<4D F736F F F696E74202D2096F28A E58A E A94928D95205B8CDD8AB B83685D>

カラム充填剤を使用しない

液体クロマトグラフィー

平成２１年４月１７日（金）

1

東京薬科大学 薬学部

医療薬物薬学科

薬物生体分析学

渋沢庸一

従来の液体クロマトグラフ法

z

固体カラム充填剤を使用

z

カラムの大部分は固定相支持体

2

ラ

大部分

固定相支持体

z

固定相が非常に少ない

z

カラムへの非可逆的吸着・損失が多い

z

吸着による活性の低下

向流クロマトグラフィー

（

C

ounter

C

urrent

C

hromatography）

z

固体の充填剤を全く使用しない

z

細い中空のコイル状チューブをカラムに使用

3

z

細い中空のコイル状チュ ブをカラムに使用

z

多量の液体を固定相として使用できる

z

カラムへの非可逆的吸着・損失がない

z

吸着による活性の低下が起こらない

高速向流クロマトグラフィー

HSCCC

有機溶媒層

移動相または固定相

固定相または移動相

水層

4

固定相が液体

自在に制御できる

固定相の極性や溶媒組成

カラム中の固定相／移動相体積比

コイルの巻き⽅

A. Multilayer （多重層型）

偏心型）

A

B

5

B. Eccentric (偏心型）

C. Toroidal （ドーナツ型）

C

J 型向流クロマトグラフ

固定相液体の保持と, 二相の動的な攪拌効果

カラム： 1. 0 mm I.D. × 50 m PTFE チューブ

6 公転軸 自転軸 P

・遠心力とスクリュー効果

・連続的な撹拌, 分離

_{(1000 rpm)}

Inlet

Outlet

高速向流クロマトグラフィーによる

茶カテキン単量体及び重合体の

分離分析

7

分離分析

茶成分の分離分析法

分離手法

茶の主要成分

キサンチン

誘導体類

カテキン

単量体類

テアフラビン

類

酸化重合体

8

誘導体類

単量体類

類

酸化重合体

逆相 HPLC

○

○

○

×

ｷｬﾋﾟﾗﾘｰ電気泳動

○

○

○

×

ｻｲｽﾞ排除 HPLC

△

△

△

△

HSCCC 分析条件

Type-J Coil-planet Centrifuge L-7100 Pump L-7455 Diode-Array Detector PTFE tubing coil:

1 mmID×2 mmOD×50 m, Column volume: 40 mL 9 二相系： (t-BME:CH3CN:0.1% TFA = 2:2:3) 他 固定相 移動相 回転 流速（mL/min） 順相モード分離 下層 （aqueous LP） 上層 （organic UP） 1000 rpm （CCW） 2.0 逆相モード分離 上層 （organic UP） 下層 （aqueous LP） 1000 rpm （CW） 1.0 Pump waste UPLP

HSCCC分析システム

順相モード

水層 有機溶媒層 Pump Diode-Array Detector 廃液

J-CPC

1) 固定相をカラムに充填 10 Pump Diode-Array Detector 廃液 J-CPC 2) カラム回転 (1000 rpm) ＋移動相の送液 (1 - 8 mL/min)

3) 試料の注入

固定相保持率 (%) 固定相体積 カラム体積 ×100

発酵の度合いによる茶葉の成分比較

不発酵茶

(緑茶)

半発酵茶

(ウーロン茶)

発酵茶

(紅茶)

発酵度 15 ~ 70% 80% > 0%

○ 茶葉抽出法

茶葉100 mg を CH3CN : 0.1% TFA (2:3) で 抽出 抽出液100 μl に BME 40 μl 添加 11

二相溶媒系：BME-CH

3

CN-0.1% TFA= (2:2:3)

○ 茶葉試料の

_{HSCCC 分析条件}

BME 40 μl 添加

カラム：

50 m×1.0 mm I.D. (40 ml)

固定相： 下層

移動相： 上層 → 下層

流速：

2 ml/min

高速向流クロマトグラフの惑星運動1

12

茶抽出液の順相

_{HSCCC クロマトグラム}

固定相液体

(LP)

ECg EGCg EC EGC CAF

TFs

230 nm 280 nm

TRs

ウーロン茶

緑茶

orbance

半発酵

不発酵

13 0 20 40 60

Retention time (min)

TFs

TRs

紅茶

Ab so

発酵

LC

分離モードの改良と発展： 三相溶媒系

HSCCC

高速向流クロマトグラフィー（HSCCC） 互いに混ざり合わない二相溶媒系の一方の相を固定相， 他方の相を移動相とする液々分配クロマトグラフィー 14 14 上相（有機溶媒層） 下相（水相） 上相が固定相なら「逆相分配」 下相が固定相なら「順相分配」 二相溶媒ではなく 三相溶媒では 何ができるのか？

upper phase (

UP

)

Intermedieate phase (

IP

)

Hex-rich

n-Hexane - MeOAc – CH3CN – water混合溶媒系は 混ざり合わない三相を形成する 15 15

lower phase (

LP

)

Hex:MeOAc:ACN:water (1:1:1:1)

Aqueous

固定相溶媒:

IP

+

LP

移動相（ステップワイズで切替・溶出）:

UP

IP

LP

for HSCCC 1 2 3 ₆ 7 8 UP IP LP O O H OH O H O O OH O O O H O C H3 N H O OH O O O H OHO OH OH OH O OH OH OH OH O H O O H OH OH OH OH O O OH O O H OH OH OH OH O OH OH OH OH OH O H O O H OHO OH OH OGluRha N H OH

疎水性・極性の異なる15種類の標準試料の一斉分離

16 16 0 10 20 30 40 50 60 70

Retention Time (min)

ELSD Inte ns ity (m V) 4 5 8 9 10 11 12 13 14 15 COOH O OH OH O O H OHO OH OH OGlu N H2 O OH UP MP LP Phellodendron Bark Coptis Rhizoma ELSD 365 nm 254 nm 17 17 CHO 0 10 20 30 40 50 60 70 (min) CHO CH3O Cinnamon Bark Fennel 254 nm A B C D E F G H I J K L MN

Three-phase HSCCC fractionation profile & TLC profiles of the fractions

A B C D E F G H G H I J K L M N CHCl3 : MeOH

(20:1) (10:1)

Solvent system: n-Hexane-MeOAc-CH3CN-water (4:4:3:4)

UP mobile MP mobile LP mobile phase

18 18

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Retention time (min)

A 450nm A 400nm A 320nm A 280nm ELSD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fr. No. 10 20 30 40 50 60 70

三相溶媒系は・・・

ヘキサン可溶の

脂溶性物質から

水溶性極性物質までを一度に溶解

できる

三相溶媒系を用いる

HSCCC

では・・・

・可溶化した物質を疎水性の大きさ順に粗分離できる

19 19

可溶化した物質を疎水性の大きさ順に粗分離できる

→

試料成分の（質的・量的）疎水性分布

が判る

・分離の間の吸着ロスが全くない（回収率100%）

・どんなに汚い試料でもカラムは劣化しない

→ 試料

前処理がいらない

→

天然物や生体試料の直接注入と分離

が可能

向流クロマトグラフィーによる大腸菌破砕液中の

MBP融合Hst2pの精製

20

一般的なタンパク質分離精製法

沈殿法

・塩析

・有機溶媒沈殿

・pH処理

・アフィニティー

・イオン交換

・ゲル浸透

疎水性

カラムクロマトグラフィー

21

水性二相分配法

・疎水性

・順相

・吸着

向流クロマトグラフィー

・向流分配法

・バッチ抽出法

・逆相

（

Countercurrent chromatography; CCC

）

<Sir2p

の

NAD

依存性ヒストン脱アセチル化活性

>

Hst2p : Sir2pのパラログであるHstファミリーの1つ

CCCによる大腸菌破砕液からのHst2pの精製

Ac

アセチル化ヒストンH3またはH4

22

Sir2p

（クロマチンの

不活性化）

ニコチンアミド

＋

アセチルADPリボース

NAD

アセチル化ヒストンH3またはH4

脱アセチル化ヒストン

Amylose-resin カラムによるMBP融合Hst2pの

アフィニティークロマトグラフィー

①

at

2

80

nm

①

②

MBP-Hst2p 23

Retention time (min)

A

b

sorbance

50

100

150

200

②

CCCによるタンパク質分離用の新規の

水性二相溶媒系の探索

一般的な

水性二相溶媒

①

PEG 1000-リン酸カリウム (KPi) 緩衝液系

②

PEG 8000-dextran T500系

PEG-rich

①

タンパク質

24

PEG rich

KPi buffer-rich

塩析

②

PEG 8000-rich

dextran T500-rich

（Mw 500,000）

タンパク質

dextran除去

_失活，

クロマトグラフィー

回収率の低下

PEG

dextran

混和

_上層

_{(PEG i h)}

1. PEG (Mw 1000~8000)-dextran

T10 (Mw 10,000）

系

2. PEG (Mw 1000~8000)-dextran

T40 (Mw 40,000)

系

水性二相溶媒の調製方法

25

混和

静置

上層

(PEG-rich)

下層

(dextran-rich)

リン酸カリウム緩衝液

・上層と下層の体積比

・上層と下層の動粘度

測定

二相溶媒系 体積比 動粘度 （mm2/s） 17.5%PEG1000-20%dextran T10 15%PEG1540-17.5%dextran T10 12.5%PEG2000-15%dextran T10 12.5%PEG3350-15%dextran T10 12.5%PEG4000-15%dextran T10 1.6 1.7 1.7 1.7 1.7 6.8 7.9 6.3 6.8 7.9 33 35 40 Not determined Not determined

低分子量PEG-dextran系水性二相溶媒

上層 下層 (上層/下層) 26 12.5%PEG4000 15%dextran T10 10%PEG8000-12.5%dextran T10 15%PEG1000-15%dextran T40 10%PEG1540-15%dextran T40 10%PEG2000-15%dextran T40 7.5%PEG3350-10%dextran T40 7.5%PEG4000-10%dextran T40 5%PEG8000-12.5%dextran T40 1.7 1.9 1.6 0.9 1.1 1.1 1.3 1.0 7.9 12.0 4.4 4.5 4.7 5.5 5.0 6.7 33 18 20 22 24 Not determined Not determined Not determined

dextran T40は限外ろ過膜を通過する

①

10% dextran T40溶液

③ ろ液

限外ろ過膜

② 膜上の残留溶液

H2O

限外ろ過

希釈 （×11）

（限外分子量

30,000

）

27 旋光度測定法によるdextran T40の定量 （日本薬局方 第14改正） 旋光度 （αD） +17.4 +1.1 +14.7 濃度(g/100mL) 14.8 1.0 12.4 ①10% dextran T40溶液 ② 膜上の残留溶液 ③ ろ液

①

10% dextran T40溶液

③ ろ液

CCC用試料の調製

組換え大腸菌

大量培養

菌体破砕

上清 （

lysate）

3500×g，20min 25000×g，5min Mw

上清

28 200 kDa 116 k 97 k 66 k 45 k 31 k Hst2p MBP Mw

清

分配係数測定

PEG-rich d t i h

lysate

（大腸菌破砕液の可溶性画分）

MBP融合Hst2p （アフィニティークロマトグラフィー に

よる精製画分）

29

K

lysate

=

上層の吸光度（280 nm） 下層の吸光度（280 nm） dextran-rich 上層の吸光度（280 nm）

K

MBP-Hst2p

=

下層の吸光度（280 nm）

撹拌

静置

7% PEG 3350-10% dextran T40 -10 mM

リン酸カリウム緩衝液系における分配係数

0 4

0.8

0.6

o

e

ffic

ie

n

t (K)

lysate

30

pH

10

9

0.4

0.2

0

6

7

8

5

Partitio

n

co

MBP-Hst2p

交差軸型向流クロマトグラフ

自転

カラムホルダー

ポンプ

検出器

31

公転

二相溶媒系：7% PEG 3350-10% dextran T10-10 mM KPi (pH 9.0) 固定相

交差軸型向流クロマトグラフ

検出器

ポンプ

32 移動相

大腸菌破砕液中の Ｈｓｔ２ｐ の

CCC 分離

a t 280 nm 4 3

3

97 k 200 kDa 116 k MBP-Hst2p

2

1

3

33 Fraction number A b sor b ance a 2 1 0 0 40 50 60 70

1

2

66 k 45 k 31 k Hst2p MBP 30

10% SDS-PAGE

NAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素活性測定

Hst2p

アセチル化ペ

_プチド

0 min I.S.

アセチル化ペプチド

34

NAD

incubation at 37℃，20 min

reverse-phase HPLC analysis

脱アセチル化物

20 min 5 retention time (min)

１．タンパク質を塩析させることなく，ＣＣＣ精製後限外ろ過で

容易にタンパク質画分から除去できる比較的低分子量

のPEG-dextranの水性二相溶媒を見つけることができた．

35

２．大腸菌破砕液中のMBP融合Hst2pは， PEG3350-dextran

T40の二相溶媒を用いたCCCにより，融合タンパク質が

切断を受け，Hst2p単独で，活性を保持したまま一段階で

精製することができた．