氏 名 大住 隆太
授 与 し た 学 位 博 士 専攻分野の名称 歯 学
学 位 授 与 番 号 博甲第５９３６号 学位授与の日付 平成３１年３月２５日
学位授与の要件 医歯薬学総合研究科機能再生・再建科学専攻
（学位規則第４条第１項該当）
学位論文の題目 骨細胞Sclerostinの脱負荷に伴う分布域変化の解析
論 文 審 査 委 員 岡村 裕彦 教授 西田 崇 准教授 原 哲也 准教授
学位論文内容の要旨
論 文 内 容 の 要 旨 （ 2000字 程 度 ）
【緒言】
寝 た き り や 宇 宙 生 活 に 伴 う 機 械 的 負 荷 の 低 下 は 骨 量 の 減 少 を 引 き 起 こ す こ と が 知 ら れ て い る 。 機 械 的 負 荷 は 骨 量 を コ ン ト ロ ー ル す る 決 定 的 な フ ァ ク タ ー の 一 つ で あ り 、 骨 細 胞 が 、 機 械 的 負 荷 の 感 受 に お い て 重 要 な 役 割 を 果 た す 可 能 性 が 示 唆 さ れ て き た 。骨 量 の 低 下 を 引 き 起 こ す タ ン パ ク 質 の 一 つ と し て 骨 細 胞 特 異 的 に 分 泌 さ れ るSclerostin(Scl)が あ り 、 骨 の 代 謝 調 節 に お い て 、 骨 形 成 の 抑 制 因 子 と し て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 。 Sclは 脱 負 荷 に よ り 産 生 量 が 増 加 、負 荷 に よ り 産 生 量 が 低 下 す る こ と が 知 ら れ て い る 。ま た 、脱 負 荷 下 で はSclが 広 範 囲 に 分 布 し 、負 荷 下 で は 分 布 が 狭 い 範 囲 に 限 局 す る 。し か し 、機 械 的 負 荷 に と も な うSclの 分 布 の 変 化 に 関 す る 報 告 は 乏 し く 、 そ の メ カ ニ ズ ム は 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 、 本 研 究 で は そ の メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。
【 材 料 な ら び に 方 法 】
実 験 に は 、12週 齢 の 雄 性SDラ ッ ト を10匹 用 い た 。 右 側 の 坐 骨 神 経 、 大 腿 神 経 を そ れ ぞ れ 約5.
0 mm区 域 切 除 し 、 左 側 に は シ ャ ム 手 術 を 施 し 、7日 間 飼 育 後 、 潅 流 固 定 を 行 い 大 腿 骨 を 採 取 し た 。 右 側 大 腿 骨 をCut側 、 左 側 大 腿 骨 をControl側 と 定 義 し た 。Cut側 、Control側 の 骨 量 の 定 量 に はpQCT法 を 用 い 遠 位 骨 道 端 部 及 び 骨 幹 部 の 骨 量 を 評 価 し た 。Sclの 領 域 単 位 の 分 布 の パ タ ー ン は 、 大 腿 骨 骨 幹 部 の 冠 状 断 切 片 にScl抗 体 を 用 い て 蛍 光 免 疫 組 織 染 色 を 施 し 、 前 方 部 、 後 方 部 、 外 側 部 、 内 側 部 の4領 域 に 分 け て 、Scl抗 体 を 標 識 し た 蛍 光 色 素 (Alexa Fluor488)の 蛍 光 輝 度 及 びScl陽 性 骨 細 胞 の 割 合 の 定 量 に よ り 解 析 し た 。機 械 的 負 荷 に 伴 うScl分 布 の 変 化 が 生 じ や す い 領 域 を 特 定 後 、骨 細 胞 単 位 の 分 布 の パ タ ー ン は 、Scl抗 体 を10 nm径 の 金 コ ロ イ ド で 標 識 し 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 に て 骨 細 胞 内 、骨 小 腔 内 、骨 細 管 内 のSclを 観 察 し の 単 位 面 積 当 た り の 密 度 (金 コ ロ イ ド の 個 数/μ ㎡)を 定 量 し 、 評 価 し た 。
【 結 果 お よ び 考 察 】
Sclの 分 布 の 変 化 を 解 析 す る に は 、 骨 細 胞 内 、 骨 小 腔 内 、 骨 細 管 内 のSclを 免 疫 電 顕 法 で 観 察 す る 必 要 が あ る が 、電 子 顕 微 鏡 で 観 察 で き る の は 狭 い 範 囲 に 限 ら れ る た め ま ず は 、広 範 囲 に 骨 組 織 を 観 察 し 、機 械 的 負 荷 に 伴 いSclの 分 布 の 変 化 が 生 じ や す い 領 域 を 特 定 す る 必 要 が あ っ た 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 ラ ッ ト の 下 肢 神 経 切 断 モ デ ル を 用 い 、 蛍 光 免 疫 染 色 を 施 し た 骨 組 織 を 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 で 観 察 し 、機 械 的 負 荷 に 伴 いSclの 分 布 の 変 化 が 生 じ や す い 領 域 を 特 定 し 、 そ の 領 域 を 免 疫 電 顕 法 に て 観 察 す る と い う 計 画 の も と 実 験 を 行 っ た 。pQCTに て 、遠 位 骨 幹 端 部 は 、Cut側 で はControl側 と 比 較 し て 皮 質 骨 及 び 海 綿 骨 の 密 度 が 低 下 し て い た 。 骨 幹 部 で は 、 皮
質 骨 及 び 海 綿 骨 の 密 度 はCut側 、Control側 間 で 有 意 差 は な か っ た 。 し か し 、 大 腿 骨 で は 成 長 板 軟 骨 に 近 接 す る 海 綿 骨 が 脱 負 荷 に よ り 減 少 し や す い こ と が 報 告 さ れ て い る た め 、実 験 で 用 い た 下 肢 神 経 切 断 モ デ ル の 妥 当 性 が 証 明 さ れ た 。蛍 光 免 疫 組 織 染 色 で は 、蛍 光 輝 度 に よ る 解 析 か ら 、 Sclの 分 布 が 機 械 的 負 荷 に よ り 変 化 し や す い 領 域 が 大 腿 骨 の 外 側 部 の 領 域 で あ る こ と が 分 か っ た 。 そ こ で 、 外 側 部 領 域 のSclの 分 布 を よ り 詳 細 に 評 価 す る た め に 、Scl陽 性 骨 細 胞 の 割 合 の 定 量 を 行 っ た 。そ の 結 果 、外 側 部 の 骨 膜 側 に 近 接 す る 領 域 がSclの 分 布 の 変 化 が 生 じ や す い こ と が 分 か っ た 。外 側 部 の 骨 膜 側 に 近 接 す る 領 域 で 免 疫 電 顕 法 に よ る 解 析 を 行 い 、Cut側 で は 、骨 細 管 内 のSclの 密 度 が 優 位 に 大 き い こ と が 分 か っ た 。一 方 、骨 細 胞 内 、骨 小 腔 内 のSclの 密 度 に2群 間 に 優 位 差 が な く 、Sclの 産 生 量 の 変 化 が 分 布 の 変 化 に 与 え る 影 響 が 少 な い 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 過 去 の 報 告 よ り 、 骨 小 腔 内 、 骨 細 管 内 に は 体 液 が 存 在 し て お り 、 そ の 溶 質 の 輸 送 様 式 の 一 つ に 液 体 の 流 動 が あ る こ と が 明 ら か と な っ て い る 。筋 活 動 や 身 体 活 動 に よ る 機 械 的 負 荷 は 骨 組 織 の 変 形 を 生 じ 、 骨 小 腔 や 骨 細 管 内 の 液 体 の 流 動 を 引 き 起 こ す こ と が 明 ら か と な っ て い る 。 ま た 、 Scl等 の 大 き な 分 子 の 溶 質 の 輸 送 に は 、 体 液 の 流 動 に よ る 輸 送 が 必 要 と な る 可 能 性 を 示 唆 す る 報 告 が あ る 。以 上 の 報 告 、本 実 験 で 得 ら れ た 結 果 か ら 脱 負 荷 下 のCut側 で は 産 生 さ れ たSclは 骨 細 管 内 に 貯 留 し 、一 方 、Control側 で は 負 荷 が 加 わ り 骨 細 管 内 のSclが 体 液 の 流 動 に よ り 骨 細 管 外 へ 輸 送 さ れ て 消 失 し て い る と い う 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
【 結 論 】
機 械 的 負 荷 に 起 因 す る 骨 細 胞 のSclの 分 布 の 変 化 を 免 疫 電 顕 法 に よ り 解 析 す る こ と が で き た 。 脱 負 荷 に よ り 、Sclは 骨 細 管 領 域 に お い て 分 布 が 著 し く 、負 荷 に よ り 骨 細 管 領 域 の 分 布 が 減 少 す る こ と が 判 明 し た 。 そ れ は 、 転 写 ・ 翻 訳 レ ベ ル の 違 い に 加 え て 、 機 械 的 負 荷 に 伴 う 体 液 の 流 動 に よ る 輸 送 の 違 い が 関 係 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。本 研 究 に よ り 、機 械 的 負 荷 に よ るSclの 分 布 の 変 化 の 新 た な メ カ ニ ズ ム が 存 在 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
