素 関す 研究 酸化酵 筋 依 存性蛋白

1

．−コ

．．．¹¹

．．．．J．．^こ

．^こ

二

−

．．．J^こ

．．．．．^こ

．^ノ

■

．ヰ^字

．ト^攣

．H こ．^こ

．．^．

．．．．．^ニ

金沢大学 十 全 医学 会 椎誌 第94巻 第3号 44 仁45 6 く1 98 5う

心筋 ^Cy ^Clic ad e n o sin e 3^，_， 5^，一 m O n O ph o sp h^ate 依存 性 蛋 白^リン酸 化 酵素^に関 す^る研 究

II ． イヌ冠動^{脈 内 N 6 −2，．0 −di but yryl adeno sine 3，，5，−m O n O}ph^osph^ate

投与^の心 血行動態， 心筋 ^cy ^cli^{c a}den o sin e 3^，，5^，−m O n Opho sphate

依 存性 蛋 白リ ン酸 化 酵素に及ぼす 影響

金沢 大学 医 学部 内 科学 第^二講 座 く主_任こ竹 田亮 祐 教授I 東京 都養 育 院 付属病 院 内科

坂 井 誠

川銅口^{6 0}年³ 月^{2 9}日受 付1

4 47

N ⁶⁻2^，．0⁻d ibut yryl ade n o sin e 3^，，5^，−m O n Opho sphate L dib^ut y^ryl cyclic A M Pl の心臓に およ ぽ す 生理作用 を明ら^{か に}す る た め^に麻 酔 開 胸犬 の左冠動 脈口 に左 鎖 骨 下動 脈^{よ り}漂流し た G^{r e}g g の カ^{ニ ュ ー}

レを挿入 し， こ の回路よ り dibut y^ryl cyclic A M P を投 与し， 心 血行 動態， 心筋cyclic A M P 依存 性 蛋白 リン酸 化酵 素 活性^{に お}よ ぽ す 影響を検 討し た． 陽性 変 時^およ び変 力作用， 冠 血流 量の増加は投与後15 ^旬2 0 分で最 大と な り， そ^の効 果は投 与 後 少く と も 3 0 分 間持 続し た． ま た 1^{．2 旬1．}5 mglk_{g の}投 与量^で最 大^の効 果を認め た がく心拍 数 増加 軋 ^{4 1}％ニ最 大d Pldt増 加 乳 310 ％i 最大d PldtノP増 加率， 1 17％i 冠血 流量 増 加率^， 1 0 0％i 心筋酵 素消 費 量 増 加 乳 6 9％1， そ れ 以 上の投 与量では その効 果は^かえ^っ て減 弱し た．

d ibut y^ryl cyclic A M P投 与3 0分後の心尖部心筋を切 除し， 心筋^{ホ モ}ジ^ュネ^ー ト を作 製し た． その遠心 上 清を酵 素抽 出 液と し て Sephade x G⁻¹0 0 ゲルろ過を行^い， 心筋cyclic A M P 依存 性 蛋白リ^ン酸化 酵素を^ホ

ロ酵 素く不 活 性 型酵 熟 R Cl と c ataly tic s ubu nitく活 性型酵 象 CI ^に分離し た^． Sephade x G⁻1 0 0 ゲル ろ 過^によ る 蛋白リン酸 化 酵素 活 性^比く総 括 性に対す る活性 型酵 素^の比， ClくR C＋C11 は対照 0^．2 9 に対し，

dibut y^rylcyclic A M P 2 ， 4 _， 10 m gノk_g 投 与^の心筋^では活性型酵 素^の増加^によ り各々0⁻3 8， 0^．4 3， 0^．51 と増 加し た． 以 上 よ り d ib^ut y^ryl cyclic A M P の心臓 生理作用 は 心筋蛋白リン酸化 酵 素^の活性 化を通じて

発 現す る と考え ら れ た． こ の活 性型酵 素^の増 加は 心筋ホモジ^ェ ネ^ー トの額 粒 分 画よ り可 溶 性 分 画^への

tr a n slo c atio n によ る と推定さ れ た が，顆 粒 各 分 画く核^およ び サ^{ル コ レ ンマ}， ミト^{コ ン}ド リ ア， マイ ク^ロ ゾ^ー

ムl の蛋白リ^ン酸化酵 素活性は d ibut y^ryl cyclic A M P 投与群^{に お い}て は対照 と 比^べて変化な く， 精粒 分画

からの tr a n slo c atio n は 明 ら^{か で}は な^{か っ}た．

Key ^{w o r}ds カテ^{コ ー ル}アミ ン， Cy^Clic A M P， dibut y^ryl cy^clic A M P， 心 筋

cy^clic A M P 依 存 性 蛋 白^リン酸 化酵 素^， 陽性 変 力作 用

山般にべ プ チ ドホ ルモ ンやカテ^{コ ー ル}アミ ンがホル 発 現 す る^こと が 知 ら れている^り． cy^clic A M P は細胞 内

モ ン作用 を発現 す る際に， 標 的 細 胞でま ず ^ade nylate で蛋白リ^ン酸 化 酵 素^{の ホロ}酵 素^に作用 し， 二 つ の s ub⁻

cycla s e を 活性 化し， 細 胞 内^cy^clic ade n o sin e 3^，，5−^{， u nit の 一方の r egulato ry s ubu nitくRl に結 合し て活 性}

m o n opho sphate くcyclic A M P l 濃度^{の上 昇 を}介して 型のC ataly tic s ubu nitくC 沌 遊 離させ て酵 素 活性を 上 A b b_{r e v}iations 二 A D P ， ade n o sin e di_pho sphate三A M P _， ade n o sin e m o n opho sphateニA T P

，

ade n o sin e tri_ph o sphateニC ，C atal_{y t}ic s ubu nit of_pr oteinkin a s e三^Cy^Clic A M P，Cy^Clic ade n o sin e

3^，

，5^，−m O n Opho sphatei D BcA M P a nd dibut y^ryl cy^clic A M P ， N⁶⁻2^，．0⁻dibut y^ryl ade n o sin e 3^，，

5^，−m O n Opho sp h^ate三d Pl^dt，fir stde riv ativ e ofthelef_tv e ntric ula rp^{r e s su re}i d PldtlP ，the r atio

昇させる． その活 性化 反 応は次式のよ う^に考えられて いる^2籾．

R C 十CyClic A M P ^声R^．cyclic A M P^＋C さ らに こ の活 性型^のC がpho spho ryla s e kin a s e を は

じ め と し^て細 胞 内^の種々 の酵 素や構造 蛋 白を リ^ン酸 化 す ることによ^っ で情報を増幅 拡 大し て^{ホ ルモンの}生理 作用 を発 現す る と考え ら れ て^いる．

カ テ^{コ ー ル}アミ ン の心臓 生理作用 く陽性 変 力^およ び 陽性 変 時 作 剛 も 上述し た経 路を^へ て発現 す る が， 外 因性^にcyclic A M P を投 与し た場 合^には， そ^の細 胞 内

への非透 過性^のた め^に陽 性 変力 作凧 変 時 作用 は生じ 難^い4州 ．

一 方， CyClic A M P ^の誘 導 体^で膿 透過性が高 く， pho sphodie ste r a s e に分解さ れ難^い N⁶⁻2^，．0⁻di bu⁻ t yryl ade n o sin e 3^，， 5^，．m o n opho sphate くdi but y^ryl

cyclic A M Pl が in vi^{ir o8ト1 2 1}，in viv o^{1 3 1 1 4}1の動物心^に おい てカ テ^{コ ー ル}アミ ン類 似 作用 を 示 す^こと は すで に

報告さ れ， ショ ック^刷彗心不 全^{川潮 に}対す る臨 床応用 も試み ら れ て^いる． そこで著 者は， d ib^ut y^ryl cyclic

A M P の臨床 応用^の前 段 階と し て そ^の心臓生 理作用 を 明らか にす る た め^に， イ ^ヌ冠動 脈 内^にd ib^ut y^ryl

cyclic A M P を投 与し， 心 血行 動 態^{に お}よ ぼ す影響^お よ び 心筋cyclic A M P 依 存 性蛋白リン酸 化酵 素^の賦清 化との関係を解 明す る^こと を目 的と し^て以 下^の研 究を 行った．

材料およ び方法

体重 10 ^へ1 8 kg の雑 種 成犬 3 0 頭を用^い，カ ル シウム ベ ント^パルビ タ^ー ル3 0m gノkg の静脈 内投 与^によ り麻 酔し， 人 工呼 吸 下^に開 胸し た． 左冠動 脈口に左鎖 骨下 動脈よ り濯 流した Gr eg g の カ^{ニ ュ ー レ} を挿入 し， こ の 回路^およ び下行 大 動脈^に血流 計ブ^{ロ ー ベ}を装 着し， 電 磁 流量計 く日本 光電M F⁻4 6う^にて冠血流量， 大 動脈血 流量 を測 定し た^． 冠静脈 洞お よ び大腿動脈よ り経 時 的

に採血 し， 02含 量を測 定し た^．

心収 縮 力^の指 標と して左室 穿 刺^によ る内圧波形よ り 横 軸^に内圧P ， 縦 軸^に d PId^t， d P ld^tl P をオ^シロスコ

プ く三栄測 器2 G 511 上に ^一 種^のfo r c e v elo ci_{t y} lo op と し て描写さ せ， その最 大の高さ を最 大d Pldt_， d Pl dtノア と して測 定 記 録し た く図1 1^．

輸血 を行^い な が ら 左冠 動 脈 内^にd ibut y^rylcyclic

A M P投 与 後， 各 指標を経 時 的^に記録し， 3 0分 後心尖 都心筋を 切除し， 直ちに液体 窒 素で凍 結さ^せ た． 冷凍 保 存し た 心筋の前 壁^{の 一} 部を 重 量1 g 当た り 3 倍の

20 m M リン駿^{カ リ ウ ム} くpH 7．Ol， 5 m M E D T A，0^． 2 5 M 塩化^ナト リ^{ウ ム}， 1 m M テ オフ イリ^ンで 4^Dc 下^テ フ ロ ングラ ス ホ モ ジ^ナイ^{ザ ー で}均質^にし， 20分間 2 9，0 0 0^X g で遠 心 し， こ の上清を酵 素 抽 出液と し た． ニ

の酵素抽 出 液0^．6 ml を 2 0 m M リ ン酸 ^カリ ウ ム

， 5 m M E D T A，0．2 5 M 塩化ナ ト リ ウ^ム， 1 m M テオフ_ィ リ^ンで平衡さ^せた 0．9^X3 0c m のSephade x G−^{100 カ}

ラム に かけ 心筋蛋白リ^ン酸 化酵素 を 不活 性型酵素 くホ ロ酵 素， R C l， 活性型酵素 くc ataly tic s ubu nit．C l

F ig^．1^． Sche m atic pr e s e ntatio n of e xp^{e r}im e ntal p^{r e}p^{a r a}tio n of dog^．

T heleft c o r o n a ry a rte ry ^W a S p^{e r}fu s ed fr o m the

left s ubcla via n a rte ry thr o ugh the Gr eg g

，

s c a n n ula^．Co r o n a ryb lo od flo w くC B FI ^{w a s m e a s u r．}

ed b_y ele ctr o m agn eticflo w m ete rくN ih^{o n}Koh de n

M F 4 61 pla c ed i^{n t}he pe rfu sio n cir c uit． Ao rtic

flo w くA FI ^{w a s a}ls o m e a s u r ed at the th^{ol−a C}ic a o rta． o^xy g^{e n c o n}te nt of a rte rial a nd c o r o n a ry sin u sb lo od w e r e a n al_yz ed b_{y t}he o xy ge n c o nte nt a n al_yz e r くLe xing to nl^． A o rtic a nd left v e ntr⁻

ic ula r pr e s s u r eくA P ^{a n}d L V PI w e r e obtain edb y d ir e ct p^{u n c}tu r e withthe n e ed le c o n n e cted^tothe pr e s s u r etr a n sdu c e rくSa n ei Sokk i 18 0−^{4 1，a nd d Pl}

dta nd d PldtlP w e r ede riv ed bydiffe r e ntiatio n of L V P^．

of the r ate of ris e ^．of v e ntric ular pr e s s u r e to th e sim ulta n e ous left v e ntric ula r pr e s s u r ei E D T A ，eth_yle n edia min et^etr a a c etic a cid_三H R ，he a rt ratei R

， r eg^ulato ry ^{s u}bu nit of _p^roteiⁿ k in a s eニR C，holo e nz ym ^{e O}f _pr ot^ein k in a s e．