関す 研究 白 酸化酵 素 依 存性黄 筋

金沢大 学 十 全医 学 会椎 誌 第9⁴巻 第3 号 4 3 7 ⁻4 4 6 く198 5J

心筋 ^C y ^Clic ad e n o sin e 3^，， 5^，一m O n O Ph o sph ate 依存性 黄白^リン酸 化 酵素^に関 す^る研 究

I ． イ^ヌ心筋 cy^clic ade n osin e 3^，，5^{，−m O n O}_phosph ^ate 依 存 性 蛋 白 リ^ン酸 化 酵素の酵 素学的 性質

金 沢大 学 医 学 部 内科 学 第二講座 く主 任こ竹田亮祐 教 授I 東 京 都 養育^院付属 病 院 内科

坂 井 誠

く昭和6 0年³ 月2 9日受 付1

43 7

動 物 組織^に広 く存 在す る^cy^clic ade n o sin e 3^，，5^，−m O n Opho sphate くcy^clic A M Pl 依存 性蛋白リ^ン 酸化 酵 素^のイヌ心 筋^にお け る酵 素学 的性 質を検 討し た^． イ^ヌ心筋の ホ モジ^ェ ネ^ー ト を 2 9，0 0 0_{X g で}20 分 遠心 し，そ の 上清を硫 安 分画 し て酵 素標晶 と し た．蛋 白リン酸化 酵 素活 性の至適pH は 6 ^句 7 で_，特 性には 二価^の金属イ オ^ンを必 要と し， マグ ネ^シウムが最も有 効であった． そのkm 値は 0．7 mM で_，Cy^Clic A M P 添加^の有 無^で差を 認 め な かった． ヒ ストン のリン酸 化^に対す る^cyclic A M P のみかけのkm 借は 3 0nM で 5 X l O ^一色M で 3 倍の酵 素 活 性の上昇が み ら れ たの に対し， CyClic A M P 以外^の他の ヌク^レオ^シドでは 5 X lO−⁶M でcyclic A M P に近^い活性を 示 し た． 基質であ る^{ヒ ス}ト^ン， ア デノ シ ン三 リ^ン酸の km 値は そ れ ぞ れ10 0JLglml， 20J^LM で， CyClic A M P の添 加^の有無^で差を認め な か^った^{． ヒ ス}ト^ン以外の基 質と し て プ^ロタ ミ^ンを使用 し た場 合にはcyclic A M P 依 存 性 活性はヒ ストンの 114 であ^った． D E A E セ ルロ ^ー ズ カ ラム クロ マ ト グ ラフ ィ ^ーで蛋白リン酸 化酵 素は溶 出塩漬 度の違い によ り タ イ プ 王 と タ イ プ工1のア イソザ イム に分離す ること が知ら れて いる が， イヌ心筋 蛋白リン酸 化酵 素は 0．1 ^ル0．2 M の高^い塩濃 度で溶 出し，

タ イ プII で あ る^こと が 明 ら^かと な^った^． 以 上 よ り イ^ヌ心筋cyclic A M P 依存 性蛋白リン酸 化酵 素^の性 質は 他の動物 心^のそ れ と類 似し， そのア イソザ イ^{ム の}型 は^ヒト， ウシな どの大動 物^{心 と 一}致し た．

K ey ^{w or}ds 心 筋^cy^clic A M P 依 存 性 蛋 白^リン酸 化 酵 素^，基 質^{，M icha elis}定 数く^{K m}う^， 蛋 白^リン酸 化 酵 素ア イ ソ ザ イム．

Cyclj^{c a}de n o sin e 3^，， 5^，一m O n OPho sphate くcyclic

A M P l依存 性蛋白リン酸化 酵 素^は種^{々 の}蛋白を リ^ン酸 化す る酵素^で， CyClic A M P によ^っ て著明に活性が 上 昇 す る^． リ^ン酸化を う け るのは 蛋白 質^{の セ}リンま た は スレオ^ニ ン残基 と^いわ れて いる． 本酵 素は生理的濃度

の_cyclic A M P によっ て 賦宿さ れ， 広く動 物組 織^に存 在す ることからcyclic A M P によ るホ ル モ ン効 果は大 部分本酵 素^の活 性 化を通じ て 発 現 す ること が 示唆さ れ て き た^り． そ してその活性 化反応は次 式の如く，蛋白リ ン酸 化 酵 素の ホ ロ酵 素のs ubu nit の ^一 方のr eg^{u r a}，

to ry^{s u}bu nitくRl ^にcy^clic A M P が結合す る と， C atal⁻ y tic s ubu nitくClが遊 離す る た めにおこること が確 認 さ れ^てい る^2拗．

R C ＋cyclic A M P 2 R^．cyclic A M P ＋C 心筋組 織に おいても本酵 素はcyclic A M P の標 的酵 素と して， 種^{々 の}動物心^に存 在す る^こと は証明さ れて

いる が^{3 ト 5I}， イヌ心筋の本 酵 素^{につ い}ての知 見は乏し

い． そ^{こ で}著 者は イ^ヌを用^いたcyclⁱc A M P を介す る ホ ル モ ン の モデル実験^の基礎 的 検討と してイ^ヌ心筋^に

おけ る本 酵 素の酵 素学 的性 質を検討し た．

A b bre viatio n s ニA T P ， ade n o sine tri pho sphateニC， C atal_{y t}ic s ubu nit of _pr otein kin a s eニ Cy^Clic A M P ， Cy^Clic ade n o sin e 3^，_， 5^，−m On Opho sphate三^Cy^Clic C M P_， Cy^Clic cy tidin e 3^，， 5^，−

m o n opho sph ateニ^Cy^Clic G M P， Cy^Clic g^{u a n o s}in e 3^，， 5^，−m O n Opho sph Ateニ^Cy^Clic I M P

， Cy^Clic

43 8 坂

ま た 蛋白リ^ン嘩^{イヒ酵素には ア イソザ イムが存 在し，}

D E A E ^{セ ルロ ー} ズカラム クロ マ ト グラ フ ィ ^ー で溶 出 塩 濃度^の遠い によ り タ イ プ 工 と H の ア イ^ソザ イ^{ム に}分 離さ れ，種々 の性質が異な る^こと が判明 し て^い る^引． そ こ でイヌ心筋^の本酵 素^のア イ ソ ザ イ^{ム パ}タ^{ー ン につ い} ても検 討を加え た^．

材 料^およ び 方 法

1 ． イ^ヌJL^一筋cy^clic A M P 依 存 性蛋白リン酸化 酵 素

の調 製

雑 種成犬 を^{ベ ン}ト^{パ ル}ビ タ ^ー ル麻 酔^で開 胸 後， 直ち に心 臓を摘 出し， 心房， 小 血管を除^いた 心室 筋を 重 量 1g 当た り 5 倍の5 m M リ ^ン酸カ リ ウ^ム， 2m M E D T A くpH 7^．Ol ^で， 4 ⁰C下2 分 間^ワー リング ブ^{レ ン}

ダ^ー を 用^いて粉 砕した．2 9，0 0 0X g で 2 0分 間遠心 し て 得た 上清^に1 5m gノ山^の硫 酸プ^ロ タミ ンを添 加し， 10 分 間捷 拝 後 遠心 し た． 次にそ の 上清に3 2g川l の硫 酸 ア^{ン モ ニ}ウ^ムを加え，3 0分擾 拝 後 遠心 し た．沈 澄を¹0 0 倍 量^の5 mM リン酸カ リ ウム_， 2m M E D T A くpH 7^．01に溶 解し，

一 晩透 析を行い， その透析 液を酵 素標

品と し た．

一部の実験で は， こ の粗 酵 素標品 を さ らに 5m M リン酸カ リ ウム_， 2 m M E D T A くpH 7^．Ol ^で平 衡さ せ た 2^．6 X 40c m のD E A E ^{セ ルロ ー} ズ カ ラム で_，

O^ノー0^．3 M 塩 化ナ ト リ ウム直 線 勾 配 緩 衝 液^にて溶 出 し， ア イソザ イ^ムを分 離した．

2． cy^clic A M P 依 存性 蛋 白リン酸化 酵 素活 性の測 定

cyclic A M P 依存 性 蛋 白リ^ン酸 化 酵 素活 性の測定は K u o ら^7Iの方 法^{によ り}行った． 標 準の反応 溶 液は 5 0

m M 酢 酸ナ ト リ ウ^ム緩 衝 液くpH 6．01，5 m M 酢 酸^マグ ネ^シウム，5 m M フ ツ化ナ ト リ ウ^ム，0^．1m M E G T A，

0．1 m M r ^{3 2}P^．A T Pく2 0，0 0 0 cp^ml^{n m} oll， 2 m M テ オ フ イリ^ン，2 m glmi 子牛 胸線ヒ ストン_，2．5j^LM cyclic

A M P の存在ま た は非存 在 下^に酵 素 標品 を加え て総量 2 0 0〆l と し た． 3 0⁰C^で3 0分 間 反応さ せ た後， 4 ml の 5 ％ト リ ク^{ロ ー} ル酢 酸くT C Aう，0^．2 5％タ^ング^ステ^ン酸 ナ ト リ ウ^ム くN a2W OJ 液 くpH 2．0うを加え て 反応を と め た． 3 0 0 0rp^{m ，}1 0分 間で遠心 し た沈 瘡を1 N 水 酸 化ナ ト リ ウム くNaO H1 0^．1 ml で溶 解し， 再び T C A ，

Na2 W O⁴液を加え，1．2 N硫 酸0．1 ml を加え た，3 0 0 0

rpm で1 0 分 間 遠 心し， こ の操 作を も う ^一 度く り^かえ し た あ と，沈漆を 1 N NaO H 5 0J^Ll で溶 解し，10 mlの シ ンナレ ^一夕 ^ー 溶 液く7％トル エン_，3 0％ト リ ト^ンX −

in o sin e 3^，， 5^，−m O n Oph o sphatei ^Cy^Clic U M P_，

Cy^Clic A M P， N ⁶⁻2^，．0⁻dibut y^ryl ad e n o sin e

100 の混液¹1中に 4 g の P P O ，0^．1 g のP O P O P を含 むl を加え，液 体^{シ ン}チレ ^ー ショ ンカウ ンタ ^ーくPa cka^． rd， M ode1 3 3 851 ^にて測 定し た． 活性はpm ole s pi in c o rp^{o r a}tedlJ^Jg P^{r O}tein o r tubel mi n で示 し た． な お反応溶 液 中^に2⁻5J^JM な い し 5J^LM cyclic A M P を 加え た時の活性を総 括性と し， CyClic A M P を加え な

い時^の活 性との差をcy^clic A M P 依 存性 蛋白リ^ン酸化 酵 素活 性と表現 し た^． 蛋白量 は Lo w ry 法^{8 1}によ り測定

し た．

CyClic A M P 結 合能は G ilm a n^{9 1}の方 法によ り測定し た^．

y⁻

3 2p⁻A T P は A m e r sha m Se a rle 礼 子牛胸線^{ヒ ス} ト^ンは S igm a 社， D E A E ^{セ ル ロ ー} ズ は W hatm a n 社

から得た．

成 績

1 ． 酵 素清 性 測 定 条件^の検討 い 酵 素 量

酵 素量 をかえて蛋 白リ^ン酸化 酵 素 活性を測 定する と く図1j， CyClic A M P 添加^によ る 蛋白リ^ン酸 化酵素総 括性は 3 0_FEg ま で， CyClic A M P 非 添 加 時^の活性は 60 月 g まで活 性は直線 的^に上昇し た^． 従^って以下の実験 では 蛋白リ^ン酸 化 酵 素 活 性^の測 定^{に 1}0^へ30 _{声g の}蛋 白量 を 用^いた．

0

0 0

0 U

盲

O M

−

且

っ 一

三 m

要一

P 邑

Fig^．1^． T he effe ct of e n zym e c o n c e ntr atio n o n pr otein k in a s e a ctivit y^．

Pr otein k in a s e a ctivi t y ^{w a s m} e a s u r ed in the abs e n c e く中 ^一 書l o r pr e s e n c eく^{0 − 0}l ^of 2．5 J^LM

CyClic A M P． In c ubatio n c o ndi tio n s w e r e a s

de s c ribed in the te xt_，e X C ep tfo rthe v a riatio nin e n zym e c o n c e ntr atio n．

cy^clic urid in e 3 ^，，5^，−m O n Opho sph atei dibut y^ry1 3^，

， 5^，−m O n Opho sphatei E D T A ， eth_yle n edia min^． etetr a a c etic a cid_i E G T A ，eth_yle n e gl ^{yc ol bis} く伊^{a min o eth}yl etherト^{N，N ，−tetr a a C etic a cidi}

l

．■

．．

き

竜^サ

l

．■

．．

き

竜^サ

イ^ヌ心筋cyclic A M P 依存 性蛋白リ^ン酸 化酵 素^の酵 素学 的性 質

2 う 反応 時 間

蛋白リ^ン酸 化酵 素 活性を時 間を追^{っ て}調^べた成 績を 図2に示 す^{■ C}yClic A M P を加え な^い場合も， 加え た 場合も^{ヒ ス}ト^{ン の}リ^ン酸 化は 5 0 分 ま^でほ ぼ直 線的に

増加す る^こと が 示 さ れ た^． 従^って， 以後^の実験^では 反 応時間は15 分ま た は 3 0 分に設定し た^．

3 う 至適pH

蛋白^リン酸 化酵 素 活性^に対す るpR の影 響を調^べた 成績を図3 に示 す． リン酸緩 衝液^に比^べ酢 酸 緩衝 液^の 方が高^い酵 素 活 性を 示 し た． 両 横 衝 液と もcyclic

F ig^．2^． T he effe ct of in c ubatio n tim e o n pr otein

kin a s e a ctivit y^．

Pr otein k in a s e a ctivi_{t y} w a s m e a s u r ed ^{in t}he abs e n c eく^中一^{書l o r p}r e s e n c eく⁰ −⁰l ^{of 2．}5 F^LM

cyclic A M P． In c ubatio n c o nd i^tio n s w e r e a s

de s c ribed in the te xt_，e X C ep tfo r the v a riatio n in

in c ubatio n tim e． T he a mo u nt of e n zym e u s ed

W a S 2 0ノ^Jg^．

43 9

A M P の存 在下^で酵 素活性は約3借上昇し た^．至適pH は 6 ^{−1 7} であ^った．

2 ． 基質^およ びeffe cto r の濃 度と酵 素活 性 1 I ヒ ストン

基質であ る^{ヒ ス}ト^{ン の}濃 度を^かえ て蛋白リ^ン酸 化 酵 素活性を測 定し た成 績を図^{4 に}示 す． ヒ スト^ン濃 度が 0^．4 m gノmi ま で は 蛋白リ^ン酸 化 酵 素 総 活 性， CyClic

A M P 非 添加 時 晴性は と も^に上昇し た が， そ れ 以 上 の 濃度^では総活 性は減少し た． half m a xim al pho spho⁻ rylatio n から計 算し た k ^m 値は 1 0 0_FLglml で， CyClic

A M P ^の 有 無で差を認め なかっ た^． ま た V m a x は

cyclic A M P 添 加 時^{1 1．}4 pm ole s P iIJ^Lg p^{r O}t_einJ3 0 分， 非 添加 時2^．1 pm ole s P ilJLg p^{r O}tein130 分であ り，

cy^clic A M P 添 加^によ り酵 素と基 質^の親和 性は変 化せ

Fig^．3， T he effe ctofpH o n pr otein kⁱn a s e a ctivi_{t y}．

Pr otein k ina s e a ctivi t y ^{w a s m} e a s u r ed in the abs e n c e く^{書 一 争}l ^{o r} pr e s e n c e く^{0 − 0}l of 5_JLM

cyclic A M P u sing 50 ^m M s odiu m a c etate in

in c ubatio n mixtu r e a nd in the abs e n c eく^{b M l}l o r pr e s e n c e く^{ロ ー} 呵of5 J^LM cyclic A M P u sing 5 0

m M _pota s sih m pho sphateinin c ubatio n mi xtu r e．

In c ubatio n c o ndtio n s w e r e a s de s c ribed in the te xt， e X C ep tfo r the v a riatio n in pH of 5 0 m M

s odiu m a c etate a nd _pota s siu m pho sphate． T he a m o u nt of e n zy^{m e u s e}d w a s1 5 j^Lg^，

Km

，M icha elis^，s c 。n Sta nt 三P O P O P ，1，4⁻b is 仁²⁻く^{4，m eth}yl⁻5⁻_Phe nylox a z oyllコ^be n z e n eニP P O ，

2，5^，di_phe nylox azole三R， reg^ulatory ^{s u}bu nit ^of _protein kin a s ei R C _，holo e n zy^{m e o}f _p^{r o}tein

kin a s e三V m a x

， m aXim al v elo cit y ^of enzym e r e a ctio n^．