イヌ血管系腫瘍に関する病理学的研究

Title

イヌ血管系腫瘍に関する病理学的研究( 内容の要旨

_{(Summary) )}

Author(s)

米丸, 加余子

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第221号

Issue Date

2007-03-13

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/21404

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

氏 名(本籍) 学 位 の 種 類 ･学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 (17) 米 丸 加余子(愛知県) 博士(獣医) 獣医博甲第221号 平成19年3月13日 学位規則第3条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 岐阜大学 イヌ血管系腫瘍に関する病理学的研究 主査 _{岐 阜} 大 学 教 授 副査 帯広畜産大学 教 授 副査 岩 手 大学 教 授 副査 東京農工大学 教 授 副査 岐 阜 大 学 教 授 昭 峯 助 敏 嗣 利 高 幸 国 章 木 井 田 森 尾 柵 松 岡 三 丸 論 文 の 内 _容 の 要 旨 血管肉腫は血管内皮細胞由来の零軽度瘍であり,局所浸潤や転移が高率に見られ, その予後は不良である0動物では,イヌの牌臓,右心耳や皮下織に好発する｡様々な 治療方法が試みられているものの,平均生存期間は6ケ月未満とされる｡血管肉腫の 異常増殖メカニズムは未だ解明されておらず,異常増殖メカニズムを解明することは 有効な治療法開発への足がかりになると思われる｡本研究では,血管肉腫を含むイヌ の血管内皮腫瘍における増殖と増殖因子の関連を免疫組織学的,分子病理学的手法を 用いて検索した｡続いて,イヌの血管内鹿において,腫瘍抑制遺伝子経路であるpガ およびRetinoblastona(m)経路の異常の意義を検討した｡ 第一章では,イヌ血管肉腫の増殖と進展における増殖因子(血管内皮増殖因子VEGF, 塩基性線維芽細胞増殖因子bFGF)およびそれらレセプター(flt-1,flk-1およびflg-1) の関連を検討した｡イヌ血管肉腫および血管腫におけるⅤ払Fとそのレセプター(flt-1 およびfl太一1う,さらにbFGFの局在を免疫組織化学的に解析した｡加えて,相聞ガ=, f〟トリおよびflgづ(bFGFレセプター)のmRNAの発現をRT-PCR法およびムヮ

ー226-hybridization法を用いて検索した｡その着果,血管肉腫の腫瘍細胞でVEGF,bFGF, flt-1およびflk-1の発現が見られ,それらの発現は血管腫に比較して強度であった｡ 同様に,血管肉腫においてRT-PCR法で搾研￡行-J,〟慮-ノおよびガg-Jの発現が認 められ,ISgにおいても血R他の局在はタンパク質の局在に→致した｡flト1の発現強 度が高い血管内鹿群ではEト67陽性率の平均値がflk-1発現強度の低い血管肉腫群の それに対して有意に高値を示した(アく0.001)｡一方,血管腫の腫瘍細胞には増殖周 子レセプターの発現は見られるものの,増殖因子の発現はタンパク質,mRⅣAともに見 られなかった｡これらのことから,血管内皮増殖因子とレセプターの両方の存在によ る _{autocririe/paracfine機構がイヌ血管肉腫の春牲増殖に関与しており,特にflk-1} の発現がイヌ血管肉腫の高い細胞増殖活性に関与していることが示唆された｡また, bFGFとそのレセプターであるflg,1も腫瘍細胞中に苛められ,これらもVEGFおよびそ のレセプターと同様,イヌ血管肉腫の悪性増殖に関与している可能性が示唆された(第 一章)｡ 第二章では,2つの主要な細胞増殖抑制系であるクよヲ経路および必経路の異常の関 与を明らかにするために,イヌ血管肉鹿と血管建においてp53,Rb,リン酸化Rb,p16 およびサイクリンDlの発現を免疫組織化学的に検索した｡またpよタ遺伝子のDNA結合

額域(eヱOn 4-8)とプロモーター領域の変異について PCR-Single stfand

co皿formationalpolynorphiszn(SSCP)法,もしくはPCR-direct sequencing法を用い て検索した｡さらにリアルタイムRトPCR法によりサイクタン朗mRM.の定量も行った｡ その結果,血管肉腫では17.9%で鹿瘍細胞の核内にp53陽性像が見られたものの, PCR-SSCP法,PCR-direct _{sequencing法いずれにおいても変異は認められなかった｡} 一方,血管肉腫においてRb,リン酸化RbおよびサイタリンDlの平均標識率(それぞ れ53.0%±13.8 S.D.,27.3%±9.8S.D.および25.6%±9.4S.D.)が血管腫(いずれ も1%以下)に比べて明らかに高値を示し,またサイタリンDl陽性例の7併中4例で mRNAの過剰発現も欝められた(甜月野 山RNAの10倍以上)｡さらに血管腫では全例で p16の強い発現が見られたものの,82%の血管内鹿でp16発現の減編もしくは消失を示 した｡これらのことから,イヌ血管肉腫の病理発生においてはpお経路の異常の関与 は低く,〆かサイクタンβノー必経路の変化が蘭与していることが示唆された(第二章)｡

ー227-本研究により,イヌ血管肉腫の発生には〆伊サイクタン1甘用鋸陸路の変化が関係し ており,発生した腫瘍の増殖には血管内皮増殖因子とレセプターの両方の存在による autocrihe/paracrine機構が辟与することが示された｡ 審 査 結 果 の 要 旨

血管肉腫は血管内皮細胞由来の悪性腫瘍であり,様々な治療方法が試みられているも

のの,平均生存期間は6ケ月末満とされる予後不良の腫瘍である｡これは血管肉腫の発 生,増殖促進および維持メカニズムが未だ完全には解明されていないことに起因してい ると考えら打る｡本研究は,イヌ血管肉腫の発生,増殖メカニズムあるいはそれらに関 連する因子について検索し,イヌ血管肉腫の治療法開発の足がかりとなる知見を得るこ とを目的とした研究である｡ 第一章では,イヌ血管肉腫における増殖因子の関与を明らかにするために,血管肉腫 と血管腫において増殖因子(血管内皮増殖因子ⅧGF,塩基性線推芽細胞増殖因子bFGF)

とそれらレセプター(flト1,flk-1およびfl㌻1)の発現を検索し,両者の比較検討を

行った｡その結果,多くの血管肉腫の腫瘍細胞で増殖因子とそのレセプターの発現が見 られ,その発現は血管腫に比較して高かった｡またⅧGFとそのレセプターであるflt-1 とflk-1のタンパク質と嘘削Aの発現局在が一致した｡一方,血管鹿ではレセプターの 発現は見られるものの,増殖因子の発現はほとんど見られなかった｡さらにbFGFめ発 現もⅧ伊の発現状況と一致し,またレセプターである研の曲の局在はbFGFタ ンパク質と｢敦した｡以上より,血管内皮増殖因子とレセプターの両方の存在による autocrine/paracrine機構がイヌ血管肉腫の悪性増殖に醒与しており,また,bFGFとそ

のレセプターであるflg-1もVEGFおよびそのレセプターと同様,イヌ血管肉腫の零性

増殖に関与している可能性が示唆された｡ 第二章では,2つの主要な細胞増殖抑制系であるpガ経絡および彪経路の不活性化 がイヌ血管肉腫の発生に関与しているかを検討した｡その結果,血管肉腫では免疫染色 において17･鍋でp53陽性であったが,遺伝子検索において変異は静められなかった｡

血管肉腫ではRb,リン酸化RbおよびサィクリンDlの標識率は血管腫に比べて明らか

に高値を示し,また免疫組織化学的にサイクリンDl瘍性例の7例中4例ではサイクタ ン以ボNAの過剰発現も罷められた｡さらに血管腫では全例でp16の発現が見られたも のの,血管肉腫では82%でp16発現の減弱もしくは消失が見られた｡以上より,イヌ血 管肉腫の病理発生においてはpガ轟路の異常の関与は低く,〆伊サイクク/及卜必経 路の変化が関与していることが示唆された｡ 本研究により,イヌ血管肉腫の発生には〆㌻ゲイクタン及卜必経路の変化が朗係し ており,さらに,発生した腫瘍の増殖には血管内皮増殖因子とレセプターの両方の存在 によるautocrine/paracrine機構が関与することが示された｡これらは,血管肉腫の新 しい治療法朋発の可能性を示唆しており,動物医寮のみならず医療分野においても多大 な貢献が期待できる｡

-228-以上について,審査委貞全貞一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位 論文として十分価値があると認めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目 Exp托S血n _{ofva駆山野e鵬0血eli山野Ⅳ血如叫basic点broも1ast}

辞℃W血色功恥皿d也血邸甲b指(払1,且bl,弧=せ1)hc血

Ⅶ山群山mors 著 者 名 ‥ _{%nemaru,K.,Sakai,H.,M血mi,M.,Ⅵmai,TandMase或} 学術雑誌名:Ⅵteri71aryPathology 巻･号t頁･発行年:43￠):97ト9帥,2006 2)廣 目 著 者 名 学術雑誌名 巻･号･発行年 既発表学術論文 Ⅰ)寧 日 著 者 名

The _{signiBc皿Ce Of p53 and retindblastoma padlWaySin c弧ine} b引n喝0脚℃Oma

Ybncmaru,K.,Sakai,H.,Murakami,M.,Ko由ma,A､,Mori,Tl,

Yimai,T,M∬uO,K.andM郎egi,T. TheJournalofVtterinaryMedicalScience

69(3):2007

Establishment _of a new _{cahine cel11ine(CCT)}

Originated from a cut8neOuS _malignant histiocytosis

Sakai,且,Nakano,H.,Yamaguchi,R.,Ybnemaru,K.,Ⅵmai,Tl 皿dMase由,T. 学術雑誌名:TheJournalofVbterinaryMedicalScience 巻･号･貫･発行年:65(6):73ト735,2003 2)題 目 GallbladderadenuBLrCinomasintwocaptiveA蝕anlions (加納g叩由〃) 著 者 名 _{Sakai,H.,Ⅵmai,T.,Ybnemaru,K.,Hirata,A.andMasegi,T.} 学術雑誌名 :TheJournalofZooWildlifeMedicine 巻･号･貢･発行年:34(3):302-306,2003 3)題 目 著 者 名 R血虞適omyosmnaha免汀威(触おねク畑わ血力和) Sakai,H.,Mafuyama,M.,Hirata,A･,Ybnemaru,K･,Yin由,Tl皿d Masegi,工 学術雑誌名 TheJournalofVtterirLaryMedicalScience 巻･号･貫･発行年:66(1):95-96,2004 4)題 目 著 者･名 学術雑誌名

Proven扇cularadenocarcinomaina HⅦmboldt _{penguin(卿en由cw}

hzmlboLdH)andagreathomedowl(Bubov吋nianzLS)ミidenti石caticnof 町iginbymucinhist∝hemistry Ybnemaru,K.,S承ai,H.,Asaok?,Yl,Yin8i,T.,Fukushi,H., 恥ね且abe,K.,Hirai,K.andMasegi,T. AYimP血0logy 巻･号･貢･発行年:33(1):77-81,2004

-229-5)唐 目:Evressionofmyogemicregula血ghctors,hlyogeninandMyoD.in twocaminebobyoidrhabdomyosarcomas 著 者 名: _{Ⅹob野お帆MりS血塊H､,H如吼Å.,Y血旭m訂叫E.,Ⅵm由,T,W鋤血晦} ■K.,Y独仏ZOe,】こ,KuれT鉦IdM鱒e或工 学術雑誌名 ⅦterinaryPathology 巻･号･貢･発行年:41(3):275-277,劫04

6):題 目 Assessment _{ofproliferative potemials ofcanine osteosarcomas･and}

著 者 名 学術雄藩名 巻･号･貢･ 7)題 目 著 者 名 学術雑誌名

Chondrosmmas by MB-1immunohistochemis町 and

bromodeoxymidineincorporation Ob吼J.,S血痕E.,監誠晩S.,Hirぬ,A.,1わnemanl,軋,勒A., Ⅴ叩鴎丁如dM由e由,T TheJoumalofComparativePath0logy 発行年:131(り:18-27,2004 MorphologicaJand血tmohist∝hemicalfeatureSOfO紳r誠zLm α血刀fhGa競1e Mastno,K.,Ⅵmai,Tl,Hiraia,A､,%nemaru,K.,Sakai,H.,Satoh,M., Masegi,TlandNakai,Y VbterinaryPath0logy 巻･号･貢･発行年:43(2):202-207,200占