岡 山 医 誌 (1993) 105, 933∼943
イヌの18分 間完全全脳虚 血後 の血液脳 関門 の
経時 的透 過性 変化 に関す る実験 的研 究
岡 山 大 学 医 学 部 麻 酔 ・蘇 生 学 教 室(指 導:平 川 方 久 教 授) 下 田 豊 (平成5年9月6日 受 稿) Key words:完 全 全 脳 虚 血,血 液 脳 関 門,HRP 緒 言 近 年,脳 虚 血 後 に お い て 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 は 虚 血 再 灌 流 直 後 に 一 過 性 に 亢 進 した の ち 元 に 復 し,48-72時 間 後 に 再 び 亢 進 す る と い う2相 性 の 透 過 性 亢 進 が 生 じ る こ とが 報 告 さ れ る よ う に な っ た1,2).し か し,こ れ らの 報 告 は,不 完 全 脳 虚 血 モ デ ル を 用 い た実 験 結 果 で あ り,完 全 全 脳 虚 血 後 の 報 告 は 少 な い.イ ヌ の 完 全 全 脳 虚 血 後,虚 血 再 灌 流15分 後 の エ バ ン ス ブ ル ー の 血 管 外 漏 出 を認 め た 黒 田 の 報 告3)が あ るが,再 灌 流 後 の 血 液 脳 関 門 の透 過 性 を虚 血 再 灌 流 後 長 期 に わ た り経 時 的 に 電 子 顕 微 鏡 的 に 観 察 した 報 告 は み ら れ な い. そ こ で 本 研 究 で は,臨 床 上 遭 遇 す る機 会 が 多 く,治 療 に 難 渋 す る ヒ トの 心 停 止 蘇 生 後 脳 障 害 の 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 を検 討 す る 目的 で,イ ヌ を用 い て18分 間 完 全 全 脳 虚 血 モデ ル4,5)を作 製 し, horseradish peroxidaseを 指 標 と して 大 脳 皮 質 ・小 脳 ・海 馬 に お け る 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 の 有 無 お よ び 血 管 内 皮 細 胞 の 形 態 を 経 時 的 に 電 子 顕 微 鏡 に て 観 察 し た. 材 料 と 方 法 1. 対 象 お よ び 麻 酔 法 体 重5-10kgの 雑 種 成 犬19頭 を 用 い,非 虚 血 対 照 群(sham群)3頭,虚 血 再 灌 流 群16頭 に 分 け た.さ ら に,虚 血 再 灌 流 群 を虚 血 解 除 か ら脳 組 織 灌 流 固 定 開 始 ま で の 時 間 で30分 群4頭,3 時 間 群3頭,6時 間 群3頭,24時 間 群3頭,48 時 間 群3頭 の5群 に 分 け た.麻 酔 導 入 は,塩 酸 ケ タ ミ ン20mg/kg,硫 酸 ア トロ ピ ン0.05mg/kgの 筋 注 で 行 っ た.双 極 誘 導 の 心 電 図 を装 着 した 後, 左 前 肢 静 脈 に 輸 液 路 を確 保 し,乳 酸 加 リン ゲ ル 液 を5.0ml/kg/hで 投 与 した.パ ン クロニ ウム0.05 mg/kgで 筋 弛 緩 を得 た 後,気 管 内挿 管 を 行 い 人 工 呼 吸 器(IGARASHI Respirator Model B2) に 装 着 し,PaCO2を30-35mmHgに 保 つ よ う に 調 節 呼 吸 を行 っ た.麻 酔 維 持 は ハ ロ タ ン1.5%で 行 い,虚 血 開 始 の20分 前 に 中 止 し た.動 脈 圧 は左 大 腿 動 脈 に挿 入 した8 Fの クー ル ナ ン カ テ ー
テ ル(Cordis社 製)よ り測 定 し,適 時 動 脈 血 ガ
ス分 析 をABL2 (Radio meter社 製)で 行 っ た. 体 温 は 食道 温 を 持 続 モ ニ ター し,36.5-37.5℃ に 維 持 した. 2. 脳 虚 血 作 製 法 お よ び 神 経 機 能 評 価 法 脳 虚 血 作 製 は,上 行 大 動 脈 遮 断 と大 動 脈 ・右 房 ・大 腿 静 脈 間 バ イ パ ス 法(図1)で 行 い,虚 血 時 間 は18分 と し た.虚 血 再 灌 流 群 で は,再 灌 流 直 後 に1.5mEq/kgの 重 曹 を 投 与 し,必 要 に 応 じ て追 加 投 与 した.ま た,パ ン ク ロニ ウ ム0.06 mg/kg/hを 持 続 投 与 し て 人 工 呼 吸 器(Benett MA1)に 装 着 し,40%酸 素 で 調 節 呼 吸 を 行 い PaO2を150-180mmHg, PaCO2を30-35mmHg に 保 っ た. 48時 間 群 に お い て は,再 灌 流24時 間 後 と48時 間 後 にSafarら6)の 神 経 学 的 評 価 法(表1)に 従 っ て,神 経 機 能 評 価 を 行 っ た. 3. horseradish peroxidase (HRP)投 与 法 お よ び 脳 灌 流 固 定 法 5%エ バ ン ス ブ ルー(東 京 化 成 社 製,100mg/ kg)に 溶 解 し たHRP (Sigma社 製type II, 100
図1 上 行 大動 脈 遮 断 と大動 脈 ・右房 ・大 腿 動 脈間 バ イパ ス法(文 献4よ り引用) 下 大静 脈,上 大 静 脈,奇 静 脈 の順 に 血 流 を遮 断 した後,上 行 大 動脈 の 遮 断 と同時 にバ イパ ス 回路 を解 放 し た.上 行 大動 脈 遮 断 中 は.バ イパ ス 回路 で心肺 循 環 を作 製す る こ とで完 全全 脳 虚 血 中 の心機 能 を良 好 に保 持 した.遮 断解 除 は上 大 静 脈,上 行 大動 脈,下 大 静 脈,奇 静 脈 の 順 で行 い,バ イパ ス 回路 の 遮 断は 上行 大 動 脈 の遮 断解 除 と同時 に 行 っ た.な お,white arrowは 上 行 大動 脈 遮 断 中 のバ イパ ス 内血 流方 向 を示 す. 表1 神 経学 的評 価 法(文 献6よ り引用) 意 識状 態,反 射 ・運 動機 能,呼 吸状 態,そ の他 の 項 目で採 点 し,そ れ らの総 合 点 で神 経 機 能 を評 価す る. この評 価 法 で は正 常 が0,重 度 の昏 睡 また は死 亡 が100と な る.
Neurologic Deficit Scoring for Dogs (Safar) 1. Level of Consciousness
Normal=0; clouded=2; delirium=4; stupor=6; coma=8 2. Reflexes and Motor Function
a. Pupil size:normal=0; abnormal mild=2; abnormal severe=4 b. Lid reflex:normal=0; sluggish=2; absent=4
c. Corneal reflex:normal=0; sluggish=2; absent=4 d. Reaction to light:normal=0; sluggish=2; absent=4
e. Response to pain (pinch toes):normal=0; abnormal=2; absent=4 f. Muscle tone:normal=0; abnormal=2; absent=4
g. Paralysis:absent=0; mild=2; severe=4 3. Miscellaneous
a. Swallowing and gagging:normal=0; absent=4 b. Response to noise:normal=0; abnormal=2; absent=4
c. Ability to sit:good=0; poor=2; none=4 d. Ability to stand:good=0; poor=2; none=4
e. Ability to drink:good=0; poor=2; none=4 f. Ataxia:none=0; mild=2; severe=4 4. Respiration
a. Rate:normal=0; abnormal=2; apnea=4
b. Pattern:normal=0; abnormal (gasping, irregular)=4 c. Tracheal reflex:present=0; absent=4
完 全全 脳虚 血 後 の血液 脳 関 門の経 時的透 過性 変化
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mg/kg)を,灌 流 固 定 開 始15分 前 に2.5ml/minの 速 度 で,右 大 腿 動 脈 よ り投 与 した.再 灌 流24時 間 以 内 の 群 で は1.5%ハ ロ タ ン麻 酔 下 で,ま た 再 灌 流48時 間 の群 で は 虚 血 作 製 時 と 同 様 の 麻 酔 導 入 維 持 で 以 下 の 手 術 操 作 を行 っ た .腹 部 正 中 切 開 を行 い,18Fの 送 液 カ ニ ュ ー レ(泉 工 医 科 製) を腹 部 大 動 脈 よ り約15cm逆 行 性 に 挿 入 して,カ テ ー テ ル 先 端 を胸 部 大 動 脈 部 に 固 定 し た .HRP 投 与 開 始15分 後 に,上 ・下 大 静 脈 を 離 断 し て 自 然 脱 血 を行 い,同 時 に 送 液 カ ニ ュ ー レ よ り人 工 心 肺 用 ポ ンプ(泉 工 医 科 製MERA MPS-15-K) を用 い て 生 理 食 塩 水 を80秒 間 灌 流 し,次 に0.25 %グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド含 有 中性 緩 衝 ホ ル マ リ ン液(ホ ル ム ア ル デ ヒ ド含 有4%,pH 7 .4)で80 秒 間 灌 流 固 定 し た.な お ポ ン プ 流 量 は1.8-2.0 l/minと し,上 行 大 動 脈 圧 ま た は右 鎖 骨 下 動 脈 圧 を持 続 モ ニ ター し,灌 流 圧 が80-100mmHgと な る よ う調 節 した. 4. 組 織 学 的 評 価 法 灌 流 固 定 後,脳 組 織 を慎 重 に 取 り出 し た.試 料 採 取 部 位 は 大 脳 皮 質 ・小 脳 ・海 馬 と し,エ バ ン ス ブ ル ー 漏 出 が 肉 眼 的 に 認 め ら れ る もの で は 漏 出 部 位 よ り,エ バ ン ス ブ ル ー 漏 出 が 肉 眼 的 に 認 め ら れ な い もの で は 帯 状 回 ・小 脳 虫 部 ・背 側 海 馬 よ りマ イ ク ロ ス ラ イ サ ー(DSK社 製DK-300W)を 用 い て 厚 さ50μmの 試 料 を 作 製 し た.た だ ち に0.1Mカ コ ジ ル 酸 緩 衝 液 ・3%グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド ・1%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド溶 液 に て4℃ で 浸 潤 固 定 し,2時 間 後 に こ れ ら の 試 料 を0.1Mカ コジ ル酸 緩 衝 液 で2時 間4℃ で 洗 浄 した.そ の 後,Graham and Karnovskyの 方 法7) に 基 づ き,0.05Mト リ ス緩 衝 液(pH 7.6)・0.05 % diaminobenzidine tetrahydrochloride溶 液 に15分 間 浸 潤 し,続 い て 同 液 に0.01% H202を 加 え た 溶 液 に30分 間 室 温 で 浸 潤 した.冷 蒸 留 水 で3回 水 洗 し た の ち,1時 間2%四 酸 化 オ ス ミ ウ ム 液 で 後 固 定 を行 っ た.ア ル コー ル に よ る 脱 水 を 行 っ た の ち,プ ロ ピ レ ン オ キサ イ ドに 置 換 しエ ポ ン812に 包 埋 し た.超 薄 切 片 を 作 製 し,酢 酸 ウ ラ ニ ー ル と クエ ン酸 鉛 に よ る二 重 染 色 を行 い,電 子 顕 微 鏡(日 本 電 子 製JEM-2000EX)に て 直 接 倍 率4,000-25,000倍 で 観 察 した. 結 果 1. 実 験 犬 の 反 応 性 充 血 期 の 平 均 動 脈 圧 の最 高 値,HRP投 与 時 の 平 均 動 脈 圧,HRPの 血 管 外 漏 出 の 有 無 ・そ の 部 位 実 験 犬 の 血 糖 値,ヘ マ トク リ ッ ト値,ヘ モ グ ロ ビ ン値 は,そ れ ぞ れ115±7 .7mg/dl,34±1.3 %,11.0±0.3g/dl(平 均 値 ± 標 準 誤 差)で あ っ た. 表2 実 験 犬 の反 応 性 充 血 期 の 最 高 平 均 動 脈 圧, HRP投 与 時 の 平均 動 脈圧,HRPの 血管 外 漏 出 の有 無 ・そ の部 位 Hyperemia:反 応 性 充 血期 の 最 高平 均 動 脈圧 HRP-mAP:HRP投 与 時 の平 均 動脈 圧 再 灌 流 後15分 以 内 の 平 均 動 脈 圧 の 最 高 値 は, 30分 群190±13.4mmHg,3時 間 群181±11.6mm
Hg,6時 間 群213±15 .8mmHg,24時 間 群199± 7.1mmHg,48時 間 群209±16 .9mmHg(平 均 値 ±標 準 誤 差)で あ っ た.HRP投 与 時 の 平 均 動 脈 圧 は, sham群117±3.4mmHg,30分 群125±6 .8mmHg, 3時 間 群115±1.9mmHg,6時 間 群125±1 .7mm Hg,24時 間 群114±1 .0,48時 間 群101±2.4mmHg (平均 値 ± 標 準 誤 差)で あ っ た.HRP血 管 外 漏 出 は,30分 群 の1例 の 小 脳 と48時 間群 の全 例 の 大 脳 皮 質 に お い て 認 め られ た .(表2) 2. 神 経 学 的 評 価 Safarら の 神 経 学 的 評 価 法 に 従 っ て 採 点 し た 再 灌 流24時 間 お よ び48時 間 後 の ス コア は そ れ ぞ れ50±1.15,44.7±1 .76(平 均 値 ± 標 準 誤 差) で あ っ た.神 経 学 的 に は,全 例 と も疼 痛 刺 激 お よ び 音 刺 激 の み に 反 応 が み られ る典 型 的 植 物 状 態 で あ っ た.四 肢 は 過 緊 張 状 態 で,横 た わ っ た ま ま走 る よ う な 動 作 が 頻 回 に み ら れ た.(表3) 3. 組 織 学 的 評 価 1) 非 虚 血 対 照 群(図2 A) 全 例 でHRPの 血 管 外 漏 出 は 認 め られ な か っ た.HRPを 含 ん だpinocytotic vesicleが 少 数 観 察 さ れ た が,基 底 膜 へ のHRP集 積 は 認 め ら れ な か っ た.血 管 内 皮 細 胞 に は,核 の 濃 縮 ・ ミ ト コ ン ド リア の 膨 化 ・細 胞 膜 の 破 壊 な どの 形 態 学 的 変 化 は 認 め られ な か っ た. 2) 30分 群(図2 B, C, D) 4例 中1例 の 小 脳 に お い てHRPの 血 管 外 漏 出 が 認 め られ た.HRPを 含 ん だpinocytotic vesicleの 数 は,非 虚 血 対 照 群 よ り増 加 して いた . ま た 基 底 膜 に はHRPが 集 積 して い るの が 観 察 さ れ た.血 管 内 皮 細 胞 の 核 の 濃 縮 ・ ミ ト コ ン ド リア の 膨 化 ・細 胞 膜 の 破 壊 な ど の 形 態 学 的 変 化 は 認 め られ な か っ た. 表3 48時 間群 の24時 間,48時 間 後の 神 経学 的 評 価 図2 A 非 虚 血 対 照 群 の 小 脳 の 毛 細 血 管 .HRPの 血 管 外 漏 出 は 認 め ら れ な い が,HRPを 含 ん だ pinocytotic vesicleが 少 数 認 め ら れ る.(× 5,000) 図2 B 30分 群 の小 脳 の毛 細 血 管.HRPの 血管 外 漏 出 と 基 底 膜 へ の 集 積 が 認 め ら れ る.(× 5,500)
完全 全 脳虚 血 後の 血液 脳関 門 の経 時的透 過性 変化
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図2 C 30分 群 の 小 脳 の 毛 細 血 管.HRPを 含 ん だ pinocytotic vesicleの 増 加 が 認 め ら れ る. (×8,000) 図2 D Cの 拡 大 像.tight junctionに は 異 常 は 認 め ら れ な い.(×21,000) 図2 E 24時 間 群 の 海 馬CA1の 毛 細 血 管.HRPの 血 管 外 漏 出 は 認 め ら れ な い.ま たHRPを 含 ん だpinocytotic vesicleは ほ とん ど 認 め ら れ な い.(×7,000) 図2 F 48分 群 の 大 脳 皮 質 の 毛 細 血 管.HRPの 血 管 外 漏 出 と 基 底 膜 へ の 集 積 が 認 め ら れ る が, HRPを 含 ん だpinocytotic vesicleの 増 加 は 認 め ら れ な い.(×8,000)図2 G Fの 拡 大 像.tight junctionと 考 え ら れ る 間 隙 にHRPが 認 め ら れ,基 底 膜 に 集 積 し たHRPと 連 続 し て い る.ま た 血 管 内 皮 細 胞 形 質 膜 の 膨 化 が 認 め ら れ る.(×26,500) 3) 3時 間群 ・6時 間 群 ・24時間 群(図2 E) 全 例 にHRPの 血 管 外 漏 出 は 認 め られ な か っ た.HRPを 含 ん だpinocytotic vesicleは 少 数 観 察 され た が,基 底 膜 へ のHRPの 集 積 は 認 め られ な か っ た.血 管 内 皮 細 胞 に は,核 の 濃 縮 ・ ミ トコ ン ド リア の 膨 化 ・細 胞 膜 の 破 壊 な どの 形 態 学 的 変 化 は 認 め られ な か っ た. 4) 48時 間群(図2 F, G) 全 例 で 大 脳 皮 質 に お け るHRPの 血 管 外 漏 出 が 認 め ら れ た.tight junctionと 考 え ら れ る間 隙 にHRPが 認 め られ 基 底 膜 に 集 積 したHRPと 連 続 して い る の が 観 察 され た.HRPを 含 ん だ pinocytotic vesicleは 少 数 観 察 され た.大 脳 皮 質 毛 細 血 管 腔 に,血 管 内 皮 細 胞 形 質 膜 が 変 性 ・ 破 壊 した と考 え ら れ る 箇 所 が と きに 観 察 され た が,血 管 内 皮 細 胞 核 の 濃 縮 ・ ミ トコ ン ドリア の 膨 化 は 認 め られ なか っ た. 考 察 血 液 脳 関 門 とい う概 念 は,血 漿 蛋 白 と結 合 す る酸 性 色 素 エ バ ン ス ブ ル ー を 動 物 に 静 注 す る と 多 くの 臓 器 は 青 色 に 染 ま るの に 対 し,脳 で は 染 ま ら な い とい うEhrlichの 観 察 結 果8)や ト リパ ン ブ ル ー を家 兎 に静 注 す る と脳 実 質 は 染 ま らな い の に,脳 実 質 内 に 注 入 す る と脳 は 染 ま る とい う Goldmanの 観 察 結 果9)に端 を 発 して い る.ま た 彼 ら の 観 察 結 果 に 基 づ き 血 液 脳 関 門 とい う用 語 を最 初 に用 いたの は,SternsとGautierで ある10). 一 般 に,最 後 野 ・松 果 体 ・下 垂 体 な ど を 除 く 脳 の 血 管 内 皮 細 胞 では,tight junctionが 存 在 し, pinocytotic transportが 極 め て 少 な く,fenes traeが 欠 如 し て い る こ とか ら,正 常 な状 態 で は 大 分 子 量 の 物 質 の 血 管 外 漏 出 は 起 き な い と さ れ て い る.ま た,血 液 脳 関 門 の 実 態 は,脳 の 血 管 内 皮 細 胞 そ の もの,形 態 学 的 に は 主 と して 血 管 内 皮 細 胞 間 のtight junctionで あ る こ とが 示 さ れ る よ う に な り,主 と し て 大 分 子 量 の 物 質 に 対 す る関 門 の 役 割 を担 う と され る11-14). 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 が 生 じる 病 態 と して は,虚 血1,2,14),高血 圧15,16),癲癇17,18),空気 栓 塞19), cold injury20),紫 外 線 照 射21),水 銀 中 毒22),ビ タ ミンB1欠 乏23),門 脈 ・大 静 脈 短 絡24)な どが 報 告 され て い る.そ の 中 で 脳 虚 血 病 態 に お い て, Westergaardら は,HRPを 指 標 と し て スナ ネ ズ ミの 左 総 頸 動 脈 閉 塞 モ デ ル で 再 灌 流1時 間 後 に は 血 管 内 皮 細 胞 に は ほ と ん ど変 化 が み ら れ な い に もか か わ らず,pinocytosisの 亢 進 に よ り血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 が 惹 起 され る こ と を報 告 し た14).ま たSuzukiら は,ス ナ ネ ズ ミの 前 脳 虚 血 再 灌 流 モ デ ル で,エ バ ン ス ブ ルー とHRPを 指 標 と し て,再 灌 流 直 後 と48時 間 以 降 に 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 を2相 性 に認 め た こ と を報 告 し た1).ま た,Kuroiwaら は ネ コ の 中大 脳 動 脈 閉 塞 再 灌 流 モ デ ル で,エ バ ン スブ ルー とimmuno histochemical peroxidase-antiperoxidase methodを 指 標 と して,再 灌 流 直 後 と72時 間 後 に 2相 性 の 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 を 認 め た こ と を報 告 し て い る2).彼 ら は,虚 血 再 灌 流 直 後 の 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 は,反 応 性 充 血 に よ る pinocytotic transportの 亢 進 の た め で あ る と し て い る.ま た48-72時 間 後 の 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 は,時 期 的 に 遅 発 性 神 経 細 胞 壊 死 が 生 じ る時 期 で あ る こ と,Westergaardら の 研 究 結 果 よ り,虚 血 に よ り障 害 を受 け た 神 経 細 胞 か ら,
完 全全 脳虚 血 後の 血 液脳 関 門の経 時 的透 過性 変 化
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pinocytotic activityを 高 め る物 質 が放 出 され た た め として い る.HRPは 分 子 量40,000,直 径60 A とさ れ11),血 漿 ア ル ブ ミン と結 合 し た状 態 で分 子 量70,000,直 径75 Aの エ バ ン ス ブ ル ー と 同 様, 正 常 で は 血 液 脳 関 門 を 通 過 し が た い と され る. 本 研 究 結 果 で は,再 灌 流30分 後 に は,4例 中 1例 で 小 脳 にHRP血 管 外 漏 出 が 認 め られ,HRP を 含 ん だpinocytotic vesicleの 増 加 が 認 め ら れ た.し か し,血 管 内 皮 細 胞 の 形 態 学 的 変 化 は 認 め ら れ な か っ た.こ の 時 期 は 反 応 性 充 血 期 で あ っ た こ と,ま た 人 為 的 高 血 圧15,16)や癲 癇17,18)によ りpinocytotic transportの 亢 進 が 惹 起 さ れ, 血 液 脳 関 門 の透 過 性 が 亢 進 す る とい う報 告 や, 反 応 性 充 血 を 防 止 す る こ と で再 灌 流 早 期 の 血 液 脳 関 門 の透 過 性 亢 進 を防 止 で き る とした報 告25)か ら も,脳 灌 流 圧 増 加 に よ りpinocytotic tranport が 亢 進 した 結 果,HRPの 血 管 外 漏 出 が 生 じた こ とが 示 唆 さ れ た.本 研 究 に お い て も漏 出 例 で の HRP投 与 時 の 平 均 動 脈 圧 は162mmHgで あ るの に 対 し,非 漏 出 例 で は120,110,109mmHgで あ っ た. ま た,イ ヌ の18分 間 完 全 全 脳 虚 血 モ デ ル に お い て,ス チ レ ン マ レ イ ン酸 ブ チ ル エ ス テ ル ス ー パ ー オ キ シ ドヂ ス ム タ ー ゼ(SMA-SOD ,10mg/kg) で,虚 血 解 除30分 後 の エ バ ン ス ブ ル ー の 血 管 外 漏 出 が 抑 制 さ れ た とす る報 告26)か ら,フ リー ラ ジ カル に よ るpinocytotic tranportの 助 長 が 再 灌 流 直 後 の 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 に 関 与 し て い る可 能 性 も 否 定 で き な い.さ ら に,cyclic AMP, セ ロ トニ ン な ど の 物 質 がpinocytotic transport を増 加 させ る と い う報 告27,28)より,そ れ らの 物 質 が 虚 血 再 灌 流 後 に 増 加 した た め 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 が 亢 進 した 可 能 性 も考 え ら れ る. 本 研 究 で は,再 灌 流30分 後 のHRP血 管 外 漏 出 は 小 脳 に の み 認 め られ,大 脳 皮 質 ・海 馬 に は 認 め られ な か っ た.こ れ は,再 灌 流 早 期 の エ バ ン ス ブ ル ー の 血 液 脳 関 門 の 易 透 過 性 と領 域 別 易 漏 出 性 は,一 般 に 指 摘 さ れ る よ うな 神 経 細 胞 の 虚 血 に 対 す る 脆 弱 性 とは 必 ず し も一 致 し な い と い う黒 田 の 研 究 結 果3)と 一 致 して い た.小 脳 の み にHRP血 管 外 漏 出 が 認 め られ た 原 因 は,小 脳 ・ 脳 幹 に お い て 点 状 出 血 を合 併 す る頻 度 が 高 か っ た こ と よ り,椎 骨 動 脈 優 位 の部 位(テ ン ト下) で は テ ン ト上 の 部 位 よ り虚 血 再 灌 流 直 後 の 灌 流 圧 の 影 響 を受 け 易 い 可 能 性 が 考 え られ た. 3時 間,6時 間,24時 間 後 で はHRPの 血 管 外 漏 出 は 認 め られ な か っ た.こ の 時 期 のHRPを 含 むpinocytotic vesicleは 少 数 で あ り,血 管 内 皮 細 胞 に 形 態 学 的 変 化 は 認 め ら れ な か っ た.こ の 時 期 は 反 応 性 充 血 は 終 わ り,脳 灌 流 圧 が 低 下 し,遅 発 性 脳 血 流 減 少 が 生 じ る時 期 で あ るの で5), pinocytotic transportが 減 少 な い し元 に 復 し た こ とが 考 え ら れ た. 48時 間 後 に,大 脳 皮 質 に お い てHRPの 血 管 外 漏 出 を 認 め た.HRPがtight junctionと 考 え られ る間 隙 に 認 め られ,基 底 膜 に集 積 したHRP と交 通 し て い た.こ の 間 隙 は,血 管 内 皮 細 胞 と pericyteと の 境 界 で あ る 可 能 性 も完 全 に は 否 定 で き な い が,30分 後 と 異 な りHRPを 含 む pinocytotic vesicleは 少 数 で あ っ た こ とか ら, HRPの 血 管 外 漏 出 は,pinocytotic transportの 亢 進 に よ る も の で は な く,tight junctionの 開 離 に よ り惹 起 さ れ た もの と考 え ら れ た.ま た 血 管 内 皮 細 胞 に お い て 核 や ミ トコ ン ド リア な どの 細 胞 内 小 器 管 に 異 常 は み られ な か っ た が,細 胞 膜 に 変 性 ・破 壊 像 を確 認 した こ と よ り,従 来 虚 血 に 強 い抵 抗 性 を有 す る と され る血 管 内 皮 細 胞 も, 完 全 全 脳 虚 血 後48時 間 に は,虚 血 自体 に よ る侵 襲 ・フ リー ラ ジ カ ル 反 応 ・蛋 白合 成 障 害 ・反 応 性 充 血 に よ る血 管 内 皮 細 胞 のover stretchな ど に よ り器 質 的 障 害 を 受 け る こ とが 示 唆 され た. ま た,小 脳 ・海 馬 で はHRPの 血 管 外 漏 出 は 認 め ら れ な か っ た が,時 間 が さ ら に 経 過 す れ ば 大 脳 皮 質 と 同 様 の 変 化 が 生 じる と考 え られ た. イ ヌの18分 間 完 全 全 脳 虚 血 後 で は,虚 血 再 灌 流30分 後 と48時 間 後 に,2相 性 に 血 液 脳 関 門 透 過 性 亢 進 が 生 じ る こ とが 明 ら か に な っ た.そ の 時 期 は,Suzukiら1)とKuroiwaら2)の 報 告 し た 不 完 全 脳 虚 血 実 験 とほ ぼ 同 じで あ っ た.虚 血 再 灌 流 後30分 後 の 血 液 脳 関 門 の透 過 性 亢 進 の 原 因 は,反 応 性 充 血 に よ るpinocytotic transportの 亢 進 と考 え ら れ,不 完 全 脳 虚 血 実 験 で 考 案 され た 原 因 と 同 じ で あ っ た.3時 間 ・6時 間 ・24時 間 後 で の 血 液 脳 関 門 の 機 能 が復 元 し た 原 因 は, 反 応 性 充 血 は 終 わ り,脳 灌 流 圧 が低 下 し,遅 発 性 脳 血 流 減 少 が 生 じ る 時 期 で あ る の で, pinocytotic transportが 減 少 な い し 元 に 復 し たこ と に よ る と考 え ら れ,不 完 全 脳 虚 血 実 験 で考 案 さ れ た 原 因 と 同 じで あ っ た.し か し,48時 間 後 の 血 液 脳 関 門 の 透 過 性 亢 進 は,不 完 全 脳 虚 血 で は 虚 血 に よ り障 害 を受 け た 主 と し て 神 経 細 胞 か らpinocytotic activityを 高 め る物 質 が 放 出 され た た め 生 じた と し て い るの に 対 し,本 研 究 で は 血 管 内 皮 細 胞 が 器 質 的 障 害 を受 けtight junctionが 開 離 した た め 生 じ た と考 え ら れ 異 な っ て い た.こ れ は,本 研 究 の 方 が 虚 血 侵 襲 が 著 し く大 き い こ と に よ る と考 え られ た. 48時 間 群 の 神 経 学 的 評 価 は,イ ヌ の18分 間 完 全 全 脳 虚 血 後 は 全 例 疼 痛 反 応 お よ び 音 刺 激 の み に 反 応 す る,い わ ゆ る 植 物 状 態 と な る とい う報 告5)と 一 致 し て い た. 臨 床 的 に は 心 停 止 蘇 生 後 の よ うな 完 全 全 脳 虚 血 後 の 治 療 に お い て は,蘇 生 直 後 の 反 応 性 充 血 期 に は,正 常 で は 血 液 脳 関 門透 過 性 の な い 神 経 細 胞 保 護 効 果 を持 つ 薬 物 で も,反 応 性 充 血 に よ り亢 進 し たpinocytotic transportに よ り脳 内 に 移 行 す る 可 能 性 が あ る が,蘇 生 目的 に 使 用 し た薬 物 も同 様 の 経 路 で 脳 内 に移 行 す る た め 予 想 外 の 反 応 が 生 じ る可 能 性 も あ る.し か し,遅 発 性 脳 血 流 減 少 期 に は,血 液 脳 関 門 の 機 能 は復 元 し て い る た め,血 液 脳 関 門 透 過 性 の な い 薬 物 の 治 療 効 果 は 期 待 で き な い.48時 間 以 降 は 血 管 内 皮 細 胞 の 器 質 的 障 害 に よ り,血 液 脳 関 門 の 透 過 性 は 亢 進 して お り,薬 物 の 脳 内 移 行 性 は 期 待 で き るが,す で に神 経 細 胞 障 害 は 完 成 して い る29,30) た め 治 療 効 果 は 期 待 で き な い と考 え ら れ た. 結 論 1. イ ヌ の18分 間 の 完 全 全 脳 虚 血 実 験 に お い て,HRPの 血 管 外 漏 出 は,再 灌 流30分 後 と48時 間 後 に 認 め ら れ,3時 間 ・6時 間 ・24時 間 後 に は 認 め られ な か っ た. 2. 再 灌 流30分 後 で は,反 応 性 充 血 に よ る脳 灌 流 圧 増 加 に よ りpinocytotic transportが 亢 進 した こ と に よ りHRPの 血 管 外 漏 出 が 生 じた と考 え られ た. 3. 再 灌 流3時 間 後 ・6時 間 後 ・24時 間 後 で は,遅 発 性 脳 血 流 減 少 に よ りpinocytotic trans portが 抑 制 さ れ た た めHRPの 血 管 外 漏 出 は生 じ な か っ た と考 え られ た. 4. 再 灌 流48時 間 後 で は,血 管 内 皮 細 胞 が 器 質 的 障 害 を受 け た た めHRPの 血 管 外 漏 出 が 生 じ た と考 え ら れ た. 5. 反 応 性 充 血 期 には,pinocytotic transport が 亢 進 して い る た め,正 常 状 態 で は 血 液 脳 関 門 透 過 性 の な い 薬 物 で も脳 内へ 移 行 す る可 能 性 が あ る. 稿 を終 え るに あた り,ご 指 導,ご 校 閲 を賜 っ た岡 山大学 医学部 麻 酔 ・蘇 生 学教 室 平 川 方久 教 授,小 坂 二 度 見名 誉教 授,ま た,実 験 に ご協 力 いた だ い た橋 本 秀 則博 士 な らびに教 室 員 名位 に心 か ら感謝 いた し ます. 文 献
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完 全 全 脳 虚 血 後 の 血 液 脳 関 門 の 経 時 的 透 過 性 変 化 943
Biphasic opening of the blood-brain
barrier to horseradish peroxidase after
18 minutes of complete global brain ischemia in dogs
Yutaka SHIMODA
Department of Anesthesiology and Resuscitology,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan (Director: Prof. M. Hirakawa)
The ability of horseradish peroxidase (HRP) to cross the blood-brain barrier (BBB) was studied in dogs by electron microscopy after 18 minutes of complete global brain ischemia (CGBI). The first BBB opening occurred 30 minutes after the recirculation was established; This was associated with the increase of HRP-containing pinocytotic vesicles (HRP-PV), but
there was no endothelial cell damage. There was no BBB opening 3, 6, and 24 hours after the recirculation; This was determined by absence of increase in HRP-PV and lack of endothelial cell damage. The second BBB opening occurred 48 hours after the recirculation; This was associated with disruption of the tight junction of the endothelial cell, lack of increased HRP
-PV and destruction of the endothelial cell menbrane . These results suggest that the first BBB opening is due to increased pinocytotic transport by reactive hyperemia and the second BBB opening is due to endothelial cell damage by CGBI itself.
