しか し, も し酵母 のDNA修復 機 能 が欠損 してお れば,細 胞 の増 殖 は止 まるか あ るいは抑制 され る. この特 性 を利 倒 して酵母 の細胞 増殖 のパ ター ンを解析 す るこ とに よ って化学物 質のDNAに及 ぼす影響 を推 測す るこ とが で き るであ ろ う. 本研 究 に お いては,有 害化 学物質 として,重 金属 の カ ドミウム と4NltrOquinolinelN‑oxide(4NQO) を用 いた.本研 究 にお いてはDNA修 復機能 の うちの 1つ, 2つ あ るいは全 て を欠 除 した 突 然変 異株 を用 い, 化学物 質 に対す るそれ ぞれ の 突然変 異株 の感 度 を検討 した. 酵母 細 胞 はDNAの損傷 に よ るたけ で な く,何 等 か の生理 的要 因に よ って も増殖 が 止 ま る と考 え ら れ る.この事 を考 膚 す る と,この よ うな研 究 目的の ため にはisogenicな株 を用 い るこ とか 要求 され る. しか しここ で用 い られ た突然変 異株 はisogenicでは ない と思 われ る.それ故 著者 は isogenic株 を作 出す るため に野生 株 とDNA修 復機 能 欠損株 とを戻 L更地 を行 っ

平成3年1月22日受理

271

てお り. その一部 につ いては本稿 で述べ る.

本研究は 日本生命肘剛 汁究肋放念及U文部省科学研究熱 こよって行われた.本研究 を進め るに 当た り.酵 母の変災株の銀与 と.isogenic株 を作 出す るための技術 を親切に指涛斬った岡山大学薬学部小野文一郎助 教授に謝意 を衷す る.

実 験 材 料 及 び 方 法

本研 究には,発芽 に よって増殖す る酵母SacchwomycesceTleuisiaeの7種 の突然変異株 を供 試生物 として用 い た. これ らの突然変 異株 は国立遺伝研 究及 び岡山大学薬学部 (小 野 文一郎博士所蔵 ) よ り預 与 され た もので ある.酵母の培饗 に用 い た YPD培地の組 成 は次 の通 りであ る.

bacto‑yeastextract 10g bacto‑peptone 20g glucose 20g

蒸 留 水 1

9

実験 に用 いた株 及び略称 は次 の通 りであ る.野生株AOYl,切 り出 し修 復機能欠損株 ‑ AOY2(Fad1),突然変 異修復機 能欠損株 ‑AO3(rad18),組換 え修復機 能 欠損株‑AOY 4 (rad52), これ らの突然変異株 は どれ も紫外線感受性株 であ り,化学物質 に も感受性 が あ る と報告 され てい る(柳 島宜彦他,1982).実験 に用 い られ た他 の突然変 異株 は,上述 の 3つの修復機 能の2つ または3つ とも欠視 した株 で,AOY9(radlrad18),AOYll(rad18 rad52),AOY12(radlrad52),及 びAOY13(radlrad18rad52)であ る.実 験 に用 いた化学 物質 は変異原性 あ るいは発 ガ ン性 が確認 されてい る4nitoroquinolinelN‑oxide(4NQO)

と重金属 カ ドミウム(CdC12)であ る. また比較 の ため に非変異原物質 として知 られ てい る Kanamycinを用 いた.多 くの有機化 学物質 は水に不 溶性 か難 溶性 であ るこ とが 多い.その よ うな化 学物質 の微生物 を用 いた毒 性 試験 を液体 培地 で行 うとき,化 学物質 は何 等かの溶 媒 を用 いて溶解 させ ねば な らない. それ故実験前 に溶媒 自身の供 試微 生物 に対 す る毒性作 用 を調べ てお くこ とが必要 であ る.本研 究にお いては, 溶媒 として DMSOとエ タ ノー ル の酵母 の増殖 に及ぼす形轡 を検 討 した.

酵母 の培養 には全 自動微生物 培茸 装置 BLOSCREEN C (Lab‑system社 製) を用 いた.

培養 開始前 に細 胞計数美濃 CELLTAC (NihonKoden社 製)を用 いて細 胞密度 を計測 し, 初期 の細胞密度 を5×105cells/mlとな るよ うに設定 し,培養温度 は30±0.2℃に保持 した.

細胞密度 は波長660nmの吸光度 を測定す るこ とに よって行 い,20分 間隔 で 自動 的に連続測 定 し,酵母細胞の増殖 曲線 を得 た.各浪度 区に対 して, 4回の繰 り返 し実 験 を行 い, その 中に他 と比べ て著 しい差異があ るデー タは平均値 を求め るときに計算 か ら省 いた.予め求 め ておいた吸光 度 と細胞密度 との関係 か ら,吸光 度 を換算 して細 胞数 を求め た.苛 性 強度 を評価す るため に,計測 され た吸光 度か ら次式 に よって,各強度 区に刈 す る酵母 の貴大増 殖速度定数 〃 (1/h)を算 出 した.

〟‑1n (ABS2/ABSl)/T

ここで.ABSl.ABS2はそれ ぞれ時刻Tl,T2におけ る吸光 度であ る.Tは(T2‑

272 _{腿 学 研 究}

Tl)で,計算に際 しては1時間 を取 った.Tl,T2の選定は実験 で得 られた酵母の増殖 曲線か らFLの値が拡大 となる時刻 を選 んだ.酵母細胞の生存率 は,対照区の細胞密度が初 期細胞密度の10倍値 (5×106cells/ml)になった ときの対照区の細胞密度に対 す る実験区

の細胞密度の比か ら井出 した.

実 験 結 果 及 び 考 察

Fig.1および Fig.2はそれぞれ溶媒 DMSOおよびエ タノールの漉度変化 に対す る増 殖速度定数の変化 を示 している.培地中のエ タノール漉度が10%以下の時には増殖速度定

(qJT)aTdtlq一JhO･ZUaA!TdlatZ tt

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62^巷 (1991) 273

‑̲I,■【･‑‑r 一･‑.■一･一一一I‑ TTTl‑'‑

一 一 一 一 ‑

0.1 1

Cone.of EtOH (%)

Fig.1.Effectofthesolvent,ethanoJonRGR

･ +

‑ ‑‑

･.lDY1

‑ I ‑

nU 5 10 1 5

Conc. ofI ) MSO ( ; i )

Fig.2.Effectoftheso)vent,DMSOonRGR

数 に影 響 を与 えなか った.DMSO浪度か 20/Oを越 える と,実験 に用 いた4種 の突然変異株 に対 して増殖 阻害が認め られた. それ故 DMSOを溶媒 として用 い る とき, 2%以下に抑 えるべ きであ る.葵際 の寄性試験 にお いては,エ タノー ル浪度が10%を越 えた り,DMSO 濃度が2%以上 で用 い るケ‑ スは希 であ る と思 われ るの で,実用上 これ らの物暦 を溶媒 と して酵 母を用 いた毒性 試験 に使 用 して も問題 はない.本 実験 にお いては, カ ドミウムは蒸 留水 を, 4NQOはエ タ ノー ル を溶媒 として用 いた.実験 に用 い る4NQOの貯蔵溶液 とし て,100%ェ タ ノー ル溶液12に500mgの4NQOを溶解 させ,10mg/P漣度 の4NQO溶 液 を作成す るの に,蒸 留水 で希 釈 した. この時 てエ タ ノール濃度 は2%に相 当す る. それ 故,エ タノー ル濃度 は100/Oを越 えていないの で,酵母の増殖 に及ぼす ェ タ ノー ルの影IV は 無視 した. しか し蒔性 試験にお いて,有機 溶媒 を用 い る とき, それ 自身が毒性 を持 つ事 か あ るの で,溶 剤 と供 試化 学 物 紫 の毒 性 の相 互 作 用 を予 め 調べ て お くこ とは重要 で あ る (Stra亡亡on,1987,1988).培地 に4NQOとカ ドミウム をそれぞれ単独 に添加 した ときの 環大槽租速度定数 の濃度依和 室EをTables 1, 2に示 す.4NQOあ るいは カ ドミウム を 漆加 した ときのAOYl(野生株 )の増柵 速度定数 は他 の突然変異株 よ り高 い値 か観 測 され た. い くつかの株 の対照 区の増殖速度定数の値 は必ず しも‑一致 しなか った. これは実験誤 差 に加 えて, これ らの株 が遺伝学的に同質(isogenic)でない串 に も起 因 してい る と考 え ら れ る, 言 い替 えれば,株 に よ りこれ ら2つの化学物質 に対 して感受性 に差 が あ るこ とを示

してい る.

TabLe 1.RelativeGrowthRatefor4NQO(1/h)

C^oncentrationo f4NQO(mg /A )

0 002 0,04 0.08 0.20 0.40 0.80 0.800

AOYI AOY2 AOY3 AOY4 AOY9 AOYll AOY12 AOY13

61702538018004753322322200000nU00

O509600∩コ3100267ILへJ33323222 349648601266387131111001

0nU000000

234866∩コ∩コ207855LへJ232111221

00000000

7316∩コ7622180056LへJ33233222

00000000

34∩コ2∩コ35∩コl19000..q一13323322200000000

8705180800∩コ∩コ1363 200000000060000020100000

Table 2.RelativeGrowthRateforCd(1ノh)

ConcentratlOnOf4NQO(mg/B)

0 0.2 0.4 0.8

AOYI AOY2 AOY3 AOY4 AOY9 AOYll AOY12 AOY13

13786641319174LへJ1日q

274

31∩コlnコ一日q643322222200000000 258049323222212200000000 nUO834782215仁U94∩コ∩コ32211111 27870424100nU101100000000 ∩コ53222588354648100000001L00000000 究柿ん.I1.r脂

0

aUutZq･1

0

10 20 50

Ti m e ( hours)

Fig･3 Grow[hcurveoftheyeasllStrainAOYlexposedlo4NQO

O

aUudqlOSqV

10 20

Ti m e( hours)

Fig･4･Grow仙 curveofthe)′east.StrainAOY4exposed〔04NQO

Figs･3, 4は4NQOを添加 した時のAOYlとAOY4 (rad52‑組替 え修 復機能欠抗 秩)株の増殖曲線の変化 を示 している.4NQOは変異原物質 であ り,培地 中の浪度の増加 とともに誘導期が長 くな り,増殖速度定数が小 さ くなった.この傾向はAOYl株 よ りAOY 4株の方が強 く現れた.添加 した毒物の浪度の増加 とともに,酵母の増殖 が低下 し,野生 株 と突然変異株 との間に増的速度に差が生 じるのは毒物によるDNAの均衡が起 こ り,那 生株 では修復機能が働 いているが,欠損株 では修 復されすに細胞死が起 こっていることを 示 している. これ を確認す るために,非変異原物質 として知 られているKanamycinを境 地に添加す ることによって酵母の増殖特性に影響があるか どうか を調べた.Fig,5は増殖 速度定数 とKanamycin汲度 との関係 を示 している.実験に用いたほ とん どの株は異なる Kanamycin漉度に対 して,標準的 な相席速度定数が得 られた.しか L前に も述べ たように,

これ らの株は完全な同質遭伝子株 ではか ､ので, い くつかの株はそれに固有の増殖速度定 数 を持 っている.AOYl株の細胞増殖は,Kanamycin濃度か10mg/A程度になっても影

62巷 (1991) 275

(TtJT

) al ｡

0. 3

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0

. 0 01 0. 01 0. 1

Conc.ofXana 皿yCi n( mg /1 )

‑ AOY1

･･･一一 AOY2

‑

.

Fig 5.ChangeinRGR oftheyeasteJT<POSedtoKanamycin

nUnUnU▲UU6一ハ｢nUnUorL

01 0.1

1

Conc.ofCd ( mg/1 )

‑

‑I‑+ AOYLl

=

*

‑ ‑ ‑ .0AOY12 10

一 ･ 一

Fig.6,ChangeintheInhibitionrateofRCRforCd

轡 されなか った.Fig.6はカ ドミウム を添加 した時の8種の野生株及 び変 異株 の増殖速度 定数か ら求め た増殖阻平準 を示 してい る.阻宰牢 (I.良)は次式に よって求め た.

LR(%)

‑ (11jLc｡nJp

L ｡

ここでFLc｡｡t及 びJLl｡Xはそれぞれ対照 区及 び毒物 を添加 した実験 区の最 大増殖速度定数 であ る.Fig.7は生存率 を示 してい る.生存率 は対照区の酵母の細胞数に対す る化学物質 が添加 された酵母細胞数の比 として定嚢 されてい る. カ ドミウムが培地に添加 された突然 変異株の増殖 阻害率 は広 くな り,生存率 は低下 した. これはカ ドミウムに よって誘起 され たDNA傷害の ため であると考 えられ る, これはBucillussublilusを用 いたrecassayと 同様 な理論に基づ いている.Figs.8, 9は同様 に して4NQOを培地に添加 した ときの増 殖阻害率 と生存率の濃度依利 生を示 してい る.これ らの図は4NQOに よ り規傷 を受けた時

276 農 学 研 究

0nU00nU

O

Jn

(2:)a

一

01 0.1 1

Conc. of Cd (m g/1)

AOY1 こAOY2

･‑AOY3

‑ ‑ ‑‑*‑AOY4

‑ *AOYS

*AOY11 10 ^{一 一}o AOY12 一･十AOY13 Fig‑7･Survivalcurveofyeas亡exposedtoCd

〇･001 0.01 0.1

conc,of4NQO (m g/)

Fig･8IChangeintheinhibitLOnrateOfRGRfor4NQO

1,0

のDNA修復機能の強 さが次の ように株 によって異なることを示 している,

AOYl (野生株)>AOY2(切 り出 し修復機能欠場株)>AOY3 (突然変異修復機能欠 根株)>AOY4(組換 え修復機能欠根株).AOY9(組換 え修復機能保有株)>AOY12(突 然変異修復機能保有株)>AOYll(切 り出 し修復機能保有株)>AOY13(全ての修復機能欠 損株)

一般的に言 うと, 3つの修復機能 を有す るAOYlはDNAの修復 に関 Lて他の どの突 然変異株 よ りも強い修復機能 を有 している.また3つ とも修復機能 を欠祖 しているAOY13 株は4NQOに対 して碇 も感受性が強 く,1つの修復機能 を欠損す る株 よ り,2つの修復機 能を有す る株の方が感受性が強い と言える.そ して3つのDNA修複機能の中で,4NQO で損傷 を受けた酵母の修復機能の順序は,切 り出 し修復 >突然変異修復 >組換 え修復 とな

62巷 (1991) 277

nUnUnUnUnUnU2∩UOU(LUJ｢2

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とf4NQ｡

( 七 g/ 1 )

‑ I ‑I

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01 0.1

1

Conc.ofCd ( mg/ 1 )

Fig10.ChangeintheinhibltionrateofRGRForCd.StrainCA15wasproduced by5timesbackcrossLngAOY4withAOYl.

った. しか しカ ドミウムに関 しては4NQOの場合の よ うなuJl確 なDNA修復能の順序 は 得 られ なかった.前述の よ うに, この理 由の 1つは実験 に用 いた株は同質遺伝子株 でない ことに よるものてあろ う.又,4NQOは有機化学物質で.カ ドミウムは重金属 であ り,酵 母に対す る蕃性作用機構が異なるこ とが考 え られ る.DNAに対す る損傷 に加 えて,様々 な 生化学的作刷に よる細胞磁性の ために細胞増殖が抑制 されたため とも考えることができる.

もし,対照群 (野生株) と実験に供試 した突然変 異株 とにおいて生化学的 な傷害が同 じで あると仮定で きるなら,それ らの株の冊での増殖の差異は化学物質によって誘起 されたDNA 蛸掛 二起 因す るもの であ ると言える. この ような考え方の下 で酵母の変異株 を遺伝遵性評 価に用 いるためには,これ らの株 がisogenicであることが望 ましい.そこで突然変異株(AOY

278 _{怨 ･半 研 究}

(2i)

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一､ ‑‑*

0.01 ^CLl

Conc.of4NQO ( mg/1 )

Fig lL ChangeintheinhibitionrateofRGRforCd

4) と野生株 (AOYl)とを戻 し交雑 を5回繰 り返 し,isogenic株 (CA15)を作 出 した.

5回の戻 し交雑 によ り,確率的には2つの株の遺伝子は1/32の確率 の相 異があ るだけ で, 遺伝学的には isogenicであ ると見 なせ る.Figs.10,11は カ ドミウム と4NQOとをそれ ぞれ培地に添加 した時の野生味 と元の変異株 と交雑 後の3種 の株 の増殖阻害率 を示 してい る.高波度 での カ ドミウム区 を除いて,変異株の増殖阻晋率 は野生株 の それ よ り高か った.

しか しカ ドミウムは4NQOに対 してAOY4株 とCA15株 とは感受性の強 さが逆になった.

現段階 ではこの正確 な理 由は明 らかでは ないが,カ ドミウム と4NQOの遺伝毒性の機構が 異 なるために増殖に異 なる影響 を与 えた もの と考 え られ る,

摘 要

酵母のDNA修復機能欠根株 の増殖阻害は非変 異原物質 であ るKanamycinでは観測 さ れなか ったが,変異原物賓 であ る4NQOでは観測 された.カ ドミウムは4NQOと程度の 差はあ るか,増殖阻害がみ られ,変 異原物質 であると考 え られ る.これ らの結果か ら,DNA 修復機 能 を欠損 した酵母 の変異株 はisogenicな野生株 と並行 して使用す るこ とに よ り,環 境変異原検 出系の供 試生物にな り得 る可能性が兄い出 された.これ らの システムのDNA修 復機能の強 さは,4NQOに対 して,組換 え修復能 >突然変異修復 能 >切 り出 し修復能の順 であ った.カ ドミウムに対 す る順序 と4NQOの順序 とは同 じでなか った.これ らの化学物 質は異なる遺伝毒性作用 を持 っているため と思われ る. しか し,本研究 で用 いた変異株 は もともとisogenlCでなか った と考 え られ るので,今後 isogenic株 を作 出 し, これ らの結 果の追試 と確認 を行 って行 くこ とが必要 であ る.そ して辞母 のisogenic株 を用 いるこ とに よって,炎核微生物 を用いた環境変異原性試験が容易 に行 えるよ うに なると考 える, さら に3櫨のDNA修復系 と化学物質 の物理 ･化学的特性 との関係 が遺伝毒性試験法の 立場 か

ら説明で きるよ うになるであろ うと思われ る.

62巻 (1991) 279

参 考 文 献

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280 _{虚 字 研 究}

Application ofDNA Repair‑DeficientM utantsofYeast S

ac c har omyc e sc er e u l s i ae

GeneticToxicityTesting ofChemicals

lsao AoYAMA

Summary

ThepossibilitytodetectDNA damagingsubstnceswasinvestigatedusingDNA repair‑deficientmutantsofa eukaryoticmicrooranism,the yeastSaccjwromyces cereuisiae.TherearethreekindsofindependentDNA repairsystemsforyeast, excisionrepair(RAD2),mutationrepair(RAD18)andre‑combinationrepair(RAD52).

Intheexperiments,mutantswhicharedeficientinone,twooralltherepairsystems wereusedandcomparedfortoxicsensitivitytochemicals.Chemicalsusedforexperi･ mentswereCadmium (Cd)and4‑Nitroquinolinel10xide(4NQO)whichisknownasa carcinogenicsubstance.Yeastcel一swereincubatedat30℃ Withoutshakingusinga BIOSCREEN Csystem (producedbyLabsystems).Relativegrowthrateandsurvival ratewerecalculatedtoanalyzethedata.Thesensitivityto4NQOobtainedfromEC50 Valuesoftheinhibition rate forre一ativegrowth rateWasin theorderofradl rad18rad52,radlrad52,rad18rad52,radlrad18.radl,rad52,andwildtype.Themutant thatisdeficientinallDNArepairsystemswasthemostsensitivewithrefencetothe inhibitionofce日growthandthewildtypewastheleast.Thisphenomenonshowsthat 4NQOdamagedDNAandtheintensityoftheeffectwasdependentontheDNArepair systems.

62巻 (1991) 281