タンパク質の 2 次元 NMR スペクトルの測定例

これまでは、2次元NMRスペクトルを測定するプログラムの物理的な原理に注目 して考察してきた。タンパク質に対して、これらの2次元NMR測定法を適用すると、

実際どのようなスペクトルが得られるのだろうか。そのスペクトルから、どのようにし てタンパク質に関する情報を得るのだろうか。タンパク質の立体構造に立脚した考察を 行うためには、NMRスペクトル上の共鳴ピークがどの残基由来のものなのか同定する 必要がある。すなわちピーク帰属という作業である。種々の測定法によって得られたス ペクトルの情報を組み合わせてピーク帰属が行われるが、2次元のスペクトルだけでは なく 3 次元スペクトルも必要になる。以下では、具体的な NMR スペクトルを例とし て、そのような問題を考察していこう。

30. DQF-COSYスペクトル

スピンースピン結合する2 つのスピンの交差ピークを与える DQF-COSY スペク トルを測定する場合を考えよう。図16に示したCOSYのパルスプログラムを参考にし て、スペクトル測定の流れを考える。右はアミノ酸残基の概

略図である。スピン1をCHプロトン（¹HCと略記）、ス ピン2を主鎖 NHプロトン（¹HNと略記）としてコヒーレ ンスの移動を具体的に考えよう。¹HCと¹HNはスピン－ス ピン結合した2スピン系である。第1 の90_xパルスでスピ ン1 がxy平面上に倒れ、 ˆ_1,

I y

 という状態になり、スピン1 の横磁化（コヒーレンス）

は周波数₁^で時間t₁だけ歳差運動する。スカラーカップリング項を含んだハミルトニ アンのもとで時間展開するので、式(20.2)に示されているように、状態ˆ^は4つの直積 スピン演算子の和で表されるが、このとき各スピン演算子には、cos



1 1t



^あるいは



1 1



sin t という振幅変調が掛かり、時間軸t₁^{を 1}HCの化学シフト周波数₁^でラベル したという。つぎに、第2の90_xパルスを照射すると、ˆ ˆ_{1, 2,}

y z

I I という状態はˆ ˆ_{1, 2,}

z y

I I とな ってコヒーレンスがスピン1（¹HC）からスピン2（¹HN）に移行する（上の挿絵の中 の青い矢印）。そのまま FID 信号を観測すると COSY スペクトルになるが、対角ピー

N H H

C

_

C C

_

O

  t

2

  t

1

88

クが分散型になって分解能が悪いので、第 2 のパルス照射前後でˆ ˆ_{1, 2,}

x z

I I から ˆ ˆ_{1, 2,}

x y

I I と なる状態変化だけが残るように「コヒーレンス選択」を行う。すなわち、ˆ ˆ_{1, 2,}

x y

I I という

2量子コヒーレンスだけを選択するので、この測定法はDQF-COSYと呼ばれる。図18 はそのパルスプログラムの概略図を示す。外見上は図16に第3の90_xパルスが追加さ れただけのように見えるが、第3のパルスの位相を4ステップの「位相回し」で変化さ せて積算されたFIDデータが解析に用いられる（27節の(2)項を参照）。その結果、ˆ のうち次のスピン演算子の項だけがFIDという観測量を与える。



^{1 1}

 

^{1 1}

 

^{ˆ ˆ1, 2, ˆ ˆ1, 2,}



sin ^t sin ^t 2I I_{x z} 2I I_{z x}

     

  (30.1)

t1軸は振幅変調因子で、周波数₁^のanti-phase doubletである。t₂^{軸に関しては、第}1 項が周波数₁^の anti-phase doublet 信号を与え、第 2 項は周波数₂^の anti-phase doublet 信号となる。¹HCがスピン 1、¹HN がスピン 2 であったので、第 1 項は

α α

1 C H , 2 C H

   ^    ^となる対角線上の位置に 4 つの正負の吸収型ピークとして現れ る（対角ピーク）。一方、第2項は

1 C Hα , 2 NH

   ^    ^{となる位置に正負の}4つの吸 収型ピークが現れ、それが¹HCと¹HNとの間の交差ピークを表す。同様にスピン1を

1HN、スピン2を¹HCとして考えても同じ現象が起きるので、₁  _NH^,

2 C Hα

   ^ という、対角線に対して対称な位置にもう一つの交差ピークが現れる（図19参照）。 アミノ酸残基内の¹HNと¹HCの交差ピークを考察したが、残基内にはスピン－ス ピン結合する他のプロトン対も存在する。例えば、¹HCと¹HC、¹HCと¹HCなどで ある（3つ以内の共有結合で連結された¹H）。従って、これらのプロトン間には前述の ような交差ピークが見出される。しかし、ペプチド結合をまたいだ2つのアミノ酸残基 間のプロトンは、共有結合上4つ以上離れているため検出可能なスピン－スピン結合が 存在しない。従って、DQF-COSYスペクトルにおいて交差ピークが検出されるプロト ン対は同一残基内に限られる。これはピーク帰属を行うさい重要な情報となる。

DQF-COSYスペクトルの実例を2つ示してその意味を考えてみよう。例はニワト

リ・リゾチームに対して得られた2次元スペクトルである。図38はNH-CH領域の交 差ピークを表している。測定原理の説明では、NMRスペクトルの周波数軸を角振動数

で表したが、実際のNMRスペクトルでは、Hz単位の周波数に変換し、さらにppm 単位の化学シフト で表すので、周波数軸をF1、F2 軸と名付けた。横軸（F2 軸）は

89

NHプロトン領域、縦軸（F1軸）はCHプロトン領域を表している。赤と黒で表され

図38 DQF-COSYスペクトルのNH-CH領域。図中の赤と黒のピーク合計4つで1つの交差

ピークを表す。交差ピークの名前は数字が残基番号を表し、aN ^はNを意味している。例えば 34aNは残基F34内の¹HN-¹HCの交差ピークを表す。

た4つのピークで一つの交差ピークを表しているので、ピークを間違える可能性が少な い。F2=7.42 ppm, F1=4.36付近に34aNと名付けられた交差ピークが見つかる。34は 残基番号を表し、残基F34内の¹HNの化学シフトが7.42 ppm、¹HCの化学シフトが 4.36であることを示している。もちろん、ピーク帰属が未定の状態では交差ピークは何 も情報を与えないが、もし残基F34の¹HNの化学シフトが7.42 ppmであるという確 証が得られれば、F34の¹HCの化学シフトが4.36であることが確定する。以下で述べ るが、NH基のプロトンの化学シフトは3次元の HSQC-NOESY-HSQCというスペク トルを用いて連鎖帰属が高い確率で成功する。3次元でなくとも、2次元のNOESYス ペクトルから得られる隣接残基の ¹HN 間の交差ピーク（dNN相関という）情報でも、

COSYスペクトルの情報と組み合わせると、¹HN-¹HC-¹HN-…というピークの連鎖帰

(ppm) 8.8 8.4 8.0 7.6 7.2

(ppm)

4.8 4.4 4.0 3.6 3.2

9aN

74aN 31aN 96aN

122aN

16aN 91aN

58aN

5de 22aN

16aN

32aN 29aN

4aN 19aN

67aN 99aN

10aN

102aN 7aN

14aN 27aN

20aN 77aN

129aN

83aN 11aN

114aN

82aN 123aN

125aN

97aN 38aN

111aN

28aN

17aN

62aN 34aN

115aN

15aN

72aN 100aN

23aN

124aN

127aN 118aN

48aN

108aN 49aN

101aN 68aN

88aN 113aN 36aN 41aN

87aN 50aN

69aN 37aN 120aN

110aN

121aN 121aN

86aN

103aN 39aN 104aN

80aN

106aN 40aN

7.2 7.6

8.0 8.4

4.8 4.4 4.0 3.6

F2 (ppm)

F1 (ppm)

90 属が比較的容易に成功する。

一枚のDQF-COSYスペクトル上には、NH-CH領域だけでなく0 ~ 10 ppmにわ たる他の領域においても交差ピークが現れる。図39はDQF-COSYスペクトルのC H-CH領域を示している。この場合も、CHプロトンのピーク帰属が出来ていれば、CH プロトンの化学シフトが分かることになる。このようにDQF-COSYスペクトルは、交 差ピークを用いて同一残基内の水素原子の化学シフトを NH 基から順に側鎖の末端に 向かって決めていくことが出来るので、貴重な情報源である。特にタンパク質の構造を 考察する場合には、側鎖の水素原子間の距離情報が重要になる（残基間接触は多くの場 合側鎖間で起きる）ので、側鎖の水素原子のピーク帰属は大切な作業である。

図39 DQF-COSYスペクトルのCH-CH領域。F1軸がCHプロトン領域、F2軸がCH プロトン領域。図中の数字は残基番号、abはを意味し、CH-CHの交差ピークであるこ とを示す。図中のbbやgdは、あるいはを意味し、CH、CHあるいはCHプロトン 間の交差ピークであることを示す。交差ピークの強度が特に強いものは、残基がAlaなどで CHプロトンがCH3基である。

3ab 3bb

5ab

6ab

8ab 9ab

10ab 12ab

13ab

13dd

14ab

15ab 15bb

18ab 18bb

19ab 19bb

21ab

21gd

23bb

27ab

29ab

31ab

32ab

34ab 34bb

35ab 37bb

39bb

39ab

41ab

42ab

43bg 128gd

48ab 48bb

53ab

55ab

56ab 57ab

58ab

61ab

62ab 66bb

88ab 74ab

74bb

75ab

80ab

80ab

5gd

82ab

83ab

87ab 87ab

68ab

90ab 92ab

93ab 94bb

95ab

96ab 96ab

99ab 106bb

109ab

110ab 111ab

111bb

112ab

113ab

114ab 116ab

120ab

122ab

124ab

125ab

128ab

127ab

79gd 79dg

129ab 64bb

127bb

6bb

57ab

103ab

77ab

115ab 37ab

125ab

41ab

11ab

45ab

2ab 7ab

97ab

73ab

47bg 45gd

53bb

77bb

106ab

121ab

112gd 14,68,125gd

1ab 119bb

87bb

30bb 30ab

89bG

(ppm) 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2

(ppm)

4.8 4.4 4.0 3.6 3.2

4.4 4.0 3.6 3.2

2.8 2.4 2.0 1.6

F2 (ppm)

F1 (ppm)

91 31. ¹H-¹⁵N HSQCスペクトル

タンパク質の主鎖NH基のN原子を同位体の¹⁵Nで置換した試料を用いると、¹

H-15N HSQCという2次元スペクトルを測定することが出来る。スピンースピン結合した

2 スピン系のコヒーレンス移行を利用して交差ピークを得るという意味では COSY ス ペクトルの測定原理と同じである。ただし、HSQCのHはhetero nucleusの頭文字に 由来し、COSY が同種核であるプロトン間のコヒーレン

ス移行を利用しているのと違って、このパルスプログラム では、主鎖NH基内の異種核である¹⁵N核と¹H核との間 のコヒーレンス移行を利用している。HSQC パルスプロ グラムは図20に示されている。挿入図は主鎖NH基内で

のコヒーレンス移行と各スピンの展開時間を図示している。¹⁵N 核を Sスピン、¹H 核 をIスピンとして、パルスプログラムの流れを具体的に考察しよう。スピンIとSは異 種核なのでパルスは別々の発生器を用いて照射される。図20に示されたパルスプログ ラムのA期はIスピンに90_xパルスを打ってスピンエコーさせ、ˆ ˆ

x z

I S ^{というスピン状} 態を作り出す準備期間である。同時に生成されるˆ

Iyという状態は「位相回し」によって 消去する。つぎに、Iスピンにはy軸から、Sスピンにはx軸から90^{パルスを照射する} と、ˆ^状態はˆ ˆ

x z

I S ^から ˆ ˆ

z y

I S という状態に変わる。このとき、コヒーレンスは I スピン からSスピンに移行しているので、挿入図では¹Hから¹⁵Nに向かう青い矢印でそれを 示している。つぎに、ˆ ˆ

z y

I S をt₁^{時間展開すると、}Sスピンの歳差運動に伴ってcos



_St1



という振幅変調が掛かってt₁^軸をSスピンの周波数でラベルし、cos



_st1



I Sˆ_z ˆ_yという 状態になる（それ以外の項はFID信号として観測されない）。続いて両スピンに照射さ れた90_xパルスによってcos



_st1



I Sˆ_yˆ_zという状態に変化して、コヒーレンスが S ス ピンから再びIスピンに戻される。この操作をコヒーレンスバックと呼び、図中では¹⁵N から¹Hに向かう矢印で示されている。厳密な式は(22.4)に与えられた第1項であるが、

比例係数の違いは測定原理の説明には影響しないので無視する。パルスプログラムのE 期において、さらにスピンエコーを打って S 核をデカップリングしながらコヒーレン スが移った観測核¹HのFID信号を測定すると、t₂^{軸上には周波数}_I^{で振動するデー} タが得られる。このFID信号をフーリエ変換すると、2次元のスペクトルが得られ、交

C

_

C

15

N

(t

₁

)

(t

₂

)

1

H

ドキュメント内 タンパク質NMRの物理的基礎 : スピン状態の量子論から2次元スペクトル測定法まで (ページ 99-122)