討検 ( ) 発現転移能養株腫瘍細胞培け

(1)

ヒト腫

瘍

細胞培

養株

^における ^マトリックスメタ ^ロプ ^ロテナ∵ ^ゼ (^{M M P} ^s) ^の発現と転移能 ^に ^つ ^い ^て ^の検

討

金沢大学^{がん}研究所外科部 (^主任

^:

磨伊正義教授)

木田百合

( 平成

⁴

年1 月 22 日受付)

癌細胞

^の

転移

^に

は Ⅳ型^コ

^ラ

^ーゲ^ン

の

分解酵素が関与すると言われ

てい

るが, 現時点^{では}腫瘍細胞

^に

おける発現

^の

状態^および転移能と

^の

に

つ

いて

基本的情報^{が不}足して

い

る. そ

こで

Ⅳ型^コ

^ラ

^ー ^ゲ^ン

^の

分解酵素

^で

ある^マト

リ

ッ

ク

ス

メ

タ^ロブ^ロテ

ナ

^ー

ゼ

(^m ^a

^t

^rⁱ^x ^m ^e

^t

^a^ll^o

p

r o

t

ein a s e, M M P )‑²^,^{M M P}^‑³^, ^{M M P}‑⁹ ^{および}^メ

^タ

^ロ ^ブ^ロ

^{テナ}

^ー

^ゼ

阻織阻害国子 (

^t

ⁱ^{s s u e}ⁱⁿ^hibi

^t

^{o r} ^o^f

m e

t

allo

p

r o

t

ein a s e, T I M P)‑¹^, ^{T I M P}^‑²

^の

^{発現}^が^細胞

^の

^{転移能}

^の

指標^{となり}得^{るかを}検討す^る目的^で,

ヒ

ト腫瘍由来培養細胞株

26種

^に

^おけ^る

^ノ

^ー^ザ^ン法

^に

^{よる M M P}^s ^{と T I M P}^s

^の

^m ^{R N A}

^の

発現と鶏卵法

^に

^{よる}転移能と

の

比較を行った^. そ

^の

結果,

M M P^‑2

は

間英系細胞

^で

ほ 9株全例

^に

, 上皮系細胞

^で

は4/^{1 7}例

^に

発現がみられた. M M P‑^{9 は}間菓系細胞

^で

⁷/⁹例, 上皮系細胞では 2/^{1 7}^例

^で

^{発現}^{がみられ},

この二

者

の

発現^は閉業系^{と上}皮系

^で

有意な差^があった^. M M P‑³

^の

発現頻度^ほ低く, 間菓系

^で

1/⁹^例^, ^上^{皮系細胞}

^で

^は2/^{1 7}^例

^で

^あ^っ ^た^■ ^{T I M P}‑¹

^の

発現

^レ

^ベ

^ル

ほ細胞によっ

て

異なって

い

た. T I M P‑2 はほとんど

の

細胞^で発現が認められた^･鶏卵法

^に

よる転移は, 間英系細胞

^の

3/⁹^例^, ^上皮系細胞

^の

²/^{1 7}例

^に

認められた^. M M Ps と転移能と

^の

相関を検討^{したと}

^こ

^ろ, 間葉系細胞

^で

^は転移^{した}細胞^は全

^て

^{M M P}‑^{9 を}^{発現}^{して}

^い

^た細胞

^で

あ^ったが, 上皮系細胞

^で

は転移が認められた 2 株

^で

M M P^‑9

の

発現はなかった^. M M P‑², M M P^‑3

の

発現ほ

い

ずれ

^の

細胞株

^に

お

^い

ても転移能^と

^の

相関

^ほ

みられなかっ

た･間菓系細胞

で

M M P‑^{9 を}発現^し

^{てい}

^{たが}転移^{しな}

^い

細胞^{ほ T I M P}‑¹

^の

^{発現}^が^{高く} ^仁^逆

^に

高転移性細胞

^で

^{ほ 3} 例中2 例

^に

T I M P‑¹

^の

^{発現低下}^が^認^{めら}^れ^た^･ ^以^上

^の

^事^{から}間実弟細胞^{では M M P}L⁹

^の

発現昂進と T I M P^‑1

の

発現低下が転移能と関連する事が示された^. しかし^一方

^で

, M M P‑²^, ^{M M P}^‑³

^に

^つ

^{いて}

^は

^こ

^{れま}

^で

報告^{され}

^{てい}

^る転移能^と

^の

相関が必ずしも^一般的

^に

成立しな

い

事^が判明した^.

K ey

^{w o r}

d

s m

at

r

i

x m e

tallopr otei

n a s e s

(^{M M P}

^s

), t y P^e Ⅳ

c o

llag^{e n a}

^s

^e^, ti

s

u e

inhibito r s of

m e

t

a

ll

o

p^{r o}tein a s e (^{T I M P}^s)^, ^{C a}

^{n C e}

^r

^m

^e^t^{a S}^t

^{a S}

ⁱ

^s

^,

癌

^の

転移

^に

お

いて

細胞外^マト

リ

ッ

ク

スは癌細胞

^に

よる周辺敵織^へ

の

浸潤

^に

対する物理的障壁として働

^い

て

^い

る. 特

^に

細胞外

マトリッ

ク

ス

の

^一形態

^で

ある基底膜は癌細胞

^の

問質^へ

^の

浸潤^, 血管内^へ

の

侵入, 血管外^へ

^の

脱出

^の

際

^に

重要な障壁となっ

てい

る^{l ト 4)}^. 癌細胞

^の

基底膜^へ

の

浸潤

^に

^{はま}ず基底膜構成成分

^{のラ}

ミ

ニン_, ファイブ^ロネ

クチ

^ンなど

に

対し

て

癌細胞が ^{レセ}プ

タ

^ーを介し

て

接着し, 次

^に

そ

^の

接着部位

にて

細胞

^の

表面^{より}蛋白分解酵素を分泌^{し Ⅳ}型^コ

^ラ

^ー ^ゲ^ンなど

^の

主要構成成分を分解

し^{5 )8 )}, 最後

^に

癌細胞が移動し

てい

く, と

^い

う3段階説が考えら

れ

てい

る⁷⁾^.

細胞外^マ ^{トリ}ッ

ク

ス

の

構成成分を分解する酵素は多く報告され

て

き

てい

るが, なか

^で

も^マトリッ

ク

スメ

タ

^P プ^ロ

テナ

^ー

ゼ

(m a

t

rix m e

t

allo

p

r o

t

ein a s e s,M M Ps) と

^い

う^一群

^の

酵素群が重要

な役割を持^つと考えられ

^{てい}

る^{8 ) 9)}^. M M Ps ほ(1) 細胞外^マ

ト

リ

ッ

ク

ス構成成分^を分解す^る蛋白分解酵素^で,(²)

^{アミノ}

酸配列

^の

相同性を有し, (3) 活性部位

^に

^亜鉛イオ^ンをもち,(4) 前駆

体 (不活性型)

で

分泌され,(5) 特異的な阻害因_{子で}ある

メタ

^ロブ^ロ

テナ

^ー

ゼ

魁織阻害国子 (

^t

ⁱ^{s s u e} ⁱⁿ^{h ibi}

^t

^{o r s} ^o^f m e

t

allo

p

r o

t

aト

n a s e, T I M Ps)

^に

よっ

て

活性が阻害される^. M M Ps はそれぞれ

異なった基質特異性^{をもち}, Ⅳ型^コ

ラ

^ーゲン

の

分解

^に

関与する

の

ほ Ⅳ型^コ

^ラ

^ー ^ゲ

^ナ

^ー ^ぜ⁰⁾と M M P‑³(^ス

^ト

^ロ ^メ

^ラ

イ ^シ ^ン)^{1 1 卜 ■射}

で

ある^. Ⅳ型^コ

^ラ

^ーゲ

ナ

^ー

ゼに

は 7 2 キ^ロダル

ト

ン (kil^o Dal

t

o n,

k D)

^の

^{M M P}‑²⁽

⁷

^{2 k D} ^ゲ

^{ラチナ}

^ー

^ゼ

/^Ⅳ塑^コ

^ラ

^ー^ゲ

^ナ

^ー

^ゼ

)^{14 H 5)}と 9 2 k D

の

M M P‑9 (9 2 k D ゲ

ラチナ

^ー

ゼ

/ ^Ⅳ型^コ

^ラ

^ーゲ

ナ

^ー

ゼ

)^{1 6) 1 7)} ^がある. 研究

^の

初期

^{には}

^{M M P}←² ^{と M M P}T⁹

^の

^区別^{がさ}

れて

^い

な

^{いこ}

ともあったが現在はそれぞれ精製されそ

の

遺伝子が

ク

^ロ ^ー ^ニングされて

^い

る.

Ⅳ塑^コ

^ラ

^ー ^ゲ^ン^ほ基底膜

^の

主要構成成分であり, Ⅳ型^コ

ラ

^ーゲ^ン

の

分解

^に

たずさわる 3つ

の

酵素M M P^‑2,M M P‑³^, ^{M M P}‑⁹

ほ癌

^の

転移

の

際

^に

重要^な役割^{をはたし}

^{てい}

ると考えられて

^い

る^{t 8 )1 8 )}^. Ⅳ型^コ

^ラ

^ーゲ

^ナ

^ー

ゼの

発現は正常細胞では低く, 高転移

能を有する癌細胞で増加し²^嘲 , がん遺伝子導^{入など}

^に

^よって

A b br

e v

i

a

ti

o n s ‥

A T P, ade

n o s

i

n e

tri_ph

o s

ph

a

t

e

;

C

D N A ,

C O m

ple

m e n

t

a r

y D N A _; C

s

Cl,

C e S e

u

m C

hl

o

ri de; d C T P ,

d

e o x

y^‑

^C

y tidi

n

e t

r

i_ph

o s

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a

te; E D T A , ethyl

e n e

di

a m

i

n

et

e

t

r a

a

c e

ti

c

a

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id; E G F, epid

e r m a

l _g

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th f

a c

to

r

; G T C,

g

^{u a n}

idi

n

e thi

o c

y

^{a n a}

t

e

;Ⅰし1, i

n

t

e r

l

e

uki

n

^‑1_; k b, kil

o

b

a s e

pai

r

s; k D, kil

o

D

a

lt

o n

;

^m

R N A ,

m

e

S S e n

g

^e

^rR N A ; M M P

s

･

m a

tri

Ⅹ m e

t

a

ll

o

p

^{r o}

t

e

i

n

a

s

e

s

; M N N G, N ^‑

m

eth_yトN^･^‑

n

it

r o

^‑N ^‑

n

it

r o s o

g

^{u a n}

id in

e

; M O P S, 3^‑N ^〜M

o r

ph

o

l in ⁰^‑p

^{r O}

P^‑

(2)

生じた転移形質

^の

変化^{と Ⅳ}型^コ

^ラ

^ー ^ゲ

^ナ

^ー

^{ゼの}

発現^が相関する2 2 卜 2 T )

と報告されて

い

る^. また, 実験的^に再構成された基底膜

へ

の

がん細胞

^の

浸潤^ほ, キレ ^ー

ト

剤や Ⅳ型^コ

^ラ

^ーゲ

ナ

^ー

ゼに

対

する抗体を用

い

て Ⅳ塾^コ

テ

^ーゲ

ナ

^ー

ゼの

活性を阻害す^る

^こ

^と

^に

より抑制^{される}^{凶卜 3 0)}^と

^の

報告もある^. しかし

こ

れらほ ^一な

い

し数種煉

^の

高転移株

^に

おける結果

^で

あ^り, そ

の

細胞系^で言えた事がど

^こ

ま

で

^一般化

^で

きるか明らかではな

^い

^.

また M M Ps

の

酵素活性^を阻害す^{る T I M P}^s

^に

^は ^{T I M P}^‑ 1^{叩 2}}, T I M P‑²^{3 n 3 4 )}^が^{報告}^{され}

^て

^{おり}^,^{T I M P}r^l^,^{T I M P}‑^{2 と}^も

^に

性型 ^{M M P}^s ^と結合^し, 酵素活性を阻害する ^. そ

^の

うえ T I M P‑¹ ^{ほ M M P}^‑⁹

^の

^, ^{T I M P}^‑² ^{ほ M M P}‑²

^の

^{前駆体}^と^も¹ ^対

1 に結合^{しで}7 ) 3 5 卜 3 B)そ

^の

活性化を調節する^. よって M M Ps

の

活

性は M M Ps

の

活性型

^の

量ばかりでなく ^{T I M P}^s ^と

^{のバラ}

^ン ^ス

の

うえ

で

考えなければならな

^い

^.

以上

^の

よう

^に

腫瘍細胞

^に

おける M M Ps,T I M Ps

の

^一般的な発現

^の

状態, および転移能と

の

^に

^つ

^い

ては系統的な基礎的情報が不足^{して}

^い

^る

^の

^が現状

^で

ある. そ

^{こで}

今回著者は ,

M M Ps

の

発現は各種

^の

培養細胞^でど

^の

くら

^{いの}

頻度

^で

^{みられ} るか, そ

の

発現^ほ細胞

^の

種類や由来する臓器

^に

より特徴はあるか, など

の

M M P^s

^の

^一般的な発現

^の

状態^{および}転移能とそ

^の

発現

^の

相関

^の

有無を知り, M M Ps

の

発現は転移能

^の

指標となり得る

^の

か, を検討す^る為

^に

, Ⅳ型^コ

ラ

^ーゲン

の

分解

^に

関わる酵素^, ^{M M P}‑²^, ^{M M P}^‑³^, ^{M M P}‑⁹ ^{およびそ}

^の

^{阻害物}質,

T I M PT^l^, ^{T I M P}‑²

^の ^と

= 瞳瘍由来培養細胞株

^に

おける

m e s s e n

g

e rR N A (m R N A) 発現

^の

状態を調

^べ

^た^. ^{2 6}種 ( 間英系細胞⁹ 扶, 上皮系細胞^{1 7}株)

^の

細胞株を対象とした^･また鶏卵法

に

より転移能を測定^し, M M Ps

の

発現^と転移能^と

^の

培養条件

使用^{した}培養細胞^はす

^べ

て

ヒト

細胞由来

^で

ある^. 線維肉腫由来 H T l O 8 0, 骨肉腫由来 ^{M G}‑^{6 3}^, ^U‑^{2 0 S}^, ^{S K}‑^{E S}^‑¹^, ^{S A O S}^‑²^,

H O S, K H O S 3 1 2 H, M N N G/^{H O S}, 胃癌 ^{K A T O Ⅲ}, 大腸癌 C O L O 3 2 0, 膀胱癌 ^{T 2}

⁴

, 咽頭癌 ^H^e

p

‑² ^は

^{アメ}

^リ

^カ

^ン

^タ

^{イプ}

^カ

ル

チャ ^ー ^コレ

クシ

ョ社 (M ^a

y

la nd, U S A), N U G C^‑4 はJ^{C R B} 細胞

^バ

^ン

^ク

( 東京) ^{より入}手した. そ

^の

他

^の

細胞

^の

うち胃痛由来細胞 K K L S,N K P S ほ当教室^で樹立されたも

^{ので}

, N A K AJI M A,

S T‑^{K M} ^は, 神奈川^{がん}^セ ^ン

^タ

^ー ^, M K N 2 8 は福島医科大学一鈴木博士より供与をうけ^た^. 肺癌細胞^{P C}^‑³^, ^{P C}‑⁶^,^{P C}‑⁸^, ^{P C}^‑⁹^,

P じ 1 3,QG^‑5 6 は国立九州がん^セ ^ン

タ

^ー , 麻生博^{士より}供与^された^. 悪性織維細胞腰由来

^の

^{M F H}^b^{S T} ^ほ神奈川県がん

^セ

^ン

タ

^ー _, 矢野間博士より, 腎細胞癌 ^{K N 41} ^ほ, 金沢大学泌尿器科, 久住教授^{より}供与された ∴K M S^‑6 細胞は

^ヒ

ト胎児阻織^{より} 分離培養された線維芽細胞^であり, K M S T ほ K M S^‑6 細胞に腺照射^を行

^い

不死化させ樹立した培養絆^{8 }} ^で^, 兵庫医科大学,

難波博^{士より}供与^{された}^. ^{K M S T}^‑^{r a S} ^{は K M}芦^丁^{細胞}^に^{活性型}

c胡イ a S 痛遺伝子を導入して鱒^{質転換}^{した}^{細胞株}^で^{金沢大学}^が

ん研究所^{ウイ}

^ル

^ス都^田中博^{士より}供与された^. 以上

の

細胞はす

ベて

, 1 0% 非動化ウ

シ

胎児血清 (M ^. A^. B io

p

r odu c

t

s, W alke r s‑

ville,U S A),0.2m

g

/^m^l

^{カナ}

^マ^イ

^シ

^ソ( 和光, 大阪

^:

以下, 試薬煩で特

^に

記載

^の

な

い

も

^の

は当社

^の

製品を用

^い

た^. ) を含むダル

ベ _ッコ変法^イ ^ー ^グ

^ル

培地 (日水, 東京) を培養液とし, 炭酸ガス

培養器

にて

3 7 ℃, 5 % ^{C O}2存在下^で培養^{した}^､

Ⅱ. m R N A の解析 1 . 全 ^{R N A}

^の

抽出

直径1 5c m

の

細胞培養用ディッ

シ

ュ (F A L C O N, N

j^{e r s e}

y

,U S A)

^に

^て細胞^を培養^{しほぼ}^一面

^に

増殖した時点

で

採取

した^. 採取した細胞を 1 0^m M リソ酸緩衝液 (

p

ho s

p

ha

t

e^‑buffer‑

ed s alin e, P B S)

にて

2 回洗浄し, 2 0ml

の g

u a nid in e

t

hio c

y

a‑

n a

t

e 溶液 (^{G T C} 溶液) [^{4 M} ^G^{u a n}^idi^{n e}

^t

^hi^{o c}

y

a n a

t

e (^Fl^u^k^a,

Bu chs,S wi

t

z e rla nd),2 5m M

ク

^エン酸

^ナ

トリウ

^ム

,0^.5% N^‑

ラ

ウ

ロイ

ルサル

^コ

シ

ソ酸

^ナ

^{トリウ}

^ム

, 0.1 M 2‑

^{メルカ}

^プ

^ト

^エ

^{タノ}

^ー

ル

】を加えて, 十分

^に

懸濁する^. 懸濁した試料を 1 8 ゲ ^ージ

の

注射針^を十数回通^{して} .

D N A を分断する^･ポリ

ア

^ロ ^マ ^ー遠心

チ

ュ

ーブ(^ペッ

ク

^マンジ_ャバソ, 東京)

^に

^{1 0}^m^l

^の

塩化

^{セシ}

^ウ^ム

溶液 (c e s e um ch lo ride,CsCl) [5^.7 M CsC l,0^.1 M ^エ

チレ

ンジ

アミ

ン四酢酸 (^e

^t

^h

y

le n ed ia min e

t

e

t

r a a c e

t

ic a cid, E D T A)] ^{を入れ},

そ

^の

上

に

試料を重層する^. ^ペッ

ク

^マンS W 2 7 スイング^ロ ^ー

タ

^ー

(^ペ ^ッ

^ク

^マ ^ン^ジ^ャ^バ ^ソ)

^{にて}

^, ^{2 0 ℃}^, ^{2 7}^,^{0 0 0}^r

^p

^m ^, ^{2 2}時間超遠心後, 上清^{を D N A}

^{のバ}

^ン ^ド

^の

^下^ま

^で

^{除く}^. ^C^s^Cl ^層

^の

^{液面}^{より}^少

し上

でチ

ュ

ーブを切断し, 液を除く^. R N A

の

沈澱を 7 0% ^エ

タノ

^ー

ルで

すす

^い

^だ後, 沈澱^を､¹ ^m^l

^の

^{蒸留水}^に^{溶解}^{した}^. ¹/^{1 0} 容量

^の

3 M 酢酸

^ナ

トリウ

ム

緩衝液 (

p

H 5 ^.5) を加え, 次

^{いで}

2.5容量

^の

^エ ^タ

^ノ

^ー

^ル

^を加^え,

一郎 ℃

^に

2 0分放置し^エ

タノ

^ー

ル

沈澱を行^った ^. 沈澱を 1 ^ml

の

Tris E D T A (^{T E}) 【^{1 0}^m ^M

t

ris.^h

y

dr o x

y

m e

t

h

_y

l‑^{a m}ⁱ^{n o m} ^e

^t

^h^{a n e} ^{( T}^rⁱ^s⁾‑^{H C l}

^p

^H ⁸ ^■⁰ ^, ¹^m ^M

E D T A

p

H 8^.0]

^に

溶解^し, 2 6 0n m

の

吸光度^を測定し総R N A 濃度を求めた^.

2. m R N A

の

抽出

9 0

F

^Ll

の

全R N A

に

対し

て

1 0

F

Ll

の

割合^{で 5 M} ^N^a^{C l を}加^え^,

こ

れ^{を 6}^m

g のオ

リ

^ゴ

ー^{d T} ^セ

^ル

^ロ ^ー ^ス⁽^フ

^ナ

^コ

^シ

^, ^{東京)} ^と^混合

し室温

^で

1 時間ゆっくり振とうし

て

mR N A をセ

ル

^ロ ^ース

に

吸着させた. 次ぎ

^に

遠心し

^て

得られた沈澱を 0^.1% ドデ^シ

^ル

硫酸

ナ

ト

^リ

ウ

ム

(^{s o}^di^u ^m ^d^o^d^{e c}

y

ls ulfa

t

e,S D S)

^に

溶解し3 7 ℃

で

5分間反応させ

て

吸着して

^い

る皿R N A を溶出^{させた}^. 最後

^に

遠心し

て

セ

ル

^ロ ^ースを除き, m R N A を含む上清を回収した^.

3 ^.

ノ

^ーザンブ^ロッ

テ

ィング法

1 検体

^に

^つき全R N A 2 0

F

L

g に

相当する m R N A を用

^い

,

こ

れを 5 0%

ホル

ム

アミ

ド(

^{ナカラ}

^イ

^テ

^ス

^ク

^, 京都),1 7^･5%

^{のホル}

マリンを含む 2 % 3‑^N‑^M^{o r}

p

holin o^‑

p

^{r O}

p

a n e S ulfo nic a cid (^{M O P S}) (

p

H 7.5)

^に

溶解^{し6 5 ℃}

^で

^{1 0}分間反応さ

せて

m R N A

^の

高次構造を崩した後^, 1^.0%

^ア

^ガ^ロ ^ー

^ス

^ゲ

^{ルに}

^{て 2} % M O P S中

で

電気泳動^を行った^. 泳動終了後

^の

ゲ^ルほ 1 0 Ⅹ S^alin e s od iu m ci

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