図 1: 操作法の概要 2. この製品の使用法 2. 1 実験開始前に サンプル材料 細胞培地またはセルフリーの培養上澄 アッセイ用の試薬は細胞にダ メージを与えないので 直接細胞培養プレートに加えることができます サンプルを直接試験しないときは LDH 活性の測定の前に 250 g の遠心で 細胞

1. 製品内容 試験回数 　Cat. No. 4 744 926は96ウェルプレートで400回、384ウェルプレート で600回 　Cat. No. 4 744 934は96ウェルプレートで2000回、384ウェルプレー トで8000回 キット内容 ボトル ラベル 内容 / 機能 Ａ） Cat. No. 4744926　400回 Ｂ） Cat. No. 4744934　2000回　  青キャップ 触媒 ・Ａ） ボトル、凍結乾燥、安定化 Ｂ） 5ボトル、凍結乾燥、安定化 ・ジアフォラーゼ /NAD ＋ミクスチャー ・反応混合液用触媒 2 赤キャップ 色素溶液 ・A） ボトル、45 ml B） 5ボトル、各45 ml ・ヨードテトラゾリウム クロライド（NT） と乳酸ナトリウム ・色素反応混合液 3 白キャップ 溶解液 ・A） ボトル、3 ml B） 5ボトル、各3 ml ・細胞溶解用、調製済み 4 緑キャップ 停止液 ・A） ボトル、25 ml B） 5ボトル、各25 ml ・LDH 反応停止用、調製済み 保存と安定性 　キットは－5 ～－20℃でラベルに示される期限まで安定です。 キット構成品の安定性 　凍結乾燥品（ボトル）は2 ～ 8℃で安定です。 　再懸濁した触媒溶液、色素溶液（ボトル2）、溶解液（ボトル3）と停止 液（ボトル4）の安定性は以下の通りです： ・2 ～ 8℃で4週間 ・5℃～ 20℃で2日間 ・長期保存（3ヶ月まで）は、凍結保存してください。 ・3回までの凍結融解は性能に顕著な影響を与えません。しかしなが らボトル2の色素溶液に沈殿が見られたときには、37℃で少なくと も時間、溶液を振とうします。それでも残る沈殿は性能に影響し ません。製品の凍結により沈殿が生じますので、凍結融解を繰り返 すことは避けてください。 追加の器具と必要な試薬 ・37℃インキュベーター ・マイクロプレート（ELSA）リーダー →490-492nm で測定ができること。リファレンス波長を使用する場合 は、600nm 以上のリファレンスフィルターを選んでください。 ・顕微鏡 ・ヘモサイトメーター ・マルチチャンネルピペッター（00μl） ・滅菌ピペットチップ ・細胞介在性の溶解測定や細胞毒性を持つ成分の分析には、滅菌済み

細胞傷害性検出キット

_（LDH）

_{Cytotoxicity Detection Kit}

_（LDH）

傷害を受けた細胞の細胞質から放出された、乳酸脱水素酵素（LDH）活性の測定に基づく、細胞死と細胞溶解のハイスループット比色定量法で す。

Cat. No. 4 744 926　96ウェルプレートで　400回 / 384ウェルプレートで1600回

Cat. No. 4 744 934　96ウェルプレートで2000回 / 384ウェルプレートで8000回

で組織培養グレードの96ウェルあるいは384ウェルのマイクロプレ ート ・アッセイ培地（%の FCS あるいは%のウシ血清アルブミンを含む 培地など） →ヒトや動物血清は様々な量の LDH を含んでおり、バックグランド の上昇の原因となります。それゆえ、アッセイの感度を増加させる ためには、低濃度の血清か%のウシ血清アルブミンの存在下で測 定を行います。 ・LDH スタンダード溶液（0.05 U/ml、セクション2.を参照） →相対的な細胞傷害性の率や吸光度ではなく、U/ml での放出 LDH 活性を計算する場合には、リファレンススタンダードとして適切な LDH 調製品を使用してください。 →アッセイ培地と LDH スタンダードはキットに含まれませんが、他 の必要なすべての試薬が含まれます。 アプリケーション 細胞傷害性検出キットplus_{は、損傷を受けた細胞から放出された} LDH 活性を測定することに基づき、細胞傷害性 / 溶解性を定量する ための正確で迅速、簡便な比色定量法です。本キットは96ウェルや 384ウェルフォーマットのハイスループットな定量に最適です。細胞 膜の損傷を起こした様々なin vitro 細胞システムに使用できます。 このアッセイはまた、増殖アッセイの最終で存在する細胞の総数を 測定するためにも使用できます。 アプリケーションの例： ・食品、化粧品、医薬品企業での環境および医学的研究における化学 品の潜在的な細胞傷害性の測定 ・メディエーターを介した細胞溶解性の測定 ・細胞傷害性 T リンパ球（CTL）やナチュラルキラー（NK）細胞、リン フォカイン活性化キラー（LAK）細胞、単球により誘導された細胞 傷害性の検出と定量 → LDH 放出アッセイと［5_{Cr］放出アッセイは、NK 細胞を含むマウ} スやヒトの様々なエフェクター・標的細胞システムにおける細胞介 在性細胞傷害性のモニターに使用した時、良い相関を見せます。 ・抗体介在性の細胞傷害（ADCC）と補体介在性細胞傷害性の測定 ・バイオリアクター中の細胞死の測定 →培養培地中へ放出された細胞質 LDH 酵素活性を測定することで、 バイオリアクターでの培養間の細胞死を正確に評価します。 アッセイ時間 標準的なアッセイ時間：5分間 最長のアッセイ時間：低細胞数（00個 / ウェル以下）で30分間まで

図1: 操作法の概要 2. この製品の使用法 2. 1 実験開始前に サンプル材料 細胞培地またはセルフリーの培養上澄。アッセイ用の試薬は細胞にダ メージを与えないので、直接細胞培養プレートに加えることができます。 サンプルを直接試験しないときは、LDH 活性の測定の前に、250× g の遠心で、細胞を除去します。 →遠心後、セルフリーの培養上澄は2～8℃で数日間、LDH 活性の損 失なく保存することができます。 ワーキング溶液の調製 内　　容 再溶解 / 調製 保存と安定性 触 媒（ ボ ト ル、 青 キ ャップ） 凍結乾燥品を ml の再蒸留 水に溶解し、十分に混合し ます。 ・2～8℃で4週間 ・5℃～ 20℃で2日間 ・－5～－25℃で3ヶ月間 は安定 反 応 混 合 液 00テスト用：使用前に250μl の再懸濁したボトル溶液に .25 ml のボトル2溶液を加 え混合します。 400テスト用：使用前にボト ル2溶液の全量（45 ml）に、 ml の再懸濁したボトル溶液 を加え混合します。 ボトル2の色素溶液に沈殿が 見られたときには、37℃で少 なくとも時間、溶液を振とう します。それでも残る沈殿は 性能に影響しません。 製品の凍結により沈殿が生じ ますので、凍結融解を繰り返 使用直前に調製します。反 応混合液は保存できませ ん。 コントロール 　細胞傷害性の割合を計算するために、各実験ステップで以下の3種 類のコントロールを加えてください： ・バックグランドコントロール：アッセイ培地中に含まれる LDH 活 性を測定します。 →このコントロールで得られる吸光度を、他のすべての吸光度から引 き算します。 ・低コントロール：未処理の正常細胞から放出される LDH 活性を測 定します（自発的な LDH 放出）。 ・高コントロール：細胞中の放出可能な LDH 活性を測定します（最 大 LDH 放出）。 →このコントロールを行うとき、最大 LDH 放出を正確に推測するた めに正しい時間でサンプルに溶解試薬を加えなければなりません。 コントロール細胞は細胞毒性を持つ成分に曝露されている間も増殖 していますので、曝露のはじめにライシス溶液を加えたとき、トー タルの LDH を低く見積もることになります。また、37℃での LDH の半減期は約9時間なので、曝露のはじめにライシス溶液を加えた とき、高コントロール中の LDH 活性は大きく低下します。それゆ え、高コントロールへの溶解試薬の添加は常に曝露期間の最後にし ます。 以下の（オプションの）2種類のコントロールが有用です： ・物質コントロール ：試験基質に含まれる LDH 活性を測定します。 細胞介在性細胞傷害性のアッセイにおいて、このコントロールはエ フェクター細胞から放出される LDH 活性に関する情報を提供しま す（エフェクター細胞コントロール）。（セクション3.3を参照） ・物質コントロール ：試験物質それ自身が LDH 活性測定に干渉す るかどうかを測定します このコントロールを行うために：光学的に透明な96ウェルプレート中 の各コントロールサンプル（三重測定）に、試験物質を含む50μl の アッセイ培地を添加します。次に、50μl/ ウェルの LDH スタンダ ード溶液（0.05 U/ml）を加えます。最後に、00μl/ ウェルの反応混 合液を加えます。 表1：コントロールの概要 ウェ ル の 内容 バックグ ランドコ ントロー ル 低コント ロール 高コント ロール 物質コン トロール I 物質コン トロール II 実験サン プル セルフリ ー培養培 地 00μl 50μl 50μl － － － 細胞 － 50μl 50μl － － 50μl 溶 解 バッ ファー － － 5μl － － － 培地で希 釈した試 験物質あ るいはエ フェ ク タ ー細胞 － － － 00μl 50μl 50μl LDH スタ ン ダー ド 溶液 － － － － 50μl － _{細胞毒性物質への曝露の最後に添加します。} →バックグランド、低および高コントロールは各実験で行います。 コントロールによる計算 A. 細胞傷害性のパーセントを測定するために、三重測定サンプルと コントロールの平均吸光度を計算し、そこからバックグランドコン トロールから得られた吸光度を引き算します。次に、次式で計算し

細胞傷害性（％）＝ 実測値－低コントロール ×00 高コントロール－低コントロール B. 細胞介在性の細胞傷害性のパーセントを測定するために、三重測 定サンプルとコントロールの平均吸光度を計算し、そこからバックグ ランドコントロールから得られた吸光度を引き算します。次に、次式 で得られた値を置き換えます： 細胞傷害性（％）＝ （エフェクター：標的細胞ミックス－ エフェクター細胞コントロール）－ 低コントロール ×00 高コントロール－低コントロール 2. 2 アッセイにおける至適な細胞濃度の測定 →異なる細胞タイプは異なる量の LDH を含んでいます。それゆえ、 それぞれの特殊な細胞タイプで常に初期実験を行い、適切な細胞濃 度を決定します。一般的に、この至適な細胞濃度は低コントロール と高コントロールの差異を最大にするようにし、この濃度を以下の 実験に使用します。 ほとんどの細胞株での至適細胞濃度は（0.25－）×04_{細胞 /00μl ア} ッセイ（=（0.25－）×05_{細胞 /ml）です。} 操作法（96ウェルプレート用） →この操作法を384ウェルプレートに適合させるためには、ステップ2 －4の00μ l/ ウェルの代わりに25μ l/ ウェルを使用します（ステッ プ2では25μ l のアッセイ培地を384ウェルプレートに加えます）。 操作法の概要は図1をご覧ください。 ステップ アクション  ・細胞をアッセイ培地で洗浄します。 ・アッセイ培地で細胞濃度を2×06_{個 / ウェルに調製し} ます。 2 96ウェルプレートの各ウェルに00μl のアッセイ培地を 添加します。 3 ・マルチチャンネルピペットを用いて細胞の2倍希釈系 列を準備します。各希釈物を6ウェルずつ用意します。 注：希釈後は、各ウェルの最終容量は00μl でなければ なりません。バックグランドコントロールとして使用 する細胞を含まないウェルを少なくとも3ウェル用意 します。 ・各細胞希釈物に対して： 　－低コントロールを3ウェル（自発的な LDH 放出） 　－高コントロールを3ウェル（最大 LDH 放出） 注：各コントロールの概要は、セクション2.をご覧く ださい。 ４ プレートをインキュベーター内でインキュベートします （37℃、5％ CO2、湿度90％）。 注：ここでのインキュベーション時間は、最終のアッセ イで使用するインキュベーション時間と同じでなければ なりません。 5 ・ステップ3で指示された高コントロール細胞希釈物に 対して、5μ l の溶解液を加えます（384ウェルプレー トには.5μ l を加えます）。 ・更に5分間インキュベートします。 注：溶解中にプレートを振とうすることで、特に接着細 胞や細胞塊でのプロセスが早まります。 6 LDH 活性を測定するために、00μl の反応ミックス（用 時調製）を96ウェルプレートの各ウェルに加え、多い細 胞数の場合は5－0分間、低い細胞数（00個 / ウェルま で）の場合は30分間まで室温でインキュベートします （384ウェルプレートの場合は25μl/ ウェルの反応ミック スを使用します）。 注：このインキュベーションの間、プレートを遮光しま す（（A）の図をご覧ください）。 7 ・50μl の停止溶液を96ウェルプレートの各ウェルに添 加します（384ウェルには2.5μl を使用します）。 ・プレートを0秒間振とうします（（B）の図をご覧くだ さい）。 8 ELSA リーダーを使用して490あるいは492nm の吸光度 （フィルターに応じて）を測定します。 注：リファレンス波長は600nm 以上とします（（C）の図 をご覧ください）。 9 アッセイにおける至適な細胞濃度を決定します（高コン トロールおよび低コントロールの差が最大となる濃度）。 結　果 図2：384および96ウェルプレート中での細胞数と、細胞傷害性検出キットplus で得られた492nm の吸光度との直線的相関関係。 U 937細胞を上記の通りにマイクロプレート中で希釈し、図に表示した 細胞濃度を得ます。その後の LDH 放出（コントロール）を測定するために 培地を加え、最大 LDH 放出活性（溶解）を測定するために溶解試薬を加え ます。LDH の反応は15分間行います。 グラフ A は384ウェルプレート、グラフ B は96ウェルプレートで得られ た値を示しています。384ウェルプレートでは100個以下 / ウェル、96 ウェルプレートでは500個以下 / ウェルの細胞からの LDH 放出を測定す ることができます。インキュベーションを長くすることでより感度を増 加させることができます。 細胞数と高コントロールでの LDH シグナル強度（溶解細胞からの最大 LDH 放出）には直線的相関関係があります。 図2A：384ウェルプレート 図2B：96ウェルプレート 2. 3 可溶性物質の細胞傷害性の測定 操作法（96ウェルプレート用） 注：この操作法を384ウェルプレートで行う場合、ステップ－3の細 胞とアッセイ培地を/4量とします（ステップにおいて、25μl の細胞 / ウェルで開始し2.5μl の培地に再懸濁します）。

ステップ アクション  ・予備実験（セクション2.2）で決定した細胞濃度まで細 胞を増殖させます。 ・96ウェルプレートのウェル中に50μl の細胞懸濁液を 分注します。 注：実験条件を三重測定するための十分な細胞を含むウ ェルと、ステップ4に記載された2種類のコントロールの ためのウェルを準備します。 2 細胞をアッセイ培地で洗浄します。 3 ・実験の直前に、アッセイ培地中で試験物質（メディエ ーター、細胞溶解、細胞傷害性薬剤）の希釈系列を調 製するために、別のマイクロプレートを使用します。 ・50μ l の試験物質の希釈系列を、50μ l の細胞を含む ウェル（ステップで調製したマイクロプレート）に加 えます。 注：すべての実験は三重測定を行います。 4 同じプレート上で以下のコントロールの三重測定を行い ます コントロール 各ウェルに加えるもの バックグランドコントロー ル 00μl のアッセイ培地のみ 低コントロール 50μl の細胞懸濁液と50μl のアッセイ培地 高コントロール 50μl の細胞懸濁液と50μl のアッセイ培地 物質コントロール  50μl の試験物質（実験で用 いる最高の濃度）と50μl の アッセイ培地 物質コントロール  50μl の試験物質（実験で用 いる最高の濃度）と50μl の LDH スタンダード溶液 注：各コントロールの目的はセクション2.を参照して ください。 5 細胞をインキュベーター内でインキュベートします（37 ℃、5% CO2、湿度90%）。 注：実験により、適切なインキュベーション時間は2－ 24時間です。 6 ・高コントロールサンプル（ステップ4より）を含む各 ウェルに、5μ l の溶解液を加えます（384ウェルには .5μ l/ ウェル）。 ・更に5分インキュベートします。 注：プレートの振とうは溶解のプロセスを促進します。 7 LDH 活性を測定するために、00μl の反応混合液（用時 調製）を96ウェルプレートの各ウェルに加え、室温で30 分間までインキュベートします（図A 参照）（384ウェル プレートには25μl 加えます）。 注：インキュベーションの間、プレートを遮光します。 8 ・50μ l の停止溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加 えます（図B 参照）（384ウェルプレートには2.5μ l 加 えます）。 ・プレートを0秒間振とうします。 9 490nm か492nm（リーダーのフィルターによる）でのサ ンプルの吸光度を測定するために ELSA リーダーを使 用します（図（C）を参照）。 注：リファレンス波長は600nm 以上にします。 0 各サンプルの細胞傷害性パーセントを計算します（セク ション2.に従う）。 結　果 　以下の結果（図3と4）は浮遊細胞株（U 937） と接着細胞株（WEH 図3：U 937細胞株におけるアクチノマイシン D の細胞傷害活性の測定。U937 細胞を96ウェルプレートに10000細胞 / ウェルの密度で新鮮な培地に播 種しました。異なる濃度のアクチノマイシン D を培養細胞に加え、16 時間インキュベートしました。細胞傷害性を細胞傷害性検出キットPLUS （LDH）で測定しました。同じ処理をした別のセットのコントロールウェ ルで細胞増殖試薬 WST-1を使用して細胞増殖を測定しました。これらの 結果は、両方のタイプのアッセイで同様の IC50値を示しました。 図4：接着 WEHI 164細胞における TNF－αの細胞傷害性の測定。96ウェルプ レートのウェル当り50000個の WEHI 164細胞を含む細胞培養物を新し い培地で洗浄し、1μg/ml のアクチノマイシン D で3時間プレインキュベ ーションしました。その後、様々な量の TNF- αをウェルに加え、プレー トを16時間インキュベートしました。培養細胞への細胞傷害性を細胞傷 害性検出キットPLUS _{（LDH）で測定しました。同じ処理をした別のセット} のコントロールウェルで細胞増殖試薬 WST-1を使用して細胞増殖を測定 しました。これらの結果は、両方のタイプのアッセイで同様の IC50値を 示しました。 2. 4 細胞増殖の測定 注：細胞増殖を測定するために細胞傷害性検出キットPLUS _（LDH）が 使用できます。細胞を増殖させ、実験の終わりにキット内の細胞溶解 試薬を加えることで、細胞を溶解します。トータルの放出 LDH を反 応ミックスで測定します。このケースでは低コントロールも高コント ロールも必要としません。 操作法（96ウェル用） 注：384ウェルへの適用はセクション2.2と2.3をご覧ください。 ステップ アクション  ・96ウェル組織培養プレートのウェル中に、アッセイ培 地に懸濁された細胞サンプル（00μl/ ウェル）を分注 します。 ・望みの密度まで細胞を増殖させます。 2 アッセイ培地で細胞を洗浄します。 3 細胞を含む各ウェルに、細胞増殖に効果を持つか試した い物質を含むアッセイ培地を50μl 加えます。 注：すべての実験は三重測定で行います。

4 同じプレートで以下のコントロールの三重測定を行いま す。 注：各コントロールの概要はセクション2.をご覧くだ さい。 コントロール 各ウェルに加えるもの バックグランドコントロール 00μl のアッセイ培地 物質コントロール  50μl の試験物質（実験で使 用される最大濃度）と50μl のアッセイ培地 物質コントロール  50μl の試験物質（実験で使 用される最大濃度）と50μl の LDH スタンダード溶液 5 使用する細胞と条件に適切な時間、細胞をインキュベー ター（37℃、5％ CO2、湿度90％）中でインキュベートし ます。 6 ・5μl の溶解溶液を細胞を含む各ウェルに加えます。 ・プレートを更に5分間インキュベートします。 注：溶解の間にプレートを振とうすることで、特に接着 細胞や凝集しやすい細胞において、プロセスの時間 を短縮できます。 7 LDH 活性を測定するために、00μl の反応混合液（用時 調製）をウェルに加え、5～25℃で30分間インキュベー トします（図. A 参照）。 注：このインキュベーションの間、プレートを遮光します。 8 ・50μ l の停止溶液を各ウェルに加えます。 ・プレートを0秒間振とうします（図. B 参照）。 9 ELSA リーダーを使用して、490nm または492nm の吸 光度を測定します（図（C）を参照）。 注：リファレンス波長は600nm 以上にします。 0 各サンプルの細胞傷害性パーセントを計算します（セク ション2.に従う）。 結　果 　図2A と2B（セクション2.2）は、溶解細胞コントロール中の細胞数が LDH のシグナル強度に比例していることを示しています。 2. 5 細胞介在性細胞傷害性の測定 実験のセットアップ（96ウェルプレートでのサンプル調製） →すべての試験は三重測定します。 バックグランド コントロール 標的細胞 低コントロール 標的細胞 高コントロール ブランク エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率7） エフェクター細 胞コントロール （混合比率用） エフェクター細 胞コントロール （混合比率7用） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率2） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率8） エフェクター細 胞コントロール （混合比率2用） エフェクター細 胞コントロール （混合比率8用） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率3） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率9） エフェクター細 胞コントロール （混合比率3用） エフェクター細 胞コントロール （混合比率9用） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率4） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率0） エフェクター細 胞コントロール （混合比率4用） エフェクター細 胞コントロール （混合比率0用） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率5） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率） エフェクター細 胞コントロール （混合比率5用） エフェクター細 胞コントロール （混合比率用） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率6） エフェクター－ 標的細胞ミック ス（比率2） エフェクター細 胞コントロール （混合比率6用） エフェクター細 胞コントロール （混合比率2用） 操作法（96ウェル用） 注：384ウェルへの適用はセクション2.2と2.3をご覧ください。 ステップ アクション  滅菌96ウェル組織培養プレート中で、エフェクター細胞 （NK 細胞、LAK 細胞、CTL）の希釈系列を適切な培地 中で作成します（各希釈物の最終液量は50μl） 注：すべてのサンプルは三重測定を行います。 ２ ・標的細胞をアッセイ培地で洗浄します。 ・予備実験（セクション2.2）で決定した至適濃度の2倍ま で標的細胞を希釈します。 3 エフェクター細胞の希釈物を含む各ウェルに、50μl の 標的細胞懸濁液を加えます（エフェクター－標的細胞ミ ックス）。 注：実験のセットアップは、前の表をご参照ください。 4 同じプレート上で、以下のコントロールの三重測定を行 います。 注：各コントロールの概要はセクション2.をご覧くだ さい。 コントロール 各ウェルに加える バックグランドコントロール 00μl のアッセイ培地 低コントロール 50μl の標的細胞と50μl の アッセイ培地 高コントロール 50μl の標的細胞と50μl の アッセイ培地 物質コントロール  50μl の アッ セ イ 培 地 と 50μl のエフェクター細胞 物質コントロール  50μl の試験物質（実験で使 用する最大濃度）と50μl の LDH スタンダード溶液 →アッセイに用いた各エフェクター細胞濃度において自 発的な LDH 放出を常に測定します。実験のセットア ップは前の表をご覧ください。 5 使用する細胞と条件に適切な時間、細胞をインキュベー ター（37℃、5％ CO2、湿度90％）中でインキュベートし ます。 6 ・5μ l の溶解溶液を細胞を含む各ウェルに加えます。 ・プレートを更に5分間インキュベートします。 注：溶解の間にプレートを振とうすることで、特に接着 細胞や凝集しやすい細胞において、プロセスの時間を短 縮できます。 7 LDH 活性を測定するために、00μl の反応混合液（用時 調製）をウェルに加え、5～25℃で30分間インキュベー トします（図. A 参照） 注：このインキュベーションの間、プレートを遮光しま す。 8 ・50μl の停止溶液を各ウェルに加えます。 ・プレートを0秒間振とうします（図. B 参照）。 9 ELSA リーダーを使用して、490nm または492nm の吸 光度を測定します（図.C を参照）。 注：リファレンス波長は600nm 以上にします。 0 各サンプルの細胞傷害性パーセントを計算します（セク ション2.）。

3. トラブルシューティング 現　　象 考えられる原因 推奨 発色反応が弱い 細胞濃度が低すぎる 細胞濃度を再調製します。 物質かアッセイ培地が LDH 活性を阻害して いる ・LDH 活性を阻害する化学 成分用に、物質あるいは / およびアッセイ培地を テストするために物質コ ントロール （セクション 2.）を使用します。 ・ピルビン酸を含む培養培 地を使用しないこと。 低コントロール の 発 色 反 応 が 強い 細胞濃度が高すぎる 細胞濃度を再調製します。 物質かアッセイ培地が LDH 活性を持っている LDH 活性を持つ化学成分用 に、物質あるいは / および アッセイ培地をテストする ために物質コントロール  （セクション2.）を使用しま す。 アッセイに使用した細 胞の劣悪な条件のため 高い自然放出が起こっ ている 培養条件をチェックします。 たとえ短いインキュベーシ ョン時間でも、ある種の細 胞は無血清では生存できま せん。血清濃度を－5%に 増加します。 発色反応は強い が吸光度は低い バックグランドが高い バックグランドが高いと計 算により吸光度が低くなり ます。 物質かアッセイ培地が LDH 活性を持っている LDH 活性を持つ化学成分用 に、物質あるいは / および アッセイ培地をテストする ために物質コントロール  （セクション2.）を使用しま す。 エフェクターコ ントロール細胞 で高い発色反応 を示す 不適切な分離や培養条 件によるエフェクター 細胞の劣悪な条件 ・細胞培養条件を改善しま す。 ・密度勾配遠心により死細 胞を生エフェクター細胞 から分離します。 4．この製品の追加情報 作用機序 　細胞死は、古典的には原形質膜の損傷の定量化により評価されます。 細胞死の精密な測定における、高感度で、定量性があり、信頼性があ る全自動的な方法への必要性が、細胞の生体活性の定量化に対する数 種類の標準的なアッセイの開発を導きました。 　乳酸脱水素酵素（LDH）は全ての細胞に存在する、安定な原形質酵 素です。これは原形質膜の損傷により、細胞培養上澄に速やかに放出 されます。細胞傷害性検出キットPLUS_{（LDH）の使用により、LDH 活} 性は培養上澄中で、 回の時間ポイントで簡単に測定できます。適切 な停止液が細胞の透明性を高めるため、このアッセイは多数の細胞が ウェル内に含まれるとしても、培養プレート中で直接、簡単に LDH を測定できます。マイクロプレートリーダー（ELSA リーダー）の使 用により、多数サンプルの同時測定が可能になります。反応を停止す ることによりアッセイ条件が明確に定義されます。試験は放射性同位 元素を使用しないため安全です。本キットの他の利点としては操作ス テップがより少なくすみ、移送や遠心、前標識のステップが要らない ので、ハイスループットに最適であることです。 試験原理 　細胞上澄をセルフリーで採取し、キットの反応混合液とインキュ ＋に還元されます。次のステップで、触媒（ジアフォラーゼ）が H/H ＋を NADH/H ＋からテトラゾリウム塩 NT に転移し、フォルマザ ンに還元します（図 5）。 図5：放出された LDH の測定。最初のステップで、放出された乳酸脱水素酵素 （LDH）が乳酸をピルビン酸に酸化することで、NAD ＋を NADH ＋ /H ＋ に還元します。第2の酵素反応で、酸素は触媒により NADH ＋ /H ＋から 黄色のテトラゾリウム塩 INT に転移されます。 　死細胞や細胞膜が損傷した細胞の量が増えると、培養上清中の LDH 活性が上昇します。上清中の酵素活性量の増加は、限られた時 間内で形成されるフォルマザン量と強く相関します。それゆえ、この アッセイ間での発色量は溶解した細胞数と比例します。形成された フォルマザン色素は水溶性で500nm 付近に幅広い吸収を持ちますが、 フォルマザン塩である NT はこの付近には顕著な吸収を示しません （図6）。 図6：細胞傷害性検出キットPLUS_{（LDH）のワーキング溶液の吸収スペクトラム。} キットの反応ミックスには RPMI 1640と1% BSA が加えられ、吸収スペ クトラムは LDH の存在（---）および不在（….）下で測定されました。 感　度 　使用する個々の細胞タイプに応じて、ほとんどの実験では（0.2－2） ×04_{細胞 / ウェルで十分です。} 試験への干渉要因 ・内因性の LDH 活性が血清や試験物質に見られる場合があります（セ クション2.を参照）。 ・細胞介在性細胞傷害性アッセイでは、損傷を受けたエフェクター細 胞から放出された LDH がアッセイ結果に干渉します（セクション 2.と3.3を参照）。 ・LDH やジアフォラーゼの酵素活性を阻害する物質はアッセイに干 渉します。適切なコントロールを作成してください（セクション2. 参照）。 ・ピルビン酸は LDH 反応の阻害剤で、ある種の培養培地（DMEM、 Ham F2、scove など）に含まれます。

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