タンパク質NMRの物理的基礎 : スピン状態の量子論から2次元スペクトル測定法まで

(1)

タンパク質NMRの物理的基礎 : スピン状態の量子論

から2次元スペクトル測定法まで

著者

瀬川新一, 野田康夫

発行年

2018-09

(2)

タンパク質 NMR の物理的基礎

－スピン状態の量子論から 2 次元スペクトル測定法まで－

関西学院大学・理工学部

2018 年 9 月

名誉教授

瀬川新一

教育技術主事

_{野田康夫}

10 10 9 9 8 8 7 7 130 130 125 125 120 120 115 115 110 110 105 105 T19 G38 G128 G181 G95 V43 G7 G157 T155 S113 GX T6 G163 K60 S153 K24 M 161 Y158 V167 _Y111 E190 G28 E53 T114 T55 K49 L204 S162 V104 D62 V145 I200 H125 E201 M 121 L148 M 146 E58 E205 I59 E57 E194 K156 L193 K54 K122 E206 I63 V196 R127 L26E50 I29 D27 V44 R21 A23 A154 A110 L115 M 191 E192 L150 L207 L208 E14/ K123 K119 V83 Y147 H151 D25 _V198 F112 Y132 V51 V202 S77 L124 F164 I133 A48 S134 R39 K160 A34 E99 V36 L56 I120 A195 Q182 E126 K197 K30 Y144 I117 Q35 H166 V3 R80 I129 A203 I31 A75 A107 E20 H66 E79 I165 A64 A82 L4 L41 V5 F37 I65 N93 L52 S149 I76 I22 G179 I178 A199 K97 I98 1_{HN (ppm)} 15 N ( p p m )

(3)

表紙

Pyrrolidone Carboxyl Peptidase

（

PCP

）の1

_H-

15

_N

_HSQC

_{スペクトル}

S. Iimura et al. Biochemistry 46 (2007), 3664-3672.

PCP：Pyrrolidone Carboxyl Peptidaseの関西学院大学理工学部の600 MHz

(4)

序タンパク質 NMR

i) はじめに ⅰ ii) タンパク質の構造とプロトンのスピン網 ⅱ iii) プロトン

NMR

の基礎用語 (1) 化学シフト ⅲ (2) 非選択的 90パルス ⅳ (3) アミノ酸残基のプロトンの標準的化学シフト ⅴ

第Ⅰ章スピン状態の量子論

1.

スピン角運動量ベクトルの古典力学的歳差運動－

Bloch

方程式 1

2. Bloch

方程式の量子論的解釈 2

3.

密度行列



ˆ は系の量子状態を表す演算子 4

4. Liouville – von Neumann

の式 5

5.

回転座標系への変換 7

6.

ラジオ波

( rf )

パルスと回転演算子 9

7.

熱平衡状態におけるスピン系の密度演算子 13

8.

孤立した

1

スピン系の

90

パルス後の自由歳差運動 14

9.

スピン結合する

2

スピン系の量子力学：直積空間 16

10.

スピン間の

J-

結合項を含むハミルトニアン 16

11. 2

スピン系の量子状態



ˆ

を直積演算子の線形結合で表す 18

12. 2

スピン系の自由歳差運動 21

13.

1

量子コヒーレンスの時間発展（

single quantum coherence

） 23

14.

多量子コヒーレンス（

multi-quantum coherence

） 27

15.

コヒーレンス移行と多量子コヒーレンスの生成 28

(5)

17. INEPT

（

Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer

） 32

18. Refocused INEPT

34

第Ⅱ章 2 次元 NMR スペクトル

19. FID

信号の位相検波 36

20. COSY

（

Correlation Spectroscopy

） 38

21. DQF-COSY

（

Double Quantum Filtered COSY

） 42

22. HSQC

（

Hetero Nuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy

） 44

23. TOCSY

（

Total Correlation Spectroscop

y）

(1) 等方的混合パルス（

isotropic mixing pulse

） 48

(2)

2

スピン系における

TOCSY

スペクトル 50

24. NOESY

（

Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

）

(1)

Solomon

の方程式と自発緩和、交差緩和過程 52 (2)

2

次元

NOESY

スペクトル（

2D-NOESY

） 55

第Ⅲ章コヒーレンス選択

25.

コヒーレンス次数 (1) コヒーレンス次数の定義 58 (2) コヒーレンス次数に関する諸性質 59

26. rf

-パルスや受信器の位相を変える (1)

rf

-パルスの位相を変える具体的方法 60 (2) 受信器の位相を変える具体的方法 62 (3)

rf

-パルスや受信器の位相を変えて

FID

データを積算する 62 (4)「位相回し」によるコヒーレンスの選別 63 (5) 複合パルス列に対する「位相回し」 64

27.

コヒーレンス選択の実例 (1)

COSY

における「位相回し」 66

(6)

(2)

DQF-COSY

における「位相回し」 68 (3)

HSQC

における「位相回し」 69 (4)

TOCSY

および

NOESY

における「位相回し」 71

28. t

₁時間展開期における周波数識別法 (1)

t

₁時間展開期における

cos

あるいは

sin

振幅変調信号の生成 73 (2)

States

法（

States-Harborkone-Ruben

法） 74 (3)

TPPI

法（

time-proportional-phase-incrementation

法） 75

29.

磁場勾配パルス（

Field Gradient Pulse

）

(1) 磁場勾配パルス（

FGP）

によるスピンエコー 78 (2) 磁場勾配パルス（

FGP

）による水の信号の消去 79 (3)

FGP

による特定のコヒーレンス移行パス（

CTP

）の選択 80 (4) 異種核

NMR

実験系における

FGP

による

CTP

の選択 81 (5)

FGP

による

CTP

選択の実例 82

第Ⅳ章タンパク質の 2 次元 NMR スペクトルの測定例

30. DQF-COSY

スペクトル 87

31.

1

H-

15

N HSQC

スペクトル 91

32.

プロトン間の

2

次元

NOESY

スペクトル 93

33.

3

次元

HSQC-NOESY-HSQC

スペクトルの測定原理 98

34.

ピーク帰属の実例 101

あとがき

108

(7)

i

序タンパク質 NMR

（ⅰ）はじめに

筆者たちは「タンパク質の折りたたみ反応」を研究してきた。

NMR

分光器を用いてタンパク質の立体構造変化を研究してきたが、我々は決して

NMR

分光学の専門家ではなく、入門書や参考書を頼りにタンパク質の

NMR

分光学的研究を始めた者である。

2

次元

NMR

のスペクトル変化はタンパク質の構造変化を原子レベルの分解能で追跡できる非常に強力な研究手段である。分光器には標準的な測定プログラムが付属していて、コンピュータのアプリケーションを操作するのと同じ感覚で、タンパク質の多次元

NMR

スペクトルを測定することができる。しかし、

NMR

分光器の使用経験があり、スペクトルの測定原理についても一通りの知識がある者でも、どのようにして多次元スペクトルが得られるのかを理解しようとすると障壁は相当高かった。分光器に付属して

いる最も標準的な

DQF-COSY

や

NOESY

、

TOCSY

、

HSQC

などという測定法でも、

スペクトルを得るためには、プロトンのスピンの運動をその位相まで含めて巧妙に仕組まれた方法で操作して測定が行われるからである。また、

NMR

分光学の分野には、特有のアクロニムの略記号や馴染みのない専門用語が多く、それだけで当惑して理解することを妨げられる。

NMR

関連の参考書は入門書から相当専門的な参考書まで多数出版されているが、入門書の場合、測定法の核心部分になると専門家には通じるが初心者には意味のよく分からない簡単な説明で終わることが多かった。厚くて本格的な専門書では丁寧な解説を得ることができても、もとより初心者には荷が重すぎる。そのような経験から筆者たちは、タンパク質の研究によく利用される代表的な測定法に限って、

2

次元スペクトルの表示という最終結果に至るまでの論理を核スピンの運動という基本原理から丁寧にたどって説明する量的にも手頃な入門書が必要だと思った。そのため、解説する対象の範囲を狭く絞って、代わりに常に基本原理に立ち返って考察することを心がけた。本書の目標は、得られた各種の

NMR

スペクトルを併用して、数百を超えるプロトンの共鳴線をタンパク質の特定残基の特定水素原子に帰属する「ピーク帰属」を完成することまでとした。本書を書くに当たって、核磁気モーメントの古典力学的な歳差運動や、量子力学の

(8)

ii

初歩的な知識を持っていることを前提とした。量子力学といっても、電子状態を扱う波動関数とは違い、核スピンの運動は、スピン角運動量の交換関係だけが必要な知識である。スピンの状態変化を記述するには、密度演算子



ˆ の時間変化を

Liouville - von

Neumann

の方程式で追跡する。難しそうに聞こえるが、



ˆ t

 

の変化はスピン角運動量演算子ˆIの回転運動である。回転演算子 iHtˆ

e

 の演算規則を理解すれば、核スピンの「ベクトル模型」と対比しながら直感的な理解が得られる。本書における理論の根幹は、密度演算子



ˆの時間変化が、



ˆ

 

t



e

iHtˆ



 

0 e

iHtˆ と表せるということに尽きる。この式に従って



ˆ 内の各スピン演算子の時間変化をたどっていくと、

DQF-COSY

も

HSQC

も物理的な基本原理に基づいて

2

次元スペクトルの表示に至るまで、すべて理解できる。そう信じて本書を著わした。巨大分子であるタンパク質の

NMR

スペクトルをいとも簡単に測定してくれる各種の測定プログラムが存在して、それらを併用すると、数百を超えるプロトンの共鳴線を特定残基の水素原子に帰属することが可能になる。その「からくり」を知るためには、プロトンのスピンの運動を物理的に理解することが、初心者にとっては遠回りのようで結局一番近道であると考えた。

（ⅱ）タンパク質の構造とプロトンのスピン網

タンパク質は、

20

種類のアミノ酸が連結した鎖状高分子である。ポリペプチドの主鎖に沿って

NH

基や

C



H

が分布し、側鎖には、アミノ酸の種類に応じて、

C



H

2、

C



H

2、あるいは側鎖末端の

CH

3基、芳香環の

CH

、

NH

などが存在している。これらの水素原子のプロトン

NMR

スペクトルはタンパク質の構造変化に敏感で、強力な分光学的研究手段である。特にプロトンはタンパク質全体に網目のように広がっているため、

NMR

スペクトルの各共鳴線を特定残基の水素原子として同定することができれば、水素原子間の距離情報を基にしてタンパク質全体の立体構造を決めることも可能である。

X

線結晶構造解析が水素原子を除く全原子の空間配置からタンパク質の立体構造を決定するのと似た関係にある。そのために最も重要な仕事は、プロトン

NMR

スペクトルのピーク帰属という作業である。

129

残基からなるリゾチームというタンパク質の場合、共鳴周波数が識別されて特定残基に同定されたピークの数は約

660

である。約

6000

Hz

(9)

iii

という狭い周波数範囲にこれだけ多数の共鳴線が密集しているので、多くの共鳴線は重なり合って分離することは不可能であった（図

a

参照）。その壁に穴を開けたのは、

FT-NMR

法の開発とその

2

次元化という偉業である。それが前述の様々な測定プログラムに進化し、さらに13

_C

_や15

_N

_{という同位体の核スピンも交えた異種核多次元}

_NMR

_測定プログラムとなって定着し、独自の

Protein-NMR

という分野として確立してきた。本書の第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ章では、スピン状態を密度演算子



ˆ で表し、

Liouville - von

Neumann

の式に従って、その状態変化を記述するという立場で

NMR

現象を考察する。第Ⅰ章では、スピン演算子の和で表される量子状態



ˆ がハミルトニアン

H

ˆ

の下でどのように時間変化するかという物理的な基本問題を考察する。特に、

in-phase single

quantum coherence

Iˆ_xとか、

anti-phase single quantum coherence

I Sˆ_xˆ_zの時間変化は頻

繁に扱う重要な概念なので、その物理的意味を十分把握できるまで説明する。第Ⅱ章は、タンパク質

NMR

において最もポピュラーな

2

次元

NMR

スペクトル測定法について、基本原理に忠実に詳しく説明する。密度演算子



ˆ はスピン演算子Iˆ_xやI Sˆyˆzなどの和で表されるが、パルス照射によってそれが時間変化するとき、様々なスピンの直積演算子の項が現れてくるので、極めて煩雑な計算が必要になる。しかし、「位相回し」によって不必要な直積演算子を巧みに消去して、非常に簡単な形で



ˆの時間変化を追跡することができる。それが「コヒーレンス選択」という方法である。



ˆ によってスピンの量子状態を記述することが最適の方法である理由はそこにある。従って、第Ⅲ章では「コヒーレンス選択」について詳しく解説する。最後に、第Ⅳ章では、タンパク質の構造解析にとって不可欠の「ピーク帰属」という問題を考察する。これは実例をもって説明するのが最も分かりやすいので、我々が実際に経験してきたタンパク質のデータ解析を具体例として紹介する。その前に、

ppm

単位で表す化学シフト、非選択的90パルス、アミノ酸残基の標準的化学シフトなど、

NMR

分光法の基礎用語を簡単に説明しておく。

（ⅲ）プロトン NMR の基礎用語

(1)

化学シフト静止磁場

B

₀内に存在するプロトンの

Lamor

周波数の大きさは



₀





B

₀（ は磁気

(10)

iv

角運動量比）と表される。これを

Hz

単位の周波数に直すと



₀





₀

2 

である。

B

₀は永久磁石の磁場の大きさであるが、通常はプロトンの共鳴周波数で磁場の大きさを表すので、今は



₀

 600 MHz

の磁場（

B 

₀

14 T

）だとする。タンパク質中のプロトンは、水素原子が属している原子団の種類に応じて局所磁場が僅かに異なる。従って、プロトンの共鳴周波数は



₀とは僅かに異なる様々な値をとって分布している。適当な標準物質

のメチルプロトンの

Larmor

周波数を



_refとして、観測プロトンの

Larmor

周波数



_obs

との差を

ppm

という単位を用いて



と表記する。この値を化学シフトという。





6

x 10

obs ref ref







_









_

タンパク質の場合は、通常





0 ~ 10 ppm

程度の値である。

(2)

非選択的90パルスタンパク質のプロトン

NMR

スペクトルを測定するために、

pulse-FT-NMR

という方法を用いる。単一周波数



₀で振動するラジオ波を矩形状のパルス（時間幅t_p）にして振動磁場

B

₁を発生させると、

Larmor

周波数



₀で歳差運動しているプロトンは振動磁場に完全に共鳴して、パルス幅が



B₁ tp



2を満たすように

B

1を決めると、核スピンは丁度90倒れる（パルス幅は 10 s 程度）。このとき中心周波数



₀から僅かに異なる

Larmor

周波数のプロトンもほぼ90倒れる。その理由を説明しよう。タンパク質中のプロトンの

Larmor

周波数は

600 MHz

近傍で約

10 ppm

の幅をもって分布している。すなわち、中心周波数から

 3000 Hz

の領域に広がっている。ラジオ波の周波数が



₀で単一だったとしても、パルス状の波の場合、不確定性関係から  



t 1となるので、 t  

10 

sのとき、



は

10

5

Hz

の幅を持っている。すなわち、振動磁場をフーリエ変換してその周波数成分を求めると、

600 MHz

を中心として

 10

5

_Hz

_{程度は白色光と同} じ平坦な強度分布を示す。従って、

 3000 Hz

程度の広がりであれば、どのプロトンも同程度の強度の振動磁場を感受してそれに共鳴し90倒れることになる。それゆえ、このようなパルスを非選択的90パルスという。t_pを短くしようと思えば、

B

1を大きくしなければならないので、ラジオ波の強度は当然強くなり、このようなパルスをハードパルスとも呼ぶ。逆に、周波数分布が狭い単一周波数に近いパルスを照射しようと思えば、パルス幅が長くて強度が小さいラジオ波になり、それは選択的90パルスとかソフトパルスと呼ばれる。

(11)

v

(3)

アミノ酸残基のプロトンの標準的化学シフト図

a

は軽水（

H

2

O

）中で測定されたニワトリ・リゾチームのプロトン

NMR

スペクトルを示している。アミノ酸残基中の様々な原子団に属するプロトンの化学シフトの値の範囲が横棒で示されている。



の値からどんな原子団に属する水素原子なのか大まかな判別ができて便利である。例えば、

2

次元の

COSY

スペクトルにおいて、横軸（

F2

軸）の範囲が

7.0 ~ 9.0 ppm

、縦軸（

F1

軸）の範囲が

3.5 ~ 5.5 ppm

であったとすると、それはアミノ酸残基内の主鎖

NH

と

C



H

の交差ピークであると判断できるからである。図a タンパク質の1次元プロトンNMRスペクトル。600 MHzの分光器を用いて129残基のニワトリ・リゾチームを軽水中で測定した。横軸はppm単位で表示した化学シフト 。周波数軸を左向きにとるのがNMRスペクトル表示の習慣。軽水中でタンパク質のプロトン

NMR

スペクトルを測定すると、普通

4.8 ppm

付近に巨大な

H

2

O

のピークが現れて

C



H

領域のスペクトルを観測することは不可能である。溶媒を重水に変えて実験すると、

H

2

O

の邪魔がなくなるので

C



H

領域のスペクトル観測は簡単に行える。しかし、主鎖

NH

（アミドプロトン）が重水素交換反応によって急速に消失するため、

NH

プロトンの測定は困難になる。そこで、図

a

のスペクト (ppm) 0 2 4 6 8 10 12 -2 CH3 C_H C_H CH H2O mainchain NH aromatic CH indole NH



化学シフト

(12)

vi

ルを測定するためには、

WATERGATE

という名前の水消しのための特別なパルスが採用された。この方法の詳細は

29

節で説明するが、磁場勾配パルスの照射という方法によって核スピンの位相を制御し、

H

2

O

のプロトンは横磁化を消失した状態にし、タンパク質のプロトンだけは横磁化の位相を揃えて

NMR

スペクトルが観測できる状態にする。その結果、図

a

では

4.8 ppm

近傍の

H

2

O

の共鳴線がほぼ完全に消失している。

(13)

1 第Ⅰ章スピン状態の量子論

1.

スピン角運動量ベクトルの古典力学的歳差運動－

Bloch

方程式 核スピンの角運動量ベクトルをI と表すと、それに伴う磁気モーメントは

 

 I と表される。ここで



は磁気角運動量比である。静止磁場

B

0が存在する中に磁気モーメントが置かれると、トルク



B0が働くので、角運動量Iの運動方程式は古典力学に従って次式で与えられる。これが核スピンの運動の

Bloch

的描像である。 0 0 d I B I B dt  









(1.1)

0

B

が

z

軸の正方向であることに注意して、x y z, , 成分に分けて微分方程式を解くと、図1 スピン角運動量ベクトルの歳差運動。 0の場合、Iは z 軸の負の向きに歳差運動する。₀  B₀とする。 0 z dI dt  , 0 x y dI B I dt 



, 0 y x dI B I dt  



(1.2)

この解は自転角運動量がIである｢こま｣が、重力によるトルクを受けて行う歳差運動とまったく同一である。I の

z

成分は時間的に一定値をとり、

z

軸とI の間の角度をとすると、I_z I₀cos



（I₀はI の大きさ）である。また、



B₀



₀と表すと、

x

y

z

I

0

t



z

I



0 B

(14)

2 

0



0



0



0

( )

sin

cos

, ( )

sin

x y

I t



I





t I t



I





t

(1.3)

ただし、初期位相を

0

とする。



0の場合、I は

B

0のまわりを

z

軸の負の向きに角速度



₀ で、「こまの芯」のように歳差運動する。これが核スピンの歳差運動である。

2. Bloch

方程式の量子論的解釈核スピンの運動を厳密に取り扱うためには、量子力学的考察を避けることはできない。量子力学の基礎に基づくと、量子状態を波動関数で表し、物理量を表す演算子 ˆA の期待値

A

を求めることによって、その状態における物理量の観測値を知ることができる。量子状態の時間変化は系のエネルギーを表すハミルトニアンという演算子Hˆ を用いて次のように記述できる。 ˆ i H t  _{ } 

(2.1)

左辺は本来

i



 

t



であるが、簡単化のため、今後しばしば 1として記述する。

この式は

time-dependent Schrӧdinger equation

と呼ばれる。

ˆ Hが時間

t

に依存しない場合は、

 

x,t 



   

x 



t と表して上記式を解くと ˆ ( ) i i H t

 

t

 

_  _   x 、ただしxは空間座標を表す。両辺に左から



*を掛けてxで積分すると、 i E t



_

 _  ただし、

E







*( )

x

H

ˆ



( )

x x

d

(2.2)

一般に、物理量を表す演算子 ˆAの期待値

A

は

A







*

A d

ˆ



x

によって与えられる。したがって、Eはエネルギーの期待値（観測量）である。その結果、



( )

t



e

iEtとなり、

( , )

t

e

iEt



( )



x





x

(2.3)

と表される。 1としているので、eiEtとなっているが、正しくはE/ である。

1 2

I 

のスピン（ 1として表記）の磁気モーメントの時間変化を考察しよう。時間に依存する任意の状態の波動関数を、スピン角運動量の

z

成分I_zが

1 2

と



1 2

のエネルギー固有関数



_と



_（固有値

E

_とE_ ）の線形結合で表現すると、

a b

,

を任意の実数係数として次のように表される。

(15)

3

( , )t ae iE t ( ) be iE t ( )  







  x   x   x 、

a

2



b

2



1 (2.4)

静止磁場

B

0（

z

軸正方向）内に存在する磁気モーメント

 

 Iのハミルトニアンは 0 0 ₀ ˆ ˆ z H  



B  



I B  



B I である。今後は、

I

_zを表す演算子を ˆI と書く。従って、_z 演算子

H

ˆ

のエネルギー固有値は次のようになる。

 

1 2 0,

 

1 2 0 E_  



B E_ 



B （ 1としていることに注意）

(2.5)

磁気モーメント



の期待値を求める。積分のかわりにブラケット表記を用いると

*

z z

d

z



 





  

x





iE t iE t

ˆ

iE t iE t z

ae



be



I ae



be

    

























2

ˆ

z

a

_

I

_







i E( E )t

ˆ

i E( E )t

ˆ

a z z

ab e

  



I



_

ab e

 



_

I



_

 



2 z

b



_

I



_









2 2



2 a

b







(2.6)

上記の計算において、基底波動関数の規格・直交性を用いた。確かに、磁気モーメントの

z

成分は時間に依存しない定数であることが分かる。一方、そのx y, 成分を求めてみよう。今後は簡単化のために、



_

I

ˆ

_x



_





I

ˆ

_x



と表記する。スピン角運動量、Iˆx, , Iˆy Iˆz の間に成り立つ不確定性関係を用いると 1 1 ˆ _,ˆ 2 2 x x I







I







(2.7)

が成り立つ（

3

節末尾の補足的解説を参照）。これを用いると、



2

ˆ

i E( E )t

ˆ

x x

a

I

x

abe

I

x  







 





 

 





( ) 2 0

ˆ

_cos

i E E t x x

abe

 



I



b



I





ab



t





(2.8)

ただし、式

(2.5)

よりE_ E_  



B₀ 



₀である。一方、y成分は、 ˆ _,ˆ 2 2 y y i i I







I



 



(2.9)

が成り立っているので、これを用いると、



2

ˆ

i E( E )t

ˆ

y y

a

I

y

abe

I

y  



_{ }



_{ }





_

 







( ) 2 0

ˆ

_sin

i E E t y y

abe

 



I



b



I





ab



t





(2.10)

量子力学的なスピン角運動量の期待値の計算から得られた上記の解は、ベクトル

I

が角速度



₀で

z

軸のまわりを歳差運動することに一致している（





0

とすれば



₀



0

より

z

軸のまわりを負の向きに歳差運動する；

z

軸の正の方向からxy平面を見下ろして、

I

は時計回りに回転する）。この結果は、式

(1.3)

に示した古典力学にしたがう

Bloch

方程式の解のふるまいと全く同一である。

(16)

4

3.

密度行列



ˆ

は系の量子状態を表す演算子 系の量子状態



を基底関数

n

の線形結合で表すと、

c

_nを複素係数として n n

c n

 



のように表される。基底関数

n

には時間依存性がなく、係数

c

_nが時間に依存すると考える。物理量を表す演算子を

ˆA

とすると、状態  において観測される物理量は

ˆA

の期待値である。

c

_m

*

を

c

_mの共役複素数とすると、 , , , ˆ _* ˆ _* m n n m m n m n m n A   A  



c c m A n 



c c A

(3.1)

と表される。スピンを取り囲むミクロな環境（格子とも呼ぶ）は熱的に様々な状態をとるので、 A の熱的集団平均値

A

が実際に観測される物理量である。c cn m*



n m_, と表して、それを演算子ˆの

( , )

n m

成分と定義すると、

 

 

, , , , , ˆ ˆ ˆ ˆ * n m m n n m m n n n m n n m n A 



c c A 





A 





A Tr



A

(3.2)

ˆ  のことを密度行列（密度演算子）と呼び、c cn m*



n m_, は、格子の様々な状態で係数行列を熱平均したものである。観測量Aの熱平均値はˆと

ˆA

の積のトレース（対角和）で表される。ˆが分かれば、任意の観測量の期待値が得られるので、ˆは波動関数形式の量子力学における状態関数に対応している。すなわち物理量

ˆA

の期待値は、

ˆ

*

A

 



A d



x

（波動関数形式）

 

_ˆ

ˆ

A



Tr



A

（演算子形式）

(3.3)

と表現される。 - - - 【補足的解説】量子力学が古典力学と基本的に異なる点は、不確定性原理と呼ばれるものの存在である。この原理が適用される相補的な一組の物理量の典型が位置座標

x

と運動量pの関係である。この不確定性関係を数学的に定式化するものが物理量を表す演算子の交換関係である。例えば、ˆx とpˆ_xの交換関係、 x pˆ ˆ, xxpˆˆxp xˆ ˆx i は、x座標と運動量のx成分pxが同時に確定的な値を取ることができないことを表している。NMR現象の場合には、角運動量の , ,x y z 成分 の間に不確定性関係が存在している。それは次の交換関係によって定式化される。 ˆ ˆ_, ˆ x y z I I iI      、 ˆ ˆIy,Iz  iIˆx、 ˆ ˆIz,Ix iIˆy

(3.4)

最初の式を巡回置換したものが次の2式である。Iˆ_zの固有値が1 2, 1 2 となる固有状態を

(17)

5

,   とし、それを基底ベクトルとして、

I

zを行列表現すると、 1 0 1 ˆ 0 1 2 z I   _   

(3.5)

となる。ˆIIˆ_xiIˆ_y, IˆIˆ_xiIˆ_yという演算子を導入すると、 ˆ ˆ_I_z,I_Iˆ, _Iˆ ˆ_z,I_ Iˆという交換関係が成り立つ。両辺に  あるいは  を作用させると、Iˆ    , Iˆ    が成り立ち、同時にIˆ  0, Iˆ  0も成り立つ。すなわち、 ˆI, Iˆを行列表現すると次のようになる。 0 1 ˆ _, 0 0 I   _   0 0 ˆ 1 0 I  _  

(3.6)









1 1 ˆ ˆ ˆ _,ˆ ˆ ˆ 2 2 x y I I I I I I i         を用いると、下記のパウリ行列が得られる。 0 1 0 1 1 0 1 1 ˆ _,ˆ _,ˆ 1 0 1 0 0 1 2 2 2 x y z i I  _ _ I  _  _ I  _ _        、単位演算子 1 0 ˆ 0 1 E  _  

(3.7)

また、以下の式も覚えておくと便利な関係式である。 2 2 2 ˆ ˆ ˆ _{ˆ 4} x y z I I I E ˆ ˆ ˆ ˆ _,ˆ ˆ ˆ ₂ x y y x x y z I I  I I I I i I 、その巡回置換をして ˆ ˆI I_{y z} i Iˆ_x 2, I Iˆ ˆ_{z x} iIˆ_y 2

(3.8)

- - - , ˆ * n m n m c cn m     によって密度演算子（行列）を定義した。c c_{n m}* n   m であることを考慮すると、ˆ    と表すことができる。

4. Liouville - von Neumann

の式

状態関数の時間変化は、式

(2.1)

のように時間依存性のある

Schrӧdinger

方程式にしたがって、ハミルトニアン

H

ˆ

によって決定される。i



   t



Hˆ に

( )

n n

c t n

 



を代入して、係数

c

_nの時間微分を求めよう。ただし n は時間に依存しない基底関数とする。 ˆ n n n n dc i n c H n dt 



(4.1)

左から

k

を作用させると ˆ k n n dc i c k H n dt 



(4.2)

係数

k

を

m

に変換し、両辺の共役複素数をとり、

H

ˆ

がエルミート演算子（複素対称行

(18)

6

列）であることを考慮すると m H nˆ * n H mˆ が成り立つので、 * _ˆ _ˆ * * * m n n n n dc i c m H n c n H m dt  







(4.3)

上の

2

式を用いて、



_{k m}_, の時間微分を計算する。





, * * * k m k m k m m k d d dc dc c c c c dt dt dt dt



   *

ˆ

* n m k n n n

i

c c

k H n

i

n H m c c

 







ˆ

_ˆ

ˆ

_ˆ

ˆ

n n

i



k H n n



m

k



n n H m



i k H

 

H m

 

_



_

 









 id ˆ Hˆ ˆ ˆHˆ Hˆ, ˆ dt



_

_{ }

_ _

_

_   

(4.4)

これが

Liouville - von Neumann

の式である。密度演算子ˆは、波動関数と同様、系

の状態を表す演算子で、その時間変化は

H

ˆ

によって決定される。 ˆ i H t _{ }  （

Schrӧdinger

方程式） ˆ _{ˆ ˆ} , d i H dt



_

_

_

   （

Liouville - von Neumann

の方程式

）

2

節では波動関数を用いてスピン角運動量の期待値を計算し、磁化ベクトル



の運動が古典的なベクトル模型にしたがう

I

の運動と同じであることを見た。しかし、

NMR

現象を考察する場合、今後は波動関数ではなく状態を表す演算子として直接

ˆ



を考察する。それは、



ˆ

の時間変化がスピン

I

の古典力学的運動とよく対応しているからである。これからそれを詳しく見ていくが、先に少し具体例を述べておこう。例えば、スピンの角運動量ベクトル

I

が熱平衡状態で

z

軸方向（

B

0方向）を向いているとき、状態演算子



ˆ

eq_はˆ z I に比例している（

7

節で考察）。90_yパルスでベクトル

I

が

x

軸方向に倒された直後の



ˆ

は

I

ˆ

_xで表される。さらに、この横磁化

I

ˆ

_xが

H

ˆ

のもとで自由歳

差運動する様子は、

Liouville - von Neumann

の方程式の解として、



ˆ t

 

 i tIˆzˆ i tIˆz

x e  I e と表されるが、この演算子_e i tIˆzはˆ z I 軸のまわりでIˆ_xを角度



t

だけ回転させるという意味を持っている（

8

節で考察）。この回転演算子の作用の一般的規則を学ぶと、状態演算子は



ˆ

 

t cos  t Iˆx sin t Iˆyと書き表せる。ex, eyを回転座標系の

x

軸、y軸方向の単位ベクトルとして、Iˆ_xおよびIˆ_yがIˆx I e0 x、Iˆy I e0 yに対応すると考えると、

 

0

 

0

 

ˆ

t

I

cos

t e

_x

I

sin

t e

_y











(19)

7

と表せる。つまり



ˆ t

 

の時間変化は、最初

x

軸上にあったベクトル

I

が角速度で回転する古典的な歳差運動と全く同じ描像を与える。これが「



ˆ

をスピンの状態を表す演算子と考えると、スピンの量子力学的状態変化を古典的なベクトル模型と対比しながら直感的に把握することが容易になる」という最大の理由である。

2

つのスピンの間にスピン－スピン結合という相互作用が存在する問題になると、ハミルトニアン

H

ˆ

にはスカラーカップリングという項が入ってくる。その状況でスピンの運動を考えると、古典力学に従うベクトル模型では全く対応できなくなる。例えば、スピン結合した

I

と

S

という

2

スピン系の場合、



ˆ

が

I

ˆ

_xとかSˆ_yという単純なものではない2I Sˆxˆz, 2I Sˆzˆyという状態が存在する。そのような量子力学系特有のスピンの状態を理解し、ハミルトニアン

H

ˆ

のもとでそれがどのように変化するかを考察することが、タンパク質の

NMR

分光法を理解するために不可欠なこととなる。スピンの状態変化を考察するために密度演算子



ˆ

は波動関数による状態変化よ

り直感的な理解が得やすく優れているため、

Liouville - von Neumann

の式に従って

 

ˆ t



の時間変化を考察することが重要になる。

Liouville - von Neumann

の式の解を求

めてみよう。

H

ˆ

が

time-independent

の場合、その式は容易に解けて、



ˆ t

 

は次のように表すことができる。 ˆ ˆ ˆ( )t e iHtˆ(0)eiHt



_ 



(4.5)

これが

Liouville - von Neumann

の式の解になっていることを確かめてみよう。

【証明】演算子Hˆ の指数関数については 5 節末の補足的説明を参照するとよい。 ˆ ˆ ˆ( )t e iHtˆ(0)eiHt  _   _{と仮定すると、}

 

iHtˆ _ˆ iHtˆ d dt e iH e となるので（補足説明参照）、



ˆ ˆ



_ˆ ˆ ˆ ˆ ˆ _ˆ

ˆ iHtˆ(0) iHt iHtˆ(0) iHt iHtˆ(0) iHt

d dtd dt e  e  iH e   e e  e iH



ˆ _ˆ _ˆ ˆ



ˆ_,_ˆ

i H H i H 

   _{  } _

以上、ˆ( )t eiHtˆˆ(0)eiHtˆ は確かに Liouville – von Neumann の式(4.4)の解である。

5.

回転座標系への変換

H

ˆ

が

time-dependent

な場合、

Liouville - von Neumann

の式を解くために、

H

ˆ

が

time-independent

になるように座標変換する必要がある。

NMR

測定実験の場合、ラジ

(20)

8 ˆ

U

（ユニタリー行列）を用いて、実験室系の物理量を回転座標系における観測量に変換

する。



ˆ

や

H

ˆ

をユニタリー変換して、回転座標系における

Liouville - von Neumann

の

式を導いてみよう。

U

ˆ

を用いて



ˆ

をユニタリー変換し、添え字

r

を付けて表示すると、 1 †

ˆ ˆ

ˆ

r

ˆ

U U



_





_



_、ここで

ˆ

†

U

は

U

ˆ

の複素転置行列

(5.1)

ユニタリー行列とは

U

ˆ

1



U

ˆ

†が成り立つことである。



ˆ

r_{を時間微分したものは、} 1 1 ˆ 1 1 1 ˆ ˆ _ˆ ˆ _ˆ _{ˆ ˆ ˆ} _{ˆ ˆ ˆ} ˆ ˆ r d d dU dU U U U U U U U U dt dt dt dt



_

        1 1 ˆ 1 ˆ ˆ _ˆ_, ˆ ˆ dU ˆ _ˆr _ˆr ˆ dU iU H U U U dt dt



 



    _ _  

(5.2)

ˆ

H

をユニタリー変換したものを

ˆ

r

H



UHU

ˆ ˆ ˆ

1と表すと、

ˆ

_ˆ

ˆ ˆ

1

_ˆ

ˆ

,

r

,

r

U



_



H U



_







_



H



_

となり、さらに、



ˆ



ˆ

1

ˆ



ˆ

1



dU dt U



 

U dU



dt

を用いると、 1 1 ˆ ˆ ˆ _ˆ _ˆ _ˆ ˆ , ˆ ˆ r r r r r d dU dU i H U U dt dt dt



_

 

_

   _ _  ˆ ,r ˆr ˆ dUˆ 1 i H iU dt



    _  _  

(5.3)

となる。ここで、

ˆ

r

ˆ



ˆ

1



e

H



H



iU dU



dt

と定義すると、次式が成り立つ。 ˆ _ˆ ˆ , r r e d i H dt



_

_

_   

(5.4)

ˆ e

H を有効ハミルトニアンと呼び、これが回転座標系における

Liouville –von Neumann

の式である。回転系へ変換後、

H

ˆ

_eはユニタリー変換したハミルトニアン

ˆ

r

H

の他に



1



ˆ

iU dU



dt



という項を含んでいる。この項が、回転座標系に変換したとき運動方程式に新たに加わる慣性力に対応している。 - - - 【補足説明】指数関数：

e

i Aˆは指数関数をテイラー展開したもので定義する。すなわち、

 

ˆ 1 0 1 _ˆ 1 _ˆ ˆ ! ! n _n i A n n n e E i A i A n n   _  _    







(5.5) ただし、 ˆEを単位演算子とし、 ˆ0 ˆ ˆ2 ˆ ˆ 0! 1,  A E A,  A Aという関係式を適用する。式(5.5)の定義を用いると、これからよく使う以下の関係式が成り立つ。（ⅰ）

 

i Aˆ ˆ i Aˆ d d e iAe ；式(5.5)の右辺の微分を実行すれば証明は容易。（ⅱ）演算子 ˆAと ˆBが交換可能ならば、 i A B ˆ ˆ iAˆ iBˆ e  e e

(21)

9

6.

ラジオ波（

rf

）パルスと回転演算子 静止磁場

B

0（

Z

軸）の他に、XY平面上で角振動数



_rf の

rf

-パルスが照射されているとき、そのハミルトニアンを考察する。今後は、実験室系の座標軸をXYZとし、回転系の座標軸をxyzと標記することにする。eXをX 軸方向の単位ベクトルとして、 X 軸上を直線的に周波数



rf で振動している直線偏光磁場を

B

X

 

t e



Xとする。振幅を

 

0





cos

X X rf

B

t



B



t







0

2 

i



rft



i



rft



X

B



e

 

e

 





_



_





(6.1)

図 2 直線偏光磁場は 2 つの円偏光磁場の重ね合わせ。複素振幅の直線偏光磁場：ei t e_X cost e_X sint ie_X     は、ie_X e_Yと考えると、ei t eX cos t eX  _ _ _ _ _sin Y t e    となるので、円偏光磁場と考えることが出来る。つまり左回り円偏光磁場と右回り円偏光磁場を重ね合わせたものが式(6.1)の直線偏光磁場になる。青色のベクトルは反時計回りの円偏光磁場を表す。濃い灰色のベクトルが回転座標系のxy平面と一緒に時計回りに回転する円偏光磁場である。と表現すると、第

1

項はX 軸から角度





の初期位置から反時計回りに



_rf

t

回転する円偏光磁場を表し、第

2

項はX 軸から角度



の初期位置から時計回りに





_rf

t

回転する円偏光磁場を表す（図

2

の脚注参照）。





0

の場合（プロトンの 1 H



は正）、

Lamor

周波数は



₀0となるので、時計回りに回転する回転座標系が選ばれる。回転座標系で静止磁場となる円偏光磁場だけが磁気共鳴を起こすので、式

(6.1)

の第

1

項は無視して

X

Y

x

y 1 B   rf t     rf t   rf  

(22)

10

よい。第

2

項の磁場を

B t

1

 

と標記すると、複素振幅の直線偏光磁場が円偏光磁場に対応することに注意して、 0 1 2 X B B とし、





_rf





_rf

( 0)



と表すと、

 









1 ₁

cos

_rf _X ₁

sin

_rf _Y

B t



B



t

 



e



B



t

 



e

(6.2)

となる。eX, eYは実験室系の単位ベクトルである。Z 軸のまわりを角速度



rf

(



0)

で回転する回転座標系xyzを選び、

t 

0

のとき

x

軸がX 軸と一致していたとすると、円偏光磁場

B t

1

 

はxy平面上で

x

軸から角度



の方向に静止している。従って、回転座標 系で rf-磁場を観測すると、





0

の場合は

x

軸上に静止した磁場となり、

 



2

のときはy軸上に静止した磁場となる。

B t

1

( )

の影響を考慮して、rf-パルスを照射中のハミ ルトニアンは次のように表される。



0 1



₀ ₁

ˆ

_cos(

₎

ˆ

_sin(

₎

ˆ

z rf x rf y

H

  



B



B

 



B I





B

_





t





I





t





I



_

(6.3)

ただし、 1として省略されている。このハミルトニアンは確かに

time-dependent

である。回転座標系から観測して

time-independent

にしてみよう。回転座標系に変換するために、ユニタリー行列を

_U

ˆ



_e

irft Iˆz_{と選んで計算する。} 1

ˆ

r

ˆ ˆ ˆ

H



UHU

 ₀ i rftIˆz

ˆ

i rftIˆz z

e



I e







ˆ ˆ ˆ ˆ 1

cos(

)

ˆ

sin(

)

ˆ

rf z rf z rf z rf z i tI i tI i tI i tI rf

t

e

I e

x rf

t

e

I e

y    





















_



_

(6.4)

ただし、



₀ 



B₀,



₁ 



B₁である。式

(6.12)

で一般的に証明する次の関係式 ˆ

_ˆ

ˆ

_ˆ

cos

sin

z z i I i I x x y

e



I e





I





I



ˆ

_ˆ

ˆ

_ˆ

cos

sin

z z i I i I y y x

e



I e





I





I



(6.5)

を用いて式

(6.4)

を変形すると、





0 1

ˆ

r

ˆ

_{ˆ cos(}

_{) cos(}

_{) sin(}

_)sin(

₎

z x rf rf rf rf

H





I





I



t







t





t







t





1Iˆ sin(y rft ) cos( rft) cos( rft ) sin( rft)











    0Iˆz 1Iˆxcos 1Iˆysin



 



  

(6.6)

一方、コレオリ力の寄与による項は





1 ˆ ˆ ˆ ˆ i rftIz i rftIz ˆ rf z dU d iU ie e I dt dt  

_

      

(6.7)

したがって、回転座標系における有効ハミルトニアンは

time-independent

になり、次のように表される。



0



1





ˆ ˆ ˆ _cos ˆ _sin e rf z x y H 

 

 I 



I



I



(6.8)

ˆ e H は

Z

軸のまわりを角速度



_rf

 



0

で回転している回転座標系で

I

の歳差運動を考察したことに対応している。従って、

z

軸まわりの歳差運動の回転角速度は相対的に

(23)

11

0 rf

 



 

と表される。また、

rf-

パルスは確かに

x

軸から角度



の位置に静止した大きさB₁の磁場に対応している。直線偏光磁場BX

 

t の初期位相が





0

の場合、磁場B1 は回転座標系の

x

軸上に静止しているので、

rf-

パルスを

x

軸から照射したという。

2  



のときはy軸からパルスを照射したことになる。図3 回転座標系で観測される磁場。コレオリ力に相当する磁場 _rf が静止磁場B0を打ち消すように発生している。B_off  



 ₀ _rf



   を磁場の off-resonance項と呼ぶ。タンパク質中の個々のスピンが感じる局所磁場は静止磁場

B

0から少しずつ違っているため、様々な

Lamor

周波数をもつスピンが共存している。照射するラジオ波の周波数



_rf と同じ大きさの共鳴周波数をもつスピンを

on-resonance

、異なる周波数のスピンを

off-resonance

と呼び、はオフセット周波数という。タンパク質内のプロトンは様々な化学分子中の水素原子の核スピンであるため、結合原子の化学種に応じて局所磁場が異なる。Iˆ_zは回転座標系で残留している

off-resonance

磁場（図

3

参照）によって核スピンが受ける歳差運動の項であるため化学シフト項と呼ばれる。時刻

t 

0

のとき



ˆ (0)r _{であった密度演算子は、}

time-independent

に変換されたHˆ_e のもとで時間発展して、時刻

t

のとき、



ˆr( )_t _eiH tˆe



ˆr(0)_eiH tˆe となる。今後は、常に回転座標系でスピンの運動を考察するので、必要でない限り添字の

e

や

r

などを省いて表記する。ハミルトニアン

H

ˆ

で、



ˆ を

t

だけ時間展開することを今後次のように表示する。

ˆ

(0)

Ht

( )

ˆ

t



(6.9)

rf-

パルスを

on-resonance

スピンにx軸から照射する場合、ハミルトニアンは

H

ˆ





1

I

ˆ

x と表されるので、密度演算子の時間発展は次のようになる。 1 ˆ 1 ˆ 1

ˆ

(0)

( ); ( )

ˆ

i t Ix

ˆ

(0)

i t Ix x

t I

t

e



e







_



_

 





(6.10)

y

z

1 1 B    0 ( ) off rf B     

x

(24)

12

この rf-パルスを



時間照射すると、

 

₁  として、



ˆ(0)

を

I

ˆ

_x軸のまわりに角度



だけ回転させたことに対応するので、演算子_e iIˆx を

ˆ

x

I

軸まわりの回転演算子という。

2  



のとき90xパルスという。演算子  ₂ˆ x i I e  の演算規則を考察した後、

8

節で90x パルスによって

I

ˆ

_zが回転して



I

ˆ

_yになることを確かめる。ハミルトニアンを

time-independent

にするために作用させたユニタリー演算子が ˆ

ˆ

i rft Iz

U



e

  のとき、回転系で観測した物理量を

ˆ

r

ˆ ˆ

ˆ

1

A



UAU

 と表現するのは、物理量

ˆA

を

I

ˆ

_z軸のまわりに角速度





_rf で回転させることに対応している。すなわち、回転座標系が実験室系の

Z

軸のまわりに角速度



_rfで回転しているので、物理量

ˆA

はそれとは逆方向に回転したことに対応している。回転演算子に関連して、便利な次の関係式が成り立つ。演算子A B Cˆ, , ˆ ˆがあって、次の交換関係：_C Aˆ ˆ,  _ iBˆおよび_B Cˆ, ˆ _ iAˆが成り立っているとする。このとき、

ˆA

を

C

ˆ

のまわりで角度



だけ回転させると、 ˆ _ˆ ˆ _ˆ _ˆ cos sin i C i C e Ae  A



B



(6.11)

となる。この関係式を導いてみよう。 [証明] ˆ _ˆ ˆ ( ) i C i C f  e Ae とおく。_C Aˆ ˆ,  _ iBˆ、_B Cˆ,ˆ_ iAˆを用いて、



ˆ_ˆ ˆ



ˆ



_{ˆ ˆ} _{ˆ ˆ}



ˆ ˆ_ˆ ˆ ( ) i C i C i C i C i C i C f d d e Ae e i CAAC e e Be



ˆ_ˆ ˆ



ˆ



_ˆ_ˆ _ˆ_ˆ



ˆ ˆ _ˆ ˆ ( ) i C i C i C i C i C i C ( ) f d d e Be e i CBBC e  e Ae  f  ( ) ( ) f  f  より、f( ) aˆcosbˆsin とおける。 ˆ ˆ (0) f   およびa A f(0)  より、bˆ Bˆ f( ) AˆcosBˆsin 関係式

(6.11)

を図で表現してみよう。

ˆA

を

C

ˆ

のまわりで



回転させるとする。座標軸

C

ˆ

と

ˆA

を図

4

のように選び、第

3

の軸を交換関係_C Aˆ ˆ, _によって定まる第

3

の演算子に選ぶ。上記の場合、交換関係の結果が

iB

ˆ

だから、iを除いた

ˆB

を第

3

の軸とする。長さ

1

のベクトルを角度



だけ回転させ、その

ˆA

軸成分

cos



と

ˆB

軸成分

sin



の和が回転後

の演算子 i Cˆ ˆ i Cˆ e Ae を表す。すなわち、 i Cˆ ˆ i Cˆ cos ˆ sin ˆ e Ae 



 A



Bとなる。上で述べた交換関係を満足する演算子であれば、このルールは一般的に成り立つ。今後、いろいろの回転演算子に対して、この図を用いて便利な関係式を導くので、操作を覚えておくとよい。

(25)

13

図4 演算子 ˆA を軸Cˆ のまわりでだけ回転させるこのルールをスピン角運動量演算子に適用してみよう。すなわち、Iˆ_xあるいは

I

ˆ

_yをIˆ_z 軸のまわりで角度だけ回転させたとする。その操作を図

5

に表現すると、回転演算の結果が図として容易に理解でき、今後よく使う以下の有用な関係式が得られる。 ˆ

_ˆ

ˆ

_ˆ

cos

sin

z z i I i I x x y

e



I e







 

I





I

ˆ

_ˆ

ˆ

_ˆ

cos

sin

z z i I i I y y x

e



I e







 

I





I

(6.12)

図5 Iˆ_xあるいはIˆ_yをIˆ_z軸のまわりで回転させる

7.

熱平衡状態におけるスピン系の密度演算子 温度Tの熱平衡状態における密度演算子を考察する。スピン系の熱平衡状態



_eq を、定常状態 n を基底に選んで表すと、 _n eq n

c n

 



となる。スピン系を囲むミク  ˆ C ˆA ˆB  ˆ ˆ_, ˆ C A iB      ˆ _ˆ ˆ i C i C e Ae ˆ ˆ cos A sinB ˆ ˆ A



C ?  ˆ z I ˆ x I ˆ y I  ˆ ˆ_, ˆ z x y I I iI      ˆ _ˆ ˆ z z i I i I x e I e ˆ ˆ cosIxsinIy  ˆ z I ˆ y I ˆ x I   ˆ ˆ_, ˆ z y x I I iI       ˆ _ˆ ˆ z z i I i I y e I e ˆ ˆ cosIysinIx

タンパク質NMRの物理的基礎 : スピン状態の量子論から2次元スペクトル測定法まで