遺 伝 制 限 酵 断多 性 関 研 究 素切 塑 冠動脈硬化症 糖 尿 病 患者 蛋 白

金沢大学 十 全 医学 会 雑誌 第9 9巻 第3号 46 3 ⁻47 8 く1 9師

冠 動脈 硬 化 症^{な ら びに}糖尿病患 者^{に お} け る ア ポ リ ボ蛋白 遺伝^{子 の}制限酵^素切断多^塑性^に関^{す る}研究

金沢 大 学 医学 部 内科 学 第^二講 座 く主任^こ竹田亮祐 教 授う

伊 藤 英 葺

く平 成2 年4月2 7 日受 付う

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低比重リ ボ蛋 白lo w de n sit ylipopr oteinくL DU の 血中濃 度^の高^{い ヒ}ト や， 高比重リ ボ蛋 白h igh

de n sit ylipopr otein くH D Ll ^の血 中濃 度の低^{い ヒ}ト で は冠 動脈 硬 化 症の発 生 率^の高^{い こ}と が疫 学 調 査^に

よって明ら か^にさ れ て^いる^． 血 清 脂 質^{や リ ボ}蛋 白 漉 度は遺 伝 的影 響を受け て^いる が， 冠 動脈 硬 化 症の発 症^に関連し た遺 伝 的 背 景を調 査す る た め^に， L D L の主 要ア ポ蛋 白 B お よ び H D L の主 要ア ポ蛋 白 A I 遺 伝 子^に閲し た制 限酵 素 切 断 多塑 性 く^{r e str}ictio n fr agm e ntle ng th polym o rphis m ，R F L PJ を陳 旧性 心筋 梗 塞 患者5 7例， 対 照者6 4例を対 象と し So uthe r n blot 法^によ り検 討し た． ア ポ蛋 白A I の制 限酵 素 PstI切 断^によ る R F L P で は¹allele P lく2^．2 k iloba s e，k bl と allele P 2く3^．3k bl を認め た^． 両群 間で遺 伝子型^の分布^に有 意 羞を認め な かった． し か し P I P 2 症例では P I P l 症例に比 較して血清ト リグリ^セリ ド濃 度が有 意^に高 値であった^． 制 限 酵 素SstI 切 断で は ^allele S lく4^．5 k b，5^．7 k bl と S 2 く3^．2 k b，5^．7 k bJ を認め た． 対 照 群で は遺 伝^子型 S I S l 1 4例， S I S 2 3 6例， S 2 S 2 1 4例^に対し， 心 筋 梗 塞 群^では S I S 1 2 0例， S I S 2 3 4例， S 2 S 2 3 例^であ り^， 対 照群^に比較し て 心筋梗 塞群で は S 2 の出現 頻 度が有 意^に 低値であ^っ た^． 即ち， S 2 を有す る症 例^では心 筋 梗 塞を発 症しにくい可 能性が 示唆さ れ た^． ま た，S 2 の 出現 頻 度は欧 米の報 告よ り高く^この R E L P に は人種 差^の存 在す る も の と思わ れ た． ア ポ蛋 白 B の，

3^， 末 端の C O m Ple m e nta ry D N A を 用^いた解 析で は， 制 限酵 素 ^{Ec oR l} 切 断で は allele R lく^{1 1 k b}I と

allele R 2く1 3 k bI を， 制 限酵 素 M spI 切 断で は 2^．5 k b 未満の ^allele M l と 2^．5 k b 以上 の ^a11ele M 2 を 認め た が， これ ら の R F L P と冠 動 脈 硬 化 症と の関連は認め ら れ な かっ た^． 次^にリ ボ蛋 白代 謝 異 常症を合 併す る^こと の多^い糖 尿 病 症 例^においてこれ ら の R F L P の影 響を検 討す る た め^に， 糖 尿病 症 例4 9例と 正 脂 血症 対 照 者3 2例を抽 出し同 様^の解 析を行った． 対 照群で はallele P 2 の有 無で脂 質^レ ベ ル に差 異^を認 め な か^った が， 糖 尿 病 群で は P I P l 症 例と比 較し て P I P 2 症 例^におい て血 清総^{コ レ ス}テ^{ロ ー ル}濃 度が有 意^に高 値で あった． 糖 尿 病^{に お}け る高^{コ レ ス}テ^{ロ ー ル}血症に この R F L P の関 与が 示唆さ れ た^． 以上 よ り， 冠 動 脈硬 化 症や糖 尿 病^{に お}け る リ ボ蛋 白 代 謝 異 常症の遺 伝 的 素 因の検 索 法と し^てア ポ 蛋白A I 遺伝 子 R F L P が有用である^こと が 示唆さ れ た^．

K ey ^{w o r}ds c o r o n a ry he a rt dis e a s e， r e St^rictio n fr ag^{m e n}t le ng th _pol_ym o r⁻ ph is m _， ap^Oli_pop^{r o}tein A I， ap^Oli_pop^{r o}tein B

，d iabete s m ellitu s

疫学調査によ り冠 動脈 硬化 症の危 険 因子^には リ ボ蛋 重リ ボ蛋 白lo w de n sit ylipopr oteinくL D Lン^の血 中濃 白代謝異 常症^， 高血圧 症， 喫煙を は じ め多数の因子 が 度の高^{い ヒ} ト や ， 高比 重 リ ボ蛋 白h igh de n sit y

知_{ら れ て}いる^l，． リ ボ蛋 白 代 謝 異 常 症^の中で も， 低 比 1ipopr oteinくH DU の 血中 濃 度^の低い ヒトでは冠 動 脈

A b br e viatio n s こ ap^OA I， ap^Oli_pop^{r o}tein A I三 ^ap^OB_， ap^Oli_pop^{r o}tein B _i B M I， bod_y m a s s

inde x ニ^CD N A _， C O m ple m e nta ry D N A _三 C E T P ， Chole ste ryl e ste r tr a n sfe r p^roteinこ C H D，

C O r O n a ry he a rt dis e a s eニ E^{D T A}， eth_yle n edia min etetr a a c etic a cid 2 N a三 F H ， fa milial h_{y p}e r chole ste r ole m iai H D L，h igh ^{de n si}t y li_pop^{r o}tein三k b， k iloba s e p^air s三L C A T ，1e cith in

硬 化 症の発 生 率の高^{い こ}と， ま た， そ れ ら の治 療が冠 動脈 疾 患に よ る 死亡 率^を低 下さ せ た と^いう大 規 模かつ

長 期 的な研 究 成果 も報 告さ れ て^い る^{2 削．} ア ポ蛋 白B に は， 外 因性リ ボ蛋 白代 謝の中で重 要な役 割を担う ア ポ 蛋 白B⁻4 8 と内 因 性リ ボ蛋 白の主 要 構 成 成 分ア ポ蛋 白 B⁻1 00 の 2 種 類^のイ ソ蛋白がある^4I． ァ ポ蛋 白 B⁻1 0 0 は L D L の主 要ア ポ蛋 白で あ り，L D L 粒子 が L D L リ セプ タ ^一 に取り 込 ま れ る際^のリ ガ^ンド と し て の働き を 持って^いる^5，． ア ポ蛋 白 B⁻1 0 0 は分子量が大き く溶 媒 に不 溶 性^であること よ り， ア ミ^ノ酸 組 成， 蛋 白質と し て の物理化学 的 特性の解 析が遅れ て^いた^． し か し， ア ポ蛋 白 B⁻1 0 0 の 相 補 鎖 ^{D N A} くc o mple m e nta ry D N A ，CD N Al が ク^{ロ ー ン}化さ れ て以来^6川， ア ポ蛋 白

B⁻10 0 の遺 伝子^{レ ベ ル}で の解 析が可 能^{と なった− そ れ}

によ る と， ア ポ蛋白B⁻1 0 0 遺 伝子 は第2染 色体^の短 腕 遠 位 部 くp2 4r egi o nl^に存 在し ^脚 ，全 長 約4 3 キ^ロ塩 基 対 く^{k iloba s e pair s，k b}l で 2 9個の ^エク ソンに分か れ，

4 5 6 3個^のア ミ ノ酸を^{コ ー} ド し て^い る^{1 0l．} ア ポ蛋 白 B⁻1 0 0 は分子量 約512 0 0 0 で あ り，L D L リセブ タ^ー と の 結 合部 位の ア ミ ノ酸 組 成が ア^ルギ^ニ ン， リ ジン に富み 陽 性^に荷 電してお り^{1 1−}， そ の構 造が L D L リ^セ プ タ ^ー の陰 性荷 電と対応す る^こと が わ かっ た^引− ま た， ア ポ 蛋 白 B⁻1 0 0 と B⁻48 の違^いは，2 1 5 3番の ア ミ ノ酸の塩 基 配 列が肝細 胞よ り得ら れ た ^cD N A で はシトシ ン _，

ア デ^{ニ ン}， ア デ^ニ ンくC A Aナでグ^ルタ ミ^ンを^{コ ー} ド し て いる のに対し， 小 腸 細胞よ り得ら れ た ^cD N A で は チ ミン_， ア デ^ニ ン_， アデ^{ニ ン}くT A Aン^{の ス} トップコ ド ンと な る た めで^{1 幻1 ユ1 一} つの遺 伝子 か ら臓 器 特 異 性^に2 種 類の蛋 白が発 現す る も の であること が わ かっ た^．

一 方， H D L は末 梢組 織よ り余 剰の^{コ レ ス}テ^{ロ ー ル} を肝 臓^へ逆 転 送す る役 割を持ち， 冠 動 脈 硬 化 症の負の 危 険 因子^川 と さ れて いる． ア ポ蛋 白 A 工 は H D L の主 要 構 成 蛋 白であり， CD N A が ク^{ロ ー ン}化さ れ て^い る^{l 引}． ア ポ蛋 白A l 遺 伝子^均 は第1 1染 色 体， 長 腕 遠 位 部^珊にア ポ蛋 白C l工もA 工V 遺伝子^に隣 接し て存 在し^瑚，

18個の ア ミノ酸か ら な る プ^{レ ペ}プ チ ド と 6 個の ア ミ^ノ 酸か ら な る プ^{ロ ペ}プ チ ド が切 断さ れ て 2 4 3個の蛋 白と し て分 泌さ れ る^こと^{1 9，}， プ^ロ リンで始ま る2 2個^のア ミ ノ酸 配 列は^{ぽ ヘ} リックス構 造に合 致し， 極 性 部が リ ボ 蛋 白 表 面^に， 非 極 性郡が リ ボ蛋 白粒子中核^に位 置し，

この特 性は他の ア ポ蛋 白に お いて も認め ら れ ること^{2 0 ，} が わ かっ ている^．

ch ole ste r ol

冠 動脈 硬 化 症を発 症す る リ ボ蛋 白代 謝 異常 症の中^に は， 家 族 性 高^{コ レ ス} テ^{ロ ー ル}血症 くfa milial h_{y p}e r cb^．

01e ste r ole mia，F Hl²¹や 家 族 性複 合 型 高 脂血症^{2 2I} な ど の遺 伝 性 疾 患が含ま れ て^いる． F H は L D L リ^セブ タ ^ー の異 常^によ り高 L D L 血 症を呈す る疾 患であり，

分子遺 伝 学 的に解 明さ れ た症 例^詔Iもある が， 他の遺 伝 性リ ボ蛋 白 代 謝 異 常 症^{に つ い}て は多く が原 因_{不 明 で あ} る．

本 研 究の第1 の目 的は冠 動 脈 硬 化 症の発 症^に関連し た遺 伝 的 背 景を調 査す る た めに， L D L の主 要ア ポ蛋 白 B⁻1 0 0 お よ び H D L の主要ア ポ蛋白 A I に つ いての

制 限 酵 素 切 断 ^に よ る遺 伝子 多 塑 性 く^{r e str}ictio n

fr agm e ntle ng th pol_ym o rph is m ，R F L PJ を陳 旧 性心 筋 梗 塞 患 者と冠 動 脈 硬 化 症の ない対 照 者^{に お い}て比較 し， 冠 動 脈 硬 化 症お よ び リ ボ蛋 白 代 謝 異 常 症^に関連し た ^allele を検 討す る^こと である．

一 方，糖 尿病 患者^に は高 脂血症を合 併す る頻 度が高く^マ ク^ロ ア^ンギ オ^パ チ ^ー の進 展に関 与し て^いる^細． そ^{こ で}糖 尿 病の有 無で 分け ら れ た 2 群 間^{で こ}れ ら の をR^{F L P を調 査し， 糖} 尿 病 患 者^において リ ボ 蛋白 代 謝 異 常 症を発 現し や すい

allele を検 討す る^こと が第2 の目 的である．

対 象^およ び方 法

1 ． 対 象

心筋 梗 塞発 症 後3 ケ月を経 過し た症 例5 7例と冠動脈 硬 化 症の ないコ ント^{ロ ー ル}群6 4例 合 計1 2 1例を対象と し た． 心筋 梗 塞の診 断は臨 床 症 状， 心 電 図 変化， 心筋 由来 酵 素の 上昇に基づいて行^い， 冠 動 脈 造 影上7 5％以 上 の有 意狭 窄¹枝 以上有す る症 例を 選 ん だ^． ま た， 冠 動脈 硬 化 症を有し ないコ ント^{ロ ー ル}群は， 臨床症状が な く， 心 電 図 上 ダブ^ルマスタ ^ー負 荷で有 意^の S T T 変 化を 示 さ な^Vl症 例と し， 高 脂血症， 高血圧 症， 喫煙，

糖 尿 病， 肥 満^の有 無は問わ な^{い こ}と と し た^． ま た， コ ント^{ロ ー ル}群6 4例の中^には高 脂血症， 糖 尿 病を有さ な い正脂血 症者 群32例が含ま れ て^いた^{． こ の}群は． 早朝 空腹 時^の血清 総^{コ レ ス} テ^{ロ ー ル} 2 2 0m gノd l， 血清ト リ

グリ^セ リ ド 1 8 0^m gノdl 以下で あ る^こと と し た^．

II ． 方 法

1 ． 高 分子 D N A の抽 出

対 象者の末棺 静 脈血 を ^ethyle n edia min etetr a a c etic a cid 2 N aくE D T Al を抗 凝 固剤と し て採 取し，

−2 0^OC にて冷 凍 保 存し た^{． こ}の末 梢 血 を室 温^で解 凍 後I

a cyltr a n sfe r a s eニ L D L _， lo w de n sit y li_pop^{r o}tein三 M I， m y^{O C a r}dial iⁿfa r ctio町 R F L P ，r e Strictio n fr ag^{m e n}tle ng th _pol_ym o rph is 町 T C，tOtal ch ole ste r ol_三T ris， Tris E^hyd^．

r o xy^{m e}th_ylコ^{a min o m eth a n e}ニV L D L， V e ry lo w de n si_{t y} li_pop^{r o}tein

ア ポ リ ボ蛋 白遺 伝子^の制 限酵 素 切 断 多型性

Trito n X^，1 0 0 融 解 変 法^{2 5，に て}以下の よ う^に高 分子 D N A を単 離し た⁻ まず， 3 2 0m M シ ョ 糖， 1 ％

Trito n X⁻1 0 0，5m M M gC1²，1 0m M TrisE^{hydr o xy．}

r n ethylコ^{a min o m etha n e}くTrisl，pH 7．6 を含む融 解 液

にて赤血 球を溶 血さ せ， 遠 心によ り沈殿と し て白血球 を集め た^{． こ}れ を プ^ロ テ ア ^ー ゼく^シ グ^マ 社， ア メ リ 別 ^にて消 化 後， D N A を^フェノ ^ー ル^． ク^{ロ ロ ホ ル ム} く1ニり^{で 1} 回， 続^いて ク^ロ ロホル ム ^．イ ソ ア ミ^ル アル

コ ^ー ルく2 4ニリ^{にて 2} 回抽 出し， 最後^にエタノ^ー ル にて

沈 殿さ せ た^{． こ}う して得ら れ た D N A を 1 0^m M Tris，1^mM E D T A，pH 8．0に溶 解し，2 6 0^{n m} に おけ る 吸光度の測 定^によ り D N A 濃 度を求め たく^{E2 6 0mM ニ}5 0 声 gノmlナ^．

2^． So uthe r n ト ラン ス フ ァ ^ー

高 分子 D N A 5_JL g を 4種 類の制 限 酵 素 Pst I，Sst I，Ec oR I，M spIく宝 酒 造， 京 掛 1 0 ⁻5 0単 位を使っ て 12 ⁻2 4時 間消 化し，0^．8％ア ガ^{ロ ー ス}ゲ^ルく^{Pst I，Sst} 工，Ec oR l 消化の場 合ンお よ び， 1^．5％ア ガ^{ロ ー ス}ゲル

即^Sp 工消 化の場 合 い^こて電 気 泳 動を行っ た^■ そ の後

So utbe r n 法^{袖 に}準じ て以下の よう^にト ラン ス フ ァ ^ー

を行^った^． まず， 泳 動 終了後の ゲルを 0．5 M 水 酸化ナ ト リ ウ^ム，1^．5 M 塩 化ナ ト リ ウム溶 液^に浸し3 0分 間 室 温で ゆっくり振 遺さ せ， これ を 2 回行 うこと で D N A を変 性さ せ た^． 次^にゲ^ルを蒸 留 水で水 洗 後， 1 M Tris，1，5 M 塩 化ナ ト リ ウ^ム， pH 7^．4 の溶 液^に浸し，

30分間室 温^で2 回 ゆっ く り振 逸し中和し た． そ の後5 XS S C く^{s a}lin e s od i um Citr ate，2 0^x S S C の組 成は

4 6 5

3 M 塩化ナ ト リ ウ^ム．0^．3 M ク^エン酸3 ナ ト リ ウ^ムI^に て 1 度ゲルを洗い ， 1 5xS S C を使っ て平 均 孔 径0 ．2 声 m の ^ニト^ロ セ ルロ ^ー ス ^． フ ィ ルタ ^ー く^{シ ュ} ラ イ ヒ ヤ^{ー ．} シ ュエル社， 西独 い^こト ラン ス フ ァ ^ー し た，

ト ラン ス フ ァ ^ー 後の フ ィ ルタ^ー は室温で風乾し た後，

乾 熱機を使^っ て8 0⁰C で 3 時 間^ベイ キ^ング し， D N A を 固 定し た^．

3 ^． プ^{ロ ー} プ の作 成

ア ポ蛋 白 A I 遺 伝子 の制 限酵 素Pstl 切断 遺 伝子 ク

ロ ^ー ンが プ ラ^スミ ド pU C 8 に組み 込 ま れ た も の^{2 7I} を H u mphrie s らのグ^{ル ー} プく聖^マ リ ^ー医 科大 学， イ ギ リ ス1 ^から提供を受け た^{． こ}れ を塩 化カル シウ^ム法^{的 に} よ り大腸 菌E^．Coli K 2JM lO l 株^にト ラ^{ン ス フ ォ ー ム} さ せ た． この大腸 菌^{よ り アルカ リ}法によってプ ラスミ ド D N A を 回収し， 制 限酵 素 PstI 切 断後， 0^．8％ア ガロ ^ー スゲ^ル電 気 泳 動^にて分 離し た^．2^．2 k b の断 片を D E 8 1 の濾紙 く^ワッ ト^マン社， イ ギ リ^スI ^に吸 着させた 後， 抽 出 ^． 精 製し， これ を ア ポ蛋 白 A 工 遺 伝子 R F L P 用の プ^{ロ ー} ブ と し た． ア ポ蛋 白B^．1 0 0遺 伝子の cD N AくpB即を含む プ ラスミ ド^{2 9 1}は が ん研 究 振興 財団 リ サ ^ーチ リ ソ ^ー ス バンク通し て Br e slo w ら の グ^{ル ー} プく^{ロ ッ}ク^フェラ ^ー 大学， ア メ リ カ1 よ り提 供を受け た^． pB 8 は制 限酵 素 X ba，M spI によ^っ て切 断さ れ る 1 ．8 k b の部 分cD N A であり， ア ポ 蛋白B⁻1 0 0遺 伝 子 の 3 ^， 終 末 部^に相補 的 部 分で あ る^． これ も ア ガ^{ロ ー} スゲ^ル電 気 泳 動 後， D E 81 の濾紙^に吸 着^{さ せ}抽 出^■ 精 製し， ア ポ蛋 白 B⁻1 0 0 遺 伝子 R F L P 用のプロ ^ー プ と

Tab lel． Clinic al fe atu r e s a nd s e r u m lip id a nd H D L chole ste r⁻ 01 1ev els in 6 4 c o ntr oIs a nd 5 7 patie nts with m yo c a rdial infa r ctio n

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s mok ingく％l B M 工仕gノm^三っ T C く^mgJldll T G くm gノdり H D し C く^mgノdり

6 4 5 7

5 7^士1 3．8 5 7^，5 士8．2 5 3ニ1 9 3 5こ1 4

5 0％ 3 0％

9％ 1 9％

4 7％ 6 1％

2 1^．6 士3^．2 2 2^．6 士3^．0 1 8 5^士3 3 2 0 4 士3 3 1 2 0 士4 9 1 6 3 士5 9 4 4 士1 1 3 8 士9

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1 1 1 N S N S 0 0 N S N S N S 朝 刊 現 V alu e戸^{a r e m e a n 士 S D． D iabete sくD Ml a nd hy}p^{e rte n sio nくH Tl}

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