移植 関す 実験的研究 膵 島 保存 門腋内

5 6 金沢 大 学 十 全 医学 会 雑 誌 第8 6巻 第1 号 56 ^‑7 3 (1 9 7 7)

膵^{ラン ゲ ル ハ ン ス}島^の保 存^{お よび そ の}門腋 内 移植^に関 す^る実 験 的 研 究

金 沢 大 学 医 学部 第2外科 学 講座 ( 主任^: 宮 崎速 夫 教 授)

山 崎 軍 治

( 昭 和51年1 1月2 2 日 受付)

本論 文^の要 旨^{の 一} 部は1 9 7 5年 第1 1 回 日本 移植 学 会 総 会, 1 9 7 6年 第1 2 回 日本 移 植 学会 総会, 19 7 7年 第77 回 日本 外 科 学会 総 会^{に お} いて 発表し た｡

近 年糖尿 病 患者に対する イ^{ン ス}リンや抗 生物 質^によ る治 療法の進歩と と もに, 重 篤な合併 症^によ る 死亡が 激 減^{し た｡ し か し}糖 尿病の意義は依 然と し て重大であ り, と くに最近で は糖尿 病性 血 管 障 害が注 目を あ^つめ ている｡ そ れ はこの血管 障 害が糖 尿 病 患者^の大き な死 因を占め ている か ら である｡ 小坂 ¹⁾は糖尿 病 患 者^の死 因の40 ^〜5 0%が脳, 心, 腎な どの血 管 障 害が し め て^い る と報 告し て^い る｡ ま た, 後 藤ら²⁾は本 邦例を集計し た結果で は, 血 管 障害死 が占め る率は, 臨床 例で は,

1 91 7 人中4 7^.3% , 剖検 例で は2 7 54 人中4 1^.2% で あった と報告し て^いる｡ さ て, 糖尿 病^にお け る血 管障 害は紙 小 血 管症 (^{mic r o a n}gi opathy) と動 脈硬 化^によ る血 管 障 害 (^m a c r o a ngiopathy) と^に大 別さ れ, このうち織 小 血 管症が糖尿 病^に特有な血管 障害^と考え ら れ て^いる｡

こ の紙 小血 管症は糖 尿病 患 者の生 体^のあ ら ゆ る部 位で 発 現す る が, 腎と網 膜は その好 発臓 器の 1 ^つと し^て知 ら れ, 特有^の糸 球体 硬 化症や網膜 症を呈す る^こと が知 ら れ て^いる｡

ところ で, 生 体 内^{にお け る}血 糖^{‑ イン スリンの}相互 関 係は食 事, 運 動な ど を は じ め と す る諸 因子^の影 響を う け, 時々刻々 と変動し て^いる｡ し か し糖尿 病 患 者^に 対し て今日 ま で広く行な わ れ て き て^いる, 1 日 1 ^〜 3 回^の固定し た イン スリン の投 与 法で は, この よ う な生 理的な相 互 関係を 日夜厳 密に維 持す る^こと ば, き わ め て困難である｡ 近 年, 糖 尿病 患者^に対す る イン スリン

治療の実際と し て, とく^に血 管障 害^の進 展 防止 を意 図 と して_, よ り生理的な血糖 ^{‑ イン スリン}相互関係を自 動 的^に維持す る た めには,fe ed ba ck syste m によ り

E^x_pe rim e ntal Studie s o n In V itr o Cultu r e

調 節さ れ た 量^のイ^{ン ス}リン投与が 必要である と^いわ れ ている｡ この よ う な f^{e e}d ba ck syste m 開 発の方法 と し て は,現代^{のエ レ}ク ト^{ロ ニ}ク^{ス の}発達^に基づ く^{̀ ̀}人 工膵β 細 胞^{t l の}開発と, 移植 学^の発 展^に基 づ く ^"膵移

植^{" の 二 つ の}方 法が検 討さ れ ている｡ 人 工膵 β 細 胞^の

研 究で は, 七 里 ら³⁾は 血糖持 続 測 定器, ミニ コ ンピュ

ー タ^ー , イン スリ^ン注入器 を 接続し た,

"

大型体外 性人 工膵β 細 胞^{シ ス}テ^ム" を作成し, 重症ケ ト ア^シド^ー シ スを示 す膵 摘糖 尿 犬^に使 用し た｡ その結果, 膵摘 糖尿 犬は血 糖^のす み や か な改 善と と もに_, ケ ト ア^シド^{ー シ} ス の消失を見, シ ステム作 動 申は 正常 血糖を維 持し,

ま た使用 イン スリ^ン量 を大 巾に節約で き た と報 告し て

一方, 膵移 植^に関す る研 究は, 1 9 2 7年 Gayet ⁴) や 1 9 2 9年 H o u s s ay ⁵

) によって始め ら れ, 1 9 57年^{L ich‑}

te n stein ら⁶⁾は血 管吻 合^によ る Whole o rg^{a n} を 用 いた膵 移 植^を行な^い, 6 日間^の生 存犬 を報 告し て^いる｡

そ の後 T e r signi⁷⁾ や G^{r u}yl ら⁸⁾ はステ^ロイ ド や抗 リン パ球 血 清を使 用し て, 移 植後2 0 ^〜6 0 日 ま で拒 否反 応を抑制し, そ の間は移植 膵は正常な内外 分 泌能を有 し て^いた と報 告し ている｡ し か し な が ら ^W hole o rga n

を 用^いる膵移 植は その目 的を十 分 達す る^には 至 ら な か

っ た｡ そ し て その原因^は膵外 分泌腺細 胞^の存在^にあ る と考え ら れ て^いた｡

ところ で, 1 96 5年 ^{M o sl{ ale w sk i9)}が^コラ ゲ ナ^ー ゼ 処理によ り膵ランゲ^{ル ハ}ン ス島 ( 膵ラ島) の分 離^に成 功し, 1 9 6 7年 La cy^･Ka stia n o v sky^lO

) がこれ^に改 良を 加え て, 技 術 的^に容 易^に膵ラ島が得ら れ る よ う^にな^っ

Of Pa n c r e atic Islet of L a 7q^{e r}ha n s a nd its

Tr a n spla ntatio n into the Po rtal V ein S_yste m . G11雨^{i Y a m a z aki De}p^{a r}tm e nt of Su rg^{e r}y

(II),(^{D ir e cto r : Pr of. Ⅰ. M i}y^{a z a}ki)^{, Scho ol of M edicin e,K} a n a z a w a U ⁿiv e r si_{t y}.

膵ラ島^の保 存お よ び そ^の門 脈内 移植に関する実験 的研 究

た｡ そこで, B al linge r^‑La cy^{l l})

は実 験 的糖 尿ラット^に 膵ラ島を腹腔 内ま た は皮 下^に同 種移 植し, 糖 尿 病状 態 の改 善を み た と報 告し て^いる｡

他 方, 移 植 免疫と と もに臓器移 植^の分野で重 要で あ る, 臓 器保 存に つ いての研 究が す す め られ,低 温 賂 高 圧酸 素 下保 存^, 潜 流保 存や凍 結保 存な ど が試み ら れ て いる｡ 寺 脇ら^{1 2)}によ れば肝の高 圧酸 素 下 濯流で 24時 間,

岡崎^{1 3}㌧増田 ら^{1 4)}に よ れば腎の低 温 濯流で も7 2時 間の 保 存が限 界と さ れ て^いる｡ し か し, 膵ラ島は組 織 片が 微 小な た め, これ ら の方法よ り も培 養法^によ る保 存が 適 当^であり, 著者は器 官培 養を応用 し た方 法で膵ラ島 の保 存を試み, さ ら にこ の保 存^ラ島の門 脈 内 移 植を 行って, 若 干の新 知 見を得た の で報 告す る｡

〔^Ⅰ〕 ^{保 存ランゲルハ ン ス島のイン スリン分 泌能} 保 存ラ^ンゲ^{ルハ ン ス}島の イ^{ン ス}リン分 泌能を検 討す る た め, 培 地^にグルコ ^ー ス_, ト^ルブ タ^マイ ド, グ^ルカ ゴンや各 種 消 化管ホル モ ン等を添加した時^のイ^{ン ス}リ ン分 泌能を新鮮ラ島と比 較の 上検 討し た｡

Ⅰ. 実験 材 料お よ^び実験方 法

図1 H a nks 液 注入によ る膨 化 膵^の組 織像 (H ^･ E 染 色, 4 0倍)

図2 分 離^ラ島の組 織像 (H ^･ E 染 色, 1 0 0倍)

5 7

1 . 実験 動 物

体 重2 0 0 ^‑3 0 0g の W ist_{a r} 系 雄ラッ ト を オ リ^エ ンタ ル固 形飼 料M F お よ び水道 水を与え て, 同^一条 件 下で 7 ^‑1 4 日間 飼 育後 実 験^に供し た｡

2 ^. 膵ラ島の分離 ( 図1 , 2)

W ista r 系雄ラット を ラ ボ ナ ^ー)t/ (5 0^mg/kg,腹 腔 内 投 与) 麻酔 下^に膵 臓を摘 出し, La cy ら^{1 0)}の方 法に さ ら^に改 良を加え た O k^{a m oto の}方 法^に従^い, 温和な 条 件で^コ ラゲ ト ゼ処理 を行な^い膵ラ島を分 離し#⁾で^{･ )}

す な わ ち, 上腹部正中切 開で開 腹後, 総胆 管の十^二指 腸開口部を結 致し, 総胆 管の肝 門部^に近^いところ よ り 23 G の翼状 針を刺入 し, グ^{ルコ ー} ス6 帥g/d ￡ を含む,

Ha nks液2 0¹舶 を注入 し, 膵 全体を膨 化さ せ る｡ つ いで 膵を脾, 胃お よ び十^二指腸よ り切除し上記buf fe r 中 で洗浄す る｡ こ の際, 脂肪 組織, リ^{ン パ}組 織や大 血 管 な ど は切 除し て お く｡ つぎに膵組 織を^ハサ ミ で細か く 切 り き ざ み, 2 0^m￡容三角^フラスコ に入 れ, コラ ゲ ナ^ー

ゼ (^{W o rth in}g t^{o n} 社製, C L S Ⅳ L^ot.N o.4 5 D O O 6) 3 0^mgと b^{o v}ine s e r u m albu min (Ar m o u r 社 製)1 0 0

mgを含む H ^{a Il}ks 液5^mg を加え る｡ つ いで 上記三角^フ

ラスコ を密 栓し3 7 ℃の W ate r bath inc ubato r の中 で1 5 0 ^‑2 00回/ 分 ^の振達の下に, 約1 5分間 膵切 片を^コ ラ ゲ ナ^ー ゼ で消 化さ せ る｡ 消化さ れ た膵 組 織^{‑ コ}ラ ゲ ナ^ー ゼ 混合液を50^{1 Ⅵ}ゼ容^の円 錐形^{メ ス シ}リンダ^{ー に}移し 変え, W a r m Ha nks 液で 4 回, つ いで C Old Ha nks

液^で4 回, 合 計8 回 の洗浄 沈澱を く り返し て膵 外 分 泌 腺 組織を除去す る｡ 洗 浄が終って, 得ら れ た沈 滞を,

C Old H a nks 液^に浮遊さ せて シャ ^ー レ に移す｡ これ を

冷 却し な が ら実体 顕微 鏡下^にて C apilla ry pi_pet te を 用^い, 膵ラ島を分 離採取し, 大き さ の ほ ぼ等し^い辺緑

の整な膵ラ島を 以下の実験^に供し た｡

3 ^. 膵ラ島^の保 存

得ら れ た膵ラ島は D^ulbe c c o m odified Eagle 培 地 (2 0% 牛胎 児^血清, Pe nicillin^‑G lO O^u/^me, Str ep t^o‑

mycin 5 0F^Lg/^me含有) 5^mゼを含む^tis s u e c ultu r e dish に2 0コあ て 入 れ, 029 5% ^:C O25%か ら な る 混合ガス

通気 下, 3 7 ℃ で 1 ^〜 7 日間, 炭酸ガス培 養 器 内で保存 し た｡ なお培 地の交換は2 ^〜 3 日毎に お こな^っ た｡

4 . 分離^ラ島^のイ^{ン ス}リ^ン分 泌能

得ら れ た新 鮮ラ島及 び保存ラ島は Kr ebs^･Ringe r‑

B ic a rbo n ate に 5^m M Gluta m at_e,5^m M Fu ma r at_e 5 ^m M Pyr u v ate, 0.2% Bo vin e s eru m albu m in, 種

々のイ^{ン ス}リ^ン分 泌刺 激 物質を 加え た ^{m e}diu m o^.5

mゼに,4･^{‑6 コ}あて 入 れ,

一 定 時 間Oz9 5% ^: C O25 % 通気 下, 3 7 ℃ で インキュ ベ ^ー 卜 し た｡ インキエ ペ ^ー ト 後^{に m ed iu m} 中^に放 出さ れ た イ^{ン ス}リン量 を P h^ade^･

58

ba sin s ulin te st^{1 7})･1 8)

( 固相 法, 塩野義 社 製) に て測 定し た｡ な お, イ^{ン ス}リン刺 激 物 質と し て は グルコ ^ー

ス, グルカゴ ン(^{N o v o} 社 製), トルブ タ^マイ ド(日

本^へキスト社 製),パ ンク^レオ ザ イシ ン(Bo ots 社 製),

セク^レチ^ン (エ ^ー ザ イ社 製),ガ^スト リ^ン ( 帝 国臓 器 社 製),セ ル レイ^ン ( 協和 醸 酵社 製) を用^いた｡

図3 ^‑ 9 の各点は ラッ ト 3 ^‑ 5匹か ら得ら れ た, 膵 ラ島を 4 ^〜 6 ^コあて, 各インキ^{ュ ベ ー} シ ョン フラスコ

に 入 れ た時の平均 値^と標 準偏 差で あ る｡

Ⅰ王. 実験 結 果

1 ^. グ^ルコ ^ー ス単 独刺 激^によ る イン スリン分 泌 1 , 3 , 5 お よび7 日間そ れ ぞ れ保 存し た分 離^ラ島 の, グルコ ^ー ス刺激^によ る イ^{ン ス}リ^ン分 泌 量は図3 の ご と､く, グ^{ルコ ー} ス50^mg/ d且存 在下, お よ び グ^{ルコ ー} ス3 0 0^Ⅶg/d 且存 在下で は, 保 存ラ島は新 鮮ラ島と ほ ぼ 同 程度^のイ^{ン ス}リ^ン分 泌能を 示 し ていた｡

Iu

1 1 3 5 ^ノ ー 肋ys

図3 新鮮ラ島お よ び保 存ラ島の イン スリン分 泌

各 値は M ^{e a n} 土 S.D. n ⁼ 7

思

｢

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1 11 2 00 醐

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4 00 帥 0 1 11 21 1 謝 4 01 5 1 l

G^l此 ○ 馳 Co n c 馴1tr atio n I^mg/^{d l})

図4 新鮮ラ島お よ び 3 日間保 存ラ島のグ^{ルコ ー} ス

漬 度と イ^{ン ス}リ^ン分 泌農

各傍は M e a n土 S.D. n ⁼1 0

ま た, グ^{ルコ ー} ス濃 度と イン スリン分泌 量 と の関係 を新 鮮ラ島と 3 日間保 存ラ島^{に つ}き検 討し た^のが図4 で あ る｡ いづ れ も グルコ ^ー ス濃 度1 0 0^mg/^{d 〟}以 上 か ら 急激な イン スリン分泌^反応を示し, そのイ^{ン ス}リン量 はグ)t^/ コ ^ー ス濃 度3 0 0^mg/^d￡ で ほ ぼ plate a u に達し て いた｡

次^に反応時 間と イ^{ン ス}リ^ン分 泌 量と の関 係を見る と ( 図5),新鮮ラ島お よ び 3 日間保 存ラ島は, グルコ ^ー

P u

(

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‑

析 て コ

三

〇 S 憎 む

一

〇 虻 u

弓

S u

‑

○^‑･噌I G lu c o s o(3 叩^mg / dり ^… G lu c o 淡(5 0mg/dll

図5 新 鮮^ラ島お よ び 3 日間保 存ラ島^のイン スリン

分 泌の時 間 的経 過

各値は M e a n 土 S^.D^. n ⁼1 0

｢ 亡

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○

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三

中 S 吋

○

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β

‑

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図6 グルカゴ ンの イ^{ン ス}リン分 泌に及ぼす影 響

各 値は M ^{e a n} 土 S^.D. n ⁼ 7

★ はグ^{ルコ ー ス} 3 00^mg/d 月存在 下で のグ^ルカ ゴ^ン 添 加 群と無添 加 群 間の有 意差をあら わ し ている ( P < 0^.0 5)｡

▲はグルコ ^ー ス5 0^mg/^d￡存 在下で のグ^ルカ ゴン添 加 群^と無 添加 群 間^には有 意差が ない こと をあら わ

し て^いる｡

膵ラ島^の保 存お よ び そ^の門脈 内移 植に関 する実 験 的 研 究

ス300^mg/ dg 存在 下^{で3 0 分, 6 0}分, 9 0分と時 間と と も にイ^{ン ス}リ^ン分泌 量は, ほ ぼ直 線 的に増加し て^いた｡

2 ^. グルカゴ ン のイ^{ン ス}リ^ン分 泌にお よ ぽ す影 響 ( 図6)

m ediu m に グ^)t/カゴ ン 1 0F^Lg/^mE 添加 時^のイ^{ン ス}リ ン分 泌量を見る と^､ グ^{ルコ ー} ス3 00^mg/ d^色 存在 下で は,

保 存5 日間ま で保存ラ島は新 鮮ラ島よ り も, 分^泌量の 軽度 低 下を認め る も, グルコ ^ー ス単 独群よ り も分 泌量 は増 加 傾 向を 示 し ていた｡ ま た, グルコ ^ー ス5 0¹哩/ d￡

存 在下で は, 新鮮お よ び 1 ^‑ 5 日間保 存ラ島は グルカ ゴ ン に対し て反 応しなかった｡

3 . ト^ルブ タ^マイ ドのイン スリン分 泌^にお よ ぽ す影 響 ( 図7)

m ediu m にト^ルブ タ^マイ ド 1^mg/mE添加 時の イ^{ン ス} リン分 泌 量を比 較してみ る と, グルコ ^ー ス 5 0^mg/ dセお よ び 3 00^mg/^{d e} 存 在下で は, と もにトルブ タ^マイ ド添 加 群の方が有 意にイン スリン分泌 量の増加を認め た｡

し か し新鮮ラ島と保存ラ島 間には有 意 差は認め ら れ な か^った｡

4 . 各 種消 化 管ホル モ ンの イン スリン分泌に およ ぽ す影 響

m ediu m にパ ンクレオ ザ イ ミ^ン 2^u 舟e, セク^レチ^ン 2^u/^mゼ_, ガスト リン3γ/^mゼあるいはセ ル レイ^ン0.4 腫ノ

mゼを加え た時の イン スリン分 泌量を新鮮ラ島と 3 日間

A :P く吼0 5

☆;P く飢 別

図7 ト^ルブ タマイ ドのイン スリ^ン分泌^に及ぼ す影

響 各値は M e a n ±S^.D^. n ⁼ 7

A は グル コ ^ー ス 30 0mg/ de 存 在下での ト^ルブ タ^マ イ ド添加 群と無 添加 群 間の有意 差を あ ら わ し て^い

る (P < 0^.0 5)｡

★ は グ^{ルコ ー} ス50^mg/d^ゼ存 在下で の ト^ルブ タ^マイ ト添加 群と無添 加 群 間の有意 差を あ ら わ し て^いる

(P ^<0^,0 1)｡

竃 琶 董 讐 憾 選 竜 亘 二 顎 琵 琶鑑

基 層 羞

新 鮮 ラ晶

5 9

保 存ラ晶

図8 各種 消 化管ホル モ ンの イン スリン分 泌^に及 ぼ す影響 (グルコ ^ー ス5 0^mg/ d･^{色存 在下)}

各値は M ^{e a n} ± S^.D. n ⁼ 7

P は各種 消 化管ホル モ ン添 加群^{と グルコ ー ス}単独 群 間^の有 意 差をあら わ し ている｡

モ

鵬

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○

竺 筍 覇 て コ

三

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保 存ラ 晶

1別u c 068 ^■■ = = =

f … mgJd れ

蝕よin Ca｡. ｡蜘 鮎｡ふ^{i｡ 触} 職 ,^min

!^3r/mり仲舟帽 /^ml】t^2uJmり (^2u/^mり 図9 各 種 消化 管ホ ル モ ン のイン スリ^ン分泌に及ぼ

す影 響 ( グ^{ルコ ー ス} 30 0^mg/dゼ存 在下)

各値は M ^{e a n ±}S.D. n ⁼ 7

P は各 種 消化 管ホル モ ン添 加群と グ^{ルコ ー ス}単独 群 間の有意 差を あ ら わ し ている｡