令和元年度（平成31年度）学内研究助成金研究報告書

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(1)令和元年度（平成 31 年度）学内研究助成金研究報告書. 研. 究. 種. ☑奨励研究助成金. □研究成果刊行助成金. □21 世紀研究開発奨励金（共同研究助成金）. □21 世紀教育開発奨励金（教育推進研究助成金）. 目. 研究課題名. 機能性アクリルアミドゲルと高機能化マイクロチップを用いる糖鎖高速高感度分析システム法の開発. 研究者所属・氏名. 研究代表者：薬学部・山本佐知雄共同研究者：. １．研究目的･内容抗体医薬品をはじめとする様々なバイオ医薬品において、その製造工程における品質不良を早期の段階で発見できるシステムが望まれている。このようなシステムでは迅速解析が必須であり、この点でマイクロチップ電気泳動は有望であるが定量性や検出感度に問題がある。申請者はマイクロチップの流路の一部に光硬化性アクリルアミドゲル層を作製する技術を開発しており、マイクロチップの欠点であった感度・定量性の問題を解決している。本研究では、バイオ医薬品の品質管理や臨床現場でも使用することが可能なマイクロチップ分析システムの開発を目的とし、実験を行った。特に迅速自動解析の達成のため、濃縮、特異的抽出および粗分画、標識化などの一連の分析操作をチップ上に集約させるため、これらの前処理操作を電圧印加のみで達成できるシステムを構築した。. ２．研究経過及び成果機能性アクリルアミドゲルと高機能化マイクロチップを用いる糖鎖高速高感度分析システム法の開発を目的としてオンライン酵素消化マイクロチップ電気泳動法の開発、フォトリソグラフィーフリーのマイクロチップの作製とタンパク質の分子量に応じた特異的濃縮を目的に実験を行った。酵素含有アクリルアミドゲルには、アクリルアミド、ビスアクリルアミドとともに N 結合型糖鎖切断酵素である PNGase F、重合開始剤とし 2、2-azobis(2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamide)を用いた．このゲル溶液をマイクロチップに導入し、卓上サイズの LED 光源を流路の一部にピンポイントで照射することで、照射部位のみに PNGase F 含有アクリルアミドゲルを作製した．当初の予定では、この酵素含有ゲルに向かって電圧を印加し、試料がゲルを通過したのち、逆向きに電圧を切り替えることを繰り返し実施することで酵素消化を達成できると考たが、酵素消化は達成されているものの、その反応効率は、ばらつきが大きかった。現在、この電圧印加プログラムの再現性を向上させるための実験を実施している。ところで、この研究を進める過程においてアクリルアミドゲルによる酵素消化の有用性については十分に評価できたことから本法の応用として、この PNGase F 含有ゲルを市販のピペットチップ内に封入し、酵素消化を試みた。その結果、通常のマイクロチューブで行うよう手法で 2 日かかっていた工程を 20 分に短縮することが出来た。また、その糖鎖の回収量は既存の方法と比較しても、ほぼ定量的に酵素消化が起こっていることを示唆していた。本研究は既に論文化しており掲載済みとなっている（S. Yamamoto et. al., J. Pharm. Biomed. Anal. 179 (2020) 112995）。ところで生体成分の分析や臨床診断にマイクロチップを使用することを考えると、血液などの試料溶液から目的とする成分を特異的に抽出し、さらに濃縮、分離検出などの分析に必要な操作を流路の中ですべて達成できるようなシステムが必要と考えられる。一般的にマイクロチップの作製はフォトリソグラフィー技術が用いられるが、生体成分の解析を達成できるマイクロチップを作製するには非常に精巧な手技と設備を要する。そこでフォトリソグラフィー技術を必要としない鋳型の作製と、その鋳型を用いたマイクロチップを作製し、さらに直行する 2 つの流路の間に透析膜を配置したサイズ排除型 3 次元マイクロチップを用いてタンパク質の特異的オンライン濃.

(2) 縮を試みた。フォトリソグラフィーフリーのマイクロチップを作製するにあたり、基材には poly(dimethylsiloxane) (PDMS)を使用した。まず、市販のプラスチック容器にマイクロチップの流路長に応じて穴を開け、容器の裏を密閉する。その容器に PDMS 溶液を流し込み、80℃のオーブンで加熱し PDMS を硬化させた。その後 PDMS を通過させるようにナイロンモノフィラメント縫合糸を穴から通すことにより、流路系を構築した。その後ナイロンモノフィラメントをバリヤコートでコーティングし、鋳型とした。次に鋳型を覆うように PDMS 溶液を流し込み、80℃のオーブンで約 30 分加熱した。凹面となった流路をとりだし、表面をプラズマ処理することにより流路を貼り合わせた。最後に、3 時間、80℃の条件下で加圧することによりマイクロチップを作製した。3 次元型のマイクロチップの作製ではプラズマ処理を行った流路面に対し、その流路が直行する部分に透析膜を配置したのち 3 時間、80℃加熱下で加圧した。作製したフォトリソグラフィーフリーのマイクロチップを用いて、8-aminopyrene-1、3、6-trisulfonate 標識化イソマルトオリゴ糖の電気泳動分離を試みた。その結果、少なくとも単糖から 15 糖までのピークを検出することができ、作製したマイクロチップでも十分に分離・検出が行えることが分かった。続いて 6-8 kD の半透膜を用いた 3 次元マイクロチップを用い、分子量が 80 kD のヒト血清トランスフェリンのオンライン濃縮を試みた。その結果、時間経過とともに流路交差部でタンパク質が濃縮される様子が確認できた。また、導入時間 240 秒における濃縮効率を算出した結果、透析膜を配置しなかった場合と比べ、感度が約 70 倍向上した。また、この方法では過剰試薬を含む標識直後の試料を濃縮することが可能であり、煩雑な過剰試薬の除去作業を必要としないオンライン濃縮法であることが分かった。次に、濃縮した試料の分離を検討したところ、3 分付近に単一のピークが検出された。以上の結果から作製したサイズ排除型 3 次元マイクロチップでは、濃縮と同時に過剰試薬の除去が達成されることが分かった。３．本研究と関連した今後の研究計画糖鎖修飾やタンパク質のリン酸化などの翻訳後修飾を解明しようとする研究が世界中で盛んに行われているが、それぞれの翻訳後修飾がどのタイミングでどのように変化した結果、糖鎖構造やリン酸化状態が変化したという報告はない。これが解明できれば、より詳細ながん化や、がん転移のメカニズムの解明につながるだけでなく治療のターゲット分子を発見できる可能性がある。しかしながら、上述した通り糖鎖解析は測定までに酵素消化、蛍光標識化、試料精製操作が必須であり、実際にある試料から糖鎖を調製し、測定を完了するまでに数日を要してしまう。このように現状では多くの前処理操作と分離分析、あるいは同定手段として質量分析装置などを用いる必要があるため、現行においては特に抗体医薬品の品質管理のようにルーチンでのモニタリングでは早急な改善が求められている。リン酸化反応においても同様であり極めて動的で複雑なリン酸化反応を捉えるために、世界規模で解析が進んでいる質量分析装置を用いたリン酸化プロテオミクス以外にも多角的に、この現象を解明する必要があり、特に何らかの刺激を与えた直後のリン酸化・脱リン酸化を明確に解明する必要がある。今回開発した技術を集約することにより、一連の分析操作が特に困難な糖鎖とリン酸化タンパク質をターゲットとし、アクリルアミドゲル層と3次元型のマイクロチップを用いて細胞を3次元で培養し、そこに何らかの刺激を与えた直後のタンパク質の翻訳後修飾のメカニズムを解明するために、糖鎖およびリン酸化タンパク質の分析までに必要な前処理を含む一連の工程を流路中で、かつプログラムされた電圧印加のみで行うことにより真のハイスループット分析を行うことが可能な方法を開発する。この法が開発されれば、細胞に発現している糖鎖のプロファイリングなどはもちろんのこと、抗体医薬品の生産ラインにおいて免疫原性となる糖鎖の特異的検出などを短時間で簡単に、かつ網羅的に解析することが可能になると考えられ、糖鎖やリン酸化化合物あるいは、この両方を利用した指標とした臨床分析にも広く応用することが可能であると考えられる。.

(3) ４．成果の発表等発. 表. 機. 関. 名. 種類（著書・雑誌･口頭）. 発表年月日(予定を含む). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Chromatography. 雑誌. 2019 年 12 月 17 日. 雑誌. 2019 年 5 月 30 日. BUNSEKI KAGAKU. 雑誌. 2019 年 8 月 28 日. 第 79 回分析化学討論会第 26 回クロマトグラフィーシンポジウム第 32 回バイオメディカル分析科学シンポジウム第 17 回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム（招待講演）日本分析化学会第 68 回年会. 口頭. 2019 年 5 月 18 日. 口頭. 2019 年 6 月 6 日. 口頭. 2019 年 8 月 23 日. 口頭. 2019 年 9 月 3 日. 口頭. 2019 年 9 月 11 日.

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