Title
Carrier identification and screening for patients with X-linked
adrenoleukodystrophy 1) Carrier identification of X-linked
adrenoleukodystrophy by measurement of very long chain fatty
acids and lignoceric acid oxidation 2) Very long chain fatty acid
analysis of dried blood spots on filter paper to screen for
adrenoleukodystrophy( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
井上, 恭子
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）乙 第1153号
Issue Date
1998-02-18
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/15119
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氏名 (本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 井 上 恭
子(岐阜県)
博 士(医学) 乙第 1153 号 平成10 年 2 月18 日学位規則第4条第2項該当
Carrieridentification and screening for patients with X-Linked
adrenoIeukodystrophy
l)Carrieridentification of X-]inked adrenoleukodystrophy by
measurement ofverylon9Chain fatty acids and‖gnoceric acid
OXidation
2)Verylong chain fatty acid anaJysis of dried bJood spots on fiJter
PaPer tO SCreen for adrenoJeukodystrophy
(主査)教授 近 藤 直 実 (副査)教授 岡 野 幸 雄 教授 清 島
満
論文内容の要旨 副腎白質ジストロフィー(ALD)は,伴性劣件退位性の脱髄性疾患で,ペルオキシソーム病のなかでは最も 頻度が高く,男児の新生児2∼数万人に1人が催患する｡臨昧亜型は小児ALD,思春期ALD,成人大脳型ALD, Adrenomyeloneuropathy(AMN),神経症状を伴わないアシソン嵐無症状軌 女性発症型,小脳脳幹型など に分類され,全てALD遺伝子の欠陥に基づいている｡最も多い小児ALDは.学童期に性格やわ動の変化 知能 低下 視覚や聴覚等の感覚障害などで発症し.数年以内に植物状態となって死亡する｡ALD逓伝子は.Xq28 locusにマップされ,この欠陥のため.ペルオキシソームにおいて梅長鎖脂肪酸(VLCFA)のβ酸化を触媒して いる1ignoceroyl(C24:0)-CoAligaseの活性が障害され.二次的に種々の組織や体液中にVLCFAが蓄積する｡ 患者や保因者は一般に血清のVLCFA分析で診断され,時に連鎖解析やALD遺伝子の変異解析も行われる｡治療 は,発症前または発症初期であれば,エルカ酸(C22:1)授乳 食事療法,骨髄移植などがある程度有効と報 告され,遺伝子治療も研究されている｡しかし,いずれも神経症状が進行した後では無効であり,保因者診断や 発症前診断が重要である｡ 申請者は血清のVLCFA分析と培養皮膚緑純射8川包におけるVLCFAのβ酸化活性比を組み合わせることによ り,ALD家系の保因者診断率の向上を試みた｡また,乾燥濾紙血を用いた簡便かつ安価なVLCFA分析方法を研 究し,ALDの発症前スクリーニングの可能性を検討した｡ 1.研究方法 1)血膚のVLCFA分析 血痛2mlにクロロホルムとメタノールを加えて室舶で1時間静置後遠心分離した｡J一面こクロロホルムと蒸留 水を加えて遠心分離し,最下層をとって禰層クロマトグラフィー(TLC)でスフィンコミエリン分画を分離,抽 出した｡メチル化した後TLCで脂肪酸メチルエステルを純化して抽出し,ガスクロマトグラフィーで分析した｡ 2)C24:0/C16 0酸化店憎比 線維芽細胞は芙瞼の1時間前に撫血清培養液に移し,弘田として放射性の[1-‖C]リグノセリン酸(C24:0)を 添加して反応を開始した｡37℃,5%CO2の条件下で1時間インキュベーションした後,培養上席をとり,蛋白と 未反応物質を除去して,分解産物の放射店惟を測定した｡対照活性としてミトコンドリアのβ酸化活性(C16: 0酸化活性)を同様の方法で測定し,両者の比を計算した｡ 3)家系分析 ALDの6家系について,血清のVLCFA分析とC24:0/C16:0酸化活性比を用いて,保因者を診断した｡ 4)乾燥濾紙血を用いたVLCFAスクリーニング法 ガスリー濾紙2コマに全血をしみこませ,乾燥したものを検体とした｡クロロホルムとメタノールに1時間浸し た溶出廠にクロロホルムと蒸留水を加えて総脂質を遠心分離した｡塩酸メタノールで1時間メチル化し,脂肪酸-171-メチルエステルを抽出した｡シリカ固相抽出カートリソジ(Sep-Pak)でVLCFAを簡易精製後,ガスクロマト グラフィーで分析した｡ 2.研究結果 1)血清スフィンゴミエリン中のC24:0/C22:0比は.ALD･AMN(n=31)で1.36±0.25(0.94∼1.88),女 性保因者(n=12)で0.99±0.22(0.64∼1.33),ALD･AMNl児の母(n=18)で1.10±0.24(0.67∼1.47),他の 女性家族構成員(n=21)で1.05±0.36(0.53∼2.10),nOrmalcontrol(n=155)は0.62±0.11であった｡0.84 (normalcontrol+2SD)以上は異常値と考えられ,全ての患者と女性保因者の75%は0.84以上を示した｡ 2)C24:0/C16:0酸化活性比(%)はt ALD･AMN(n=19)で13.7±4.7(6.6∼23.8),女性保因者(n=3) で17.8±4.7(14.9∼23.2),ALD･AMNl児の母(n=4)で29.0±9.7(16.4∼39.1),他の女性家族構成員 (n=4)で22.4±10.9(11.5∼36.9),nOrmalcontrol(n=24)は47.5±1l.0(26.7∼67.5)であった｡25.5 (normalcontroト2SD)以下は異常値と考えられ,全ての患者と女性保因者で異常値を示した｡この中にはVL CFA分析で正常値を示した女性保因者1例も含まれた｡ 3)ALD6家系で保因者の可能性のある女性11名を分析した｡血清VLCFA分析のみでは8例が保因者と判定され, 3例は正常の可能性が示唆された｡しかしC24:0/C16:0酸化活性比を組み合わせると.3例中2例は保因者であ ることが示され.1例のみが正常と判定された｡ 4)乾燥濾紙血を用いたスクリーニング法において,C24:0/C22:0比ほ.生後1週間∼lか月の児(n=21)で 1.6±0.2,1歳児(n=19)で1.3±0.1,2∼5歳児(n=27)で1.2±0.1,6∼15歳児(n=25)で1.3±0.1,ALDlO 人とAMN2人では1.8±0.2であった｡全ての患者と保因者7人中6人で1.5以上であった｡新生児ではほぼ半数で1. 5以上を示したが,2∼5歳児では全員が1.5以下でありt この年齢層では本法を用いたスクリーニングが可能であ ることが示唆された｡ 3.考察 ALD家系の女性保因者診断としては.-･般に血清のVLCFA分析が行われるが,この方法のみでは5∼15%の 偽陰性がみられる｡申請者は,線維芽細胞におけるC24:0/C16:0酸化活性比が保因者の診断率を向上させる かどうかを調べた｡ALDの6家系で保因者と診断された10人のうち,5人はVLCFA分析とC24:0/C16:0酸化 活性比の両者で異常を示し,3人は前者のみ,2人は後者のみで異常を示した｡従って.C24:0/C16:0酸化活 性比は,遺伝子変異が同定されていないALD家系においてVLCFAが正常である女性の保因者診断に有用と考え た｡また.ALD患者を発症前にスクリーニングするために.申請者は他の先天代謝異常症のマススクリーニン グに用いられている乾燥濾紙血を検体とし,ディスボーザプルの閻相カートリッジを剛､て抽出し,VLCFA分 析を試みた｡この方法では,年齢依存性があり,新生児期に偽陽性が多いという欠点もあるが,2∼5歳児を対象 としてカットオフ値を1.5とすれば,スクリーニング可能であった｡また,検体は全血100〟Lと少量で血清分離 も不要,取り扱いが簡単で郵送できる,固相カートリッジを剛､るため簡便かつ短時間で脂肪酸を抽出できる, などの利点があり.スクリーニングへの応用が可能と考えられた｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 井上恭子はVLCFA分析に線維芽細胞におけるC24:0/C16:0酸化活性比を組み合わせてALD家系 の女性保因者の診断率を向上させた｡またt 乾燥濾紙血を検体とし,固相カートリッジを用いた簡便なVLCFA 分析方法を研究し,ALDのスクリーニングの可能性について検討した｡この成果は小児科学ならびに先天代謝 巣常の研究の進歩,発展に少なからず寄与するものと認める｡ [主論文公表誌]
Carrieridentification and screenlng for patientswith X-1inked adrenoleukodystrophy
l)Carrieridentification of X-1inked adrenoleukodystrophy by measurement of verylong chain fatty acids andlignoceric acid oxidation
平成8年発行 ClinicalGenetics 50:348∼352
2)Verylong chain fatty acid analysis of dried blood spots on filterpaperto screen for
adrenoleukodystrophy
平成9年発行 ClinicalChemistry 43(11):2197∼2198
