NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)

核スピンは磁気双極子モーメントを持っていて、周囲の空間に局所磁場を作る。そ の近傍にある別の核スピンの双極子モーメントは、その局所磁場の影響を受けて2つの スピンは相互作用する。相互作用する2つの核スピン（IとSスピンとする）の励起状 態は一般に図23のような4状態図で表される。左はIスピンの状態、右がSスピンの

図23 2^スピン( I, S )^系の4状態図と遷移速度定数

状態を表すとして、   , , , という状態が存在する。励起状態にある核スピン の緩和過程について、ここでは詳しく述べないが、緩和現象を応用して、双極子相互作 用するスピン対を検出する重要な 2 次元 NMR 測定法があるので、必要な部分だけ簡 単に説明する。

(1) Solomonの方程式と自発緩和、交差緩和過程

双極子相互作用でカップリングしているスピン対IとS がrf-パルスによって励起 されたとする。その後の時間経過とともに、それは平衡状態に緩和していく。励起状態 間の遷移速度定数を、図 23 のようにW_I, W_S, W₀, W₂と表し、それぞれの状態の占有 確率をP_, P_, P_, P_とすると、



_{I S 2}



_{I S 2}

dP W W W P W P W P W P

dt

           (24.1)

と表される。また、平衡状態における各状態の占有確率をP_ij^eqと表すと、









WS

 ^{I, S}

WS

WI

WI

W0

W2

53



2



2 0

eq

eq eq eq eq

I S I S

dP W W W P W P W P W P

dt

             (24.2)

したがって、占有確率の平衡状態からのずれを P_ij P_ijP_ij^eqと表し、^{d dt}



^P



を計 算すると次の式が成り立つ。



I S 2



I S 2

d P W W W P W P W P W P

dt

    

            (24.3)

他の状態の占有確率P_ijに対しても同様の式が成り立つ。



I S 0



I S 0

d P W W W P W P W P W P

dt

    

           



I S 0



I S 0

d P W W W P W P W P W P

dt

    

           



I S 2



S I 2

d P W W W P W P W P W P

dt

    

           

z磁化の平衡状態からのずれI tz

 

I tz

 

I^eqおよびS tz

 

は、次式

 

^{1 2}

 

^,

^{ }

^{1 2}

 

z z

I  P_P_ P_ P_ S  P_ P_ P_ P_ (24.4) を用いて、次のように表される。



0 2 2

 

2 0



z

I z z

d I W W W I W W S

dt

        



0 2 2

 

2 0



z

S z z

d S W W W S W W I

dt

         (24.5)

, 0 2 2, , 0 2 2, , 2 0

z I I z S S I S

R W  W W R W  W W  W W と表すと、z^{磁化の緩和によ} る時間変化を決める次の微分方程式：Solomonの式が得られる。

 

,

 

,

 

z

z I z I S z

d I t

R I t S t

dt 

     

 

,

 

,

 

z

z S z I S z

d S t

R S t I t

dt 

      (24.6)

rf-パルスによって励起された直後の磁化ベクトルのz^{成分のずれを}I_z(0), S_z(0)と

すると、その後、I tz

 

やS tz

 

は緩和過程によって徐々に0 に戻る。最初、仮にS スピンだけが選択的に励起されて、I_z(0)0だったとしても、I t_z( )はSスピンから の交差緩和_{I S,} の項によって過渡的に正または負（_{I S,} の符号に応じて）の値をとる。

この現象を交差緩和によるSスピンからIスピンへの分極移行と呼ぶ。

簡単な場合を考えてみよう。IとSスピンが同種核の場合、R_{z I,} R_{z S,} R_zと近似 してもよい。また、平衡状態におけるz^磁化もI_z^eq S_z^eq I₀^{と近似できる。}Iスピンを

54

I1、S スピンを I2 と表すことにして、rf-パルスで励起された直後の状態をI_1,z(0)^、

2,_z(0)

I としてSolomonの方程式を解くと、R_z R, _{I S,} として、

 

 

1, 11 12 1,

21 22 2,

2,

( ) ( ) (0)

( ) ( ) (0)

z z

z z

I t a t a t I

a t a t I

I t

 

    

   

    

  (24.7)

   

( ) 2 ( ) 2

11 22 12 21

1 1

( ) ( ) 1 , ( ) ( ) 1

2 2

R t t R t t

a t a t  e^{ } e^ a t a t   e^{ } e^ (24.8)

となる（証明は下記を参照）。関数a t₁₁( )^またはa₂₂( )t という項が自発緩和過程を表し、

関数a₁₂( )t ^あるいはa₂₁( )t という項が交差緩和による分極移行を表している。 0^の 場合、関数形は下図のようになり、どちらもいずれは0となり平衡状態に戻る。

図24 緩和を表すa t₁₁( ), a t₁₂( )の関数形。R0.3 s , ^1  0.15 s^1を用いて計算。

【証明】I_1,z t y₁, I_2,z t y₂と表すと、Solomonの微分方程式は、

1 1 2,

y  Ry y y₂ Ry₂y₁ (24.9)

と書ける。Y y₁ y₂, y y₁ y₂と変数変換し、^{Y t}   ^{, y t} に関する微分方程式を解くと、

  0 ^{R t},   0 ^{R t}

Y t Y e^{ } y t y e^{ } である。ただし、Y₀, y₀は初期条件より、

       

0 1,_z 0 2,_z 0 , y0 1,_z 0 2,_z 0

Y  I  I  I  I (24.10)

    ^{  2}     ^{  2}

1 1 2 ^{R t} 0 0 ^t , 2 1 2 ^{R t} 0 0 ^t

y t e^{ } y Y e^  y t e^{ }  y Y e^ 

         (24.11)

上の2式を未知定数 , を用いて次のように書き直すと

    ^{  2}   ^{  2}

1 1 2 ^{R t} 1 ^t 1 2 ^{R t} 1 ^t 11 12

y t  e^{  } e^{ } e^{  } e^{ }a   a 

    ^{  2}   ^{  2}

2 1 2 ^{R t} 1 ^t 1 2 ^{R t} 1 ^t 21 22

y t  e^{  } e^{ } e^{  } e^{ }a   a  (24.12) ただし、  y₀,   Y₀である。初期条件：I_1,z 0 , I_2,z 0 ^{を用いると、}

0 5 10 15 20

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

/ sec t

a11

a12

aij

55

   

1,_z 0 , 2,_z 0

I I

    となるので、結局、

           

1,_z 11 1,_z 0 12 2,_z 0 , 2,_z 21 1,_z 0 +a22 2,_z 0

I t a I a I I t a I I

         (24.13)

(2) 2次元NOESYスペクトル（2D-NOESY）

交差緩和を表す係数a₁₂は、初期状態近似をすると(t 1^)、tとなるので、交差 緩和によって移行した磁化の大きさは に比例している。プロトン間の距離をr^とする と、磁気双極子モーメント間の相互作用エネルギーはr^3に比例するが、緩和現象は局 所磁場の揺らぎによって引き起こされるので、遷移速度定数の大きさは相互作用エネル ギーの2乗に比例する。従って、 W₂W₀はr^6に比例し、分極移行の大きさは距離 の増大とともに急速に減少する。目安として5Å以内にあるプロトン対には、交差緩和 による分極移行が起きると考えてよい。

下に2D-NOESYのパルス列を示す。第2の90パルス後の積オペレータは、COSY の場合と同じである（式(20.3)参照）。生成される4つの項のうち、今回はコヒーレンス 次数ゼロの項、cos(_{1 1}t ) cos( Jt I₁)ˆ_1,zとcos(_{2 1}t) cos( Jt I₁)ˆ_2,zだけを選択的に残し て、それ以外の直積演算子の項は「位相回し」によって消去する。従って、Iスピンの 平衡磁化の大きさをI₀^{とすると、混合期}_mixの初期状態の磁化の大きさは、

図25 2D-NOESY^{のパルスプログラム}

     

1,_z 0 cos ( 1 1 cos 1 0

I   t Jt I e^ip

     

2,_z 0 cos ( 2 1 cos 1 0

I    t Jt I e^ip (24.14)

となる。ここで、e^ipは第 1 のパルスの位相変化を考慮した因子である。90_xのとき

p 0

  、90_xのとき_p  となり、初期状態のz磁化を表す振幅は符号が反転する。

混合時間_mを適切な時間に設定すると、交差緩和によるI_2,zからI_1,zへの分極移行が最 大となる。それぞれのスピンのz磁化の平衡値からのずれを Solomon の方程式から求

t1

mix

t2

56 めよう。その初期値は次式のように表せる。

1,_z(0) cos( 1 1) cos( 1) 0 ^{i p} 0

I t Jt I e^ I

      

2,_z(0) cos( 2 1) cos( 1) 0 ^{i p} 0

I t Jt I e^ I

       (24.15)

これをSolomonの方程式の解に代入すると、I1,z

 

m I1,z

 

m I0を用いて、

1,_z( _m) 11( _m) cos( 1 1) cos( 1) 0 ^{i p} 12( _m) cos( 2 1) cos( 1) 0 ^{i p}

I   a  t Jt I e ^ a   t Jt I e ^



1 e^{(Rz )m}



I0

  (24.16)

となる。第1項、第2項は最初の90^パルスの位相の影響を受けるが、第3項は平衡状 態へ戻る緩和過程を表す項で、90パルスの位相に関係しない。第3の90_xパルスによ ってˆ_1,

I zは ˆ_1, I y

 に変化するので、その状態ˆ_fidを演算子で表せば次のようになる。

11 1 1 1 ˆ1, 12 2 1 1 ˆ1,

ˆ_fid a ( _m)cos( t)cos( Jt ) e I^ip _y a ( _m)cos( t)cos( Jt) e I^ip _y

          



^{1 e(Rz )m}



^Iˆ1,y

  (24.17)

第 3 項はt₁依存性がないので、この項をt₁^でcosフーリエ変換すると、式(20.7)におい て、 0^{を代入したA}

 

^{ R}



^2R2



というスペクトルになり、A

 

1 ^は₁0 でピークとなる。これは軸性 (axial) ピークと呼ばれ不要なピークなので消去すること が望ましい。最初の90パルスの位相を



^0,



^{と変えると、最初の2項は符号が反転す}

るので、データ収集時に符号を反転して積算する。この操作は受信器の位相_r^を



^0,



と変えることに対応している。その結果、第1、第2項は積算され、第3項は消滅する。

これは一種の「位相回し」である（27節1項軸性ピークの消去を参照）。

t2^軸のFID信号のオフセット周波数は₁^{である。従って、式}(24.17)の第1項は対 角ピークを表し、第2項は交差ピークに対応する。t₂^軸上のFIDデータは ˆ_1,

I yの自由歳 差運動によるものなので、位相補正

 

^i の後フーリエ変換することによって、交差ピー クも対角ピークも吸収型のin-phase doubletになる。t₁^{軸に関しても、}

 

¹



¹

    

¹

 

¹

cos  t cos Jt  1 2 ^cos ^t cos ^t ^ (24.18) となっているので、cosフーリエ変換によって両ピークとも吸収型の in-phase doublet になる。I2,z

 

m に対しても、I1,z

 

m と同じことが起きているので、2D-NOESYスペ クトルは図26のような2次元のNMRスペクトルになる。実際のタンパク質に対して 測定された2D-NOESYスペクトルは第Ⅳ章の図41に示されている。同一残基内のプ ロトン対にもNOE交差ピークは観測されるが、遠く離れた残基間のプロトン対にも多 数の交差ピークが観測されていることが分かる。

57

2D-TOCSYと2D-NOESYのパルスプログラムは見かけ上よく似ている。第2の

90_xパルス後の状態は COSY と同じであるが、どちらの場合も、t₁^{軸を各スピンの化} 学シフト周波数でラベルしたz磁化だけを選択的に残す「位相回し」を実行する。そ の後の混合時間_mの間に、相互作用している 2 つのz磁化の間で分極移行が起きて、

交差ピークが出来ることを利用している。TOCSYの場合は、等方的混合パルスを照射

図26 2D-NOESY^{スペクトル}

しながら「強いスカラーカップリング」を通してz磁化間の分極移行を引き起こす。一

方、NOESYの場合は「磁気双極子相互作用」による交差緩和によってz磁化の交換を

促す。従って、TOCSYでは、あくまでスピン－スピン結合を通して繋がったスピン網 が検出される。タンパク質の場合は、ペプチド結合の部分でスピン結合が途切れるため、

同一残基内のプロトン間の交差ピークだけが検出される。一方、NOESYの方は、アミ ノ酸配列上遠く離れていても空間的に近接した残基間のプロトンの交差ピークが検出 される。パルスプログラムは一見よく似た測定法であるが、混合期におけるプロトン間 の相互作用が異なっているため、得られる情報は互いに相補的で得がたい重要な特徴を 備えている。

1

1

2

2

3

3

1

2

58

ドキュメント内 タンパク質NMRの物理的基礎 : スピン状態の量子論から2次元スペクトル測定法まで (ページ 64-70)