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間質性肺炎合併自己免疫性炎症性筋疾患における ADAM-17の検討
昭和大学医学部内科学講座 (リウマチ・膠原病内科学部門) 西見愛里、磯﨑健男、笠間毅
ランニングタイトル：自己免疫性炎症性筋疾患における ADAM-17
連絡先著者名：西見愛里
所属：昭和大学医学部内科学講座 (リウマチ・膠原病内科学部門)
2 抄録
背景/目的：A disintegrin and metalloprotease (ADAM) familyは組織障害や 炎 症 反 応 に お い て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る と 考 え ら れ て い る 。ADAM-17 は
tumor necrosis factor (TNF)-αを sheddingする蛋白分解酵素として最初に発見 された。今回、われわれは、自己免疫性炎症性筋疾患における ADAM-17の発現 と間質性肺炎での炎症における役割を検討した。
対象と方法：自己免疫性炎症性筋疾患(多発性筋炎 26 名，皮膚筋炎 34 名，
clinically amyopathic dermatomyositis (CADM ) 10名)患者の血清中のADAM-17を enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)法にて測定した。そして、臨床所見や 臨床データとの関連を検討した。さらに、免疫染色法を用いて、自己免疫性炎症
性筋疾患患者の筋生検の組織上での ADAM-17の発現を確認した。
結果：自己免疫性炎症性筋疾患の血清中のADAM-17は、健常者(19名)の血清 中のそれと比較し有意に高値であった(mean ± SEM; 1048 ± 312 pg/ml and 36 ± 18 pg/ml, p<0.05)。副腎皮質ステロイド and/or 免疫抑制剤での加療後の患者血清中
のADAM-17は、治療前の血清中のそれと比較し 有意に減少していた(1465 ± 562
pg/ml and 1059 ± 503 pg/ml, p<0.01)。ADAM-17はfractalikine/CX3CL1，CXCL16 それぞれと有意に正の相関を認めた。また、間質性肺炎合併 自己免疫性炎症性筋
疾患患者(46名)の血清中の ADAM-17は、間質性肺炎非合併自己免疫性炎症性筋 疾患患者(24名)のそれと比較し有意に上昇していた(1379 ± 454 pg/ml and 413 ± 226 pg/ml, p<0.05)。 さ ら に 、 自 己 免 疫 性 炎 症 性 筋 疾 患 患 者 の 筋 生 検 組 織 に て
3
ADAM-17の発現を確認した。
結語：ADAM-17は自己免疫性炎症性筋疾患患者、特に間質性肺炎合併患者に 発現してお り、肺 の線 維化におい て何ら かの 役割を担っ ている 可能 性が示唆さ
れた。ADAM-17は間質性肺炎合併自己免疫性炎症性筋疾患において治療標的と
なり得る可能性がある。
キ ー ワ ー ド ：ADAM-17、 自 己 免 疫 性 炎 症 性 筋 疾 患 、 間 質 性 肺 炎 、 fractalkine/CX3CL1、CXCL16
緒言
多発性筋炎(PM)と皮膚筋炎(DM)は自己免疫性炎症性筋疾患である 1)。DM は 特徴的な皮膚症状と筋力低下を認める 2)。しかしながら、PM はDM で見られる ような皮膚症状はなく亜急性のミオパチーと定義される 3)。さらに、amyopathic
DM (ADM)は典型的な DM の皮膚症状はあるが、筋力低下は乏しいか存在しな
いような患者において 臨床的に診断される 4)。PM/DM はしばしば間質性肺炎
(ILD)を合併する 5)。PM/DMにおける ILDはこれらの疾患における急速な経過
での死亡の主要な原因となる 6)。いくつかの研究では臨床的な ADM(clinically
ADM: CADM)の患者において急速に進行する ILD は予後を不良にしているこ
とを示している7)。これらの患者はしばしば、高用量の副腎皮質ステロイドや免 疫抑制剤を 含んだ 集中 的な治療に 抵抗性 であ り、致命的 な呼吸 不全 に至ってい
4
る8)。CADMにおける急速進行性の間質性肺炎は主にアジアでの報告が多い 9)。
“A disintegrin and metalloprotease”(ADAM) family は生体内での組織障害 や炎症反応において重要な役割を担っていると考えられている 10)。ADAMs は 炎症性サイトカインの細胞表面からの切断においても関与している 11)。
ADAM-17はtumor necrosis factor (TNF)- α のshedding に関与する蛋白分 解酵素として最初に発見された 12)。さらに、ADAM-17はfractalkine/CX3CL1 やinterleukine (IL)-6 受容体のような膜結合型のサイトカインやサイトカイン レセプター を生理 的に 切断し 、そ れらを 可溶 性の形態に 放出す るの に関与して いる 13)。免疫調整における ADAM-17 の潜在的な重要性は、この酵素が気道炎 症や関節炎 などを 含む いくつかの 病理学 上の 状態の効果 的な治 療標 的となって いることである14,15)。また、ADAM-17は関節リウマチ患者の滑膜組織、主にマ クロファージや線維芽様の滑膜細胞や軟骨に発現している 12)。異常な ADAM- 17 活性や発現は、関節リウマチを含むいくつかの病理学的な進展の一因となっ ている可能性が指摘されている 16)。Fractalkine/CX3CL1 は実験的に作り出さ れた自己免疫 性炎症性 筋疾患 のネズ ミのモデ ルの侵された 筋肉に発 現しており 、
CX3CR1 は筋肉内に浸潤している CD4 陽性、CD8 陽性 T 細胞およびマクロフ
ァージに発現していた 17)。さらに、血清中の可溶性 CX3CL1 値はPM とDM 患 者において上昇しており、疾患活動性と相関していた 17)。
しかしながら、自己免疫性炎症性筋疾患における ADAM-17 の機能は明らか とはなっていない。そこでわれわれは自己免疫性炎症性筋疾患における ADAM-
5
17の発現、特にADAM-17と ILDとの関連を検証した。
研究方法 1 患者
2003年から 2015年に PM(男性9 名、女性 17名)、DM(男性 12名、女性 22 名)、CADM(男性4名、女性 6名)と診断された患者計 70名(男性25名、女性 45 名)のデータを使用した。患者は Bohan & Peter の診断基準18)に則って診断され た。血清は治療前および治療後の患者から採取した。治療に関しては、17 名の 患者は副腎皮質ステロイドのみで加療され、51 名の患者が副腎皮質ステロイド、
免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、アザチオプリ ン、シクロホスファミド大量点滴静注療法など)で加療された。1 名は加療なし、
1名は転院のため治療経過が不明であった。また、対照として健常者 19 名(男性 4名、女性 15名)の血清を使用した。
2 診断方法
1) ILDは労作時息切れ、乾性咳嗽、胸部聴診での fine crackles、胸部 X線およ び high resolution computed tomography で の 網 状 影 や ground-grass-
opacityなどの臨床所見によって診断された。
2) 一般的に、CADMは ADMとhypomyopathic dermatomyositis (HDM)を合 わせたものをいう。CADM は筋力低下の症状や所見に乏しく、CK 値は正常 であるが、ゴットロン徴候やヘリオトロープ疹などの皮疹は伴うような特徴
6
がある19)。病理組織は正常な筋肉組織に、正常かわずかにリンパ球の浸潤が ある程度である20)。上記を満たすものを CADM とした。
3 疾患活動性
筋肉痛、皮膚症状、対称性の近位筋の筋力低下、CK 上昇、緩徐にまたは急速 に進行するILDの程度などで定義した。
4 倫理的配慮
この研究に 関与す るす べての患者 からイ ンフ ォームドコ ンセン トを 取得した。
この研究は昭和大学医学部の倫理委員会より承認を得た(No. 1892)。
5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
健常者血清中のADAM-17、自己免疫性炎症性筋疾患患者の副腎皮質ステロイ ド and/or 免 疫 抑 制 剤 に よ る 治 療 開 始 の 前 後 で 、 血 清 中 の ADAM-17、 fractalikine/CX3CL1、CXCL16を製品プロトコールに則って ELISA kit (R&D
Systems, Minneapolis, MN)にて測定した。96well のプレートを一次抗体としての
mouse 抗 human 抗体でコーティングし、血清、リコンビナント ADAM-17、
fractalkine/CX3CL1、CXCL16 を加えた。その後、プレートを洗浄し、ビオチ
ン化されたgoat抗 mouse抗体を加え、streptavidin-horseradish peroxidase を加え た。プレートは tetramethylbenzidine substrate (TMB; Sigma -Aldrich, ST. Louis, MO) を使用し、マイクロプレートリーダーで測定された。それぞれのサンプル濃度は
450nmで測定された。
6 免疫染色
7
ADAM-17の発現の解析のため、筋炎組織を免疫染色で検討した。切片は 10μ
g/mlの rabbit anti-human ADAM-17抗体 (Abcam, Cambridge, MA)、またはコント ロールとしてのrabbit IgGを用いた。ビオチン化された goat anti-rabbit IgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を二次抗体として使用した。その後、Vectastain ABC HRP reagent (Vector Laboratories)を加えた。DAB peroxidase (HRP)を使用した。切 片はヘマトキシリンを用いて対比した。核を青色、抗原抗体反応をみて、染色さ れたものを茶色、として対比した。
7 統計
Mann-Whitney U testおよびStudent’s t-test を使用し等分散と仮定し解析した。
自 己 免 疫 性 炎 症 性 筋 疾 患 患 者 か ら の 血 清 に お い て 、 ADAM-17 と
fractalkine/CXCL1またはCXCL16との関連はSpearmanの順位相関係数の検定を 使用し評価し、means ± SEMとし、P<0.05を有意とみなした。
結果
1 患者背景
患者背景は70 名中PM 26名、DM 34名、CADM 10名で、46 名の患者(66%)が
ILDを合併していた。17 名は副腎皮質ステロイドのみで加療され、52名の患者 が副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤で加療された。1 名は加療なし、1 名は転院
のため治療経過が不明であった。また、6名の患者が死亡した(Table 1)。
ILD合併患者 PM16名、DM20 名、CADM10名の血清 KL-6値は、ILD 非合併 患者と比較し、著しく高値であった。抗 Jo-1抗体陽性患者の全員が ILDを合併
8 していた(Table 2)。
2 自己免疫性炎症性筋疾患患者の組織での ADAM-17の発現
まず初め に、わ れわれ は 自己免 疫性 炎 症性筋 疾患 患者 の治療 開始前 の筋組織
におけるADAM-17の発現免疫組織学的な解析を行った。ILD合併の PMの筋生
検組織においてADAM-17の発現を認めた(Figure 1A、1B)。
3 自己免疫性炎症性筋疾患患者血清中の ADAM-17の発現
自己免疫性 炎症性筋疾患 患者血清中の ADAM-17 はコントロールである健常 者(n=19)と比較して有意に高値であった(mean ± SEM; 1048 ± 312 pg/ml and 36 ± 18 pg/ml, p<0.05, Figure 2A)。ADAM-17は PM、DM、CADM間で有意の差はなか った。自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中に ADAM-17 の存在を確認した後 に、われわれは ADAM-17の値が治療介入後に減少するかどうかを検討した。副 腎皮質ステロイド and/or 免疫抑制剤で治療後の患者血清中の ADAM-17 は、治 療前と比較し有意に減少していた(1465 ± 562 pg/ml and 1059 ± 503 pg/ml, p<0.01, Figure 2B)。
4. 自己免疫性炎症性筋疾患患者血清中の fractalkine/CX3CL1 および CXCL16 の 発現
Fractalkine/CX3CL1 は自己免疫性炎症性筋疾患患者の筋組織に発現しており、
疾患活動性と相関した 17)。Fractalkine/CX3CL1はADAM-17によって切り離され る炎症性サイトカインの一つである。ADAM-17と fractalkine/CX3CL1 とは有意 に正に相関していた(Figure 2C)。さらに、fractalkine/CX3CL1 は炎症性筋疾患患
9
者 の 侵 さ れ た 筋 肉 や 肺 へ の 炎 症 細 胞 浸 潤 に 寄 与 し て い る と 報 告 さ れ て い る 。
CXCL16もまたADAM-17に切り離される炎症性サイトカインとして報告されて
いる。ADAM-17はCXCL16 と有意に正の相関をしていた(Figure 2D)。
5 ILD合併自己免疫性 炎症性筋疾患患者血清中の ADAM-17とADAM-15 につい
て
ILD合併の自己免疫性炎症性筋疾患患者(n=46)の血清中のADAM-17はILD非 合 併 の 自 己 免 疫 性 炎 症 性 筋 疾 患 患 者(n=24)の そ れ と 比 較 し 著 明 に 上 昇 し て い た (1379 ± 454 pg/ml and 413 ± 226 pg/ml, p<0.05, Figure 3A)。一方で ADAM-15は
ILD合併、非合併の患者間で明らかな差はみられなかった。また、ADAM-17は 治療前の血清 KL-6 値と有意な正の相関を認めた(Figure 3B)。治療前後の KL-6 の差(ΔKL-6)とは有意な相関は認めなかった(Figure 3C)
考察
ADAM-17 は TNF-α、インターロイキン 6 受容体(IL-6R)、fractalkine/CX3CL1 などのよう なサイ トカ インやケモ カイン を切 り離すメタ ロプロ テア ーゼとして
発見された。TNF-αや IL-6は関節リウマチ(RA)の病因に関与しており、抗 TNF- α や抗 IL-6 は RA の治療のために作り出された。自己免疫疾患の観点からは、
RAにおける ADAM-17が研究されている。Ohtaらは RAの滑膜組織における蛋
白レベルにおいてADAM-17の発現が、変形性関節症におけるそれと比較し著し く強かったということを報告した 21)。Margheritaらもまた Furin、ADAM-17、TNF-
10
α、tumor-necrosis-factor enzyme (TACE)、TNF-α-Amphireglin protein (AREG)がシ ェーグレン 症候群 患者 の唾液腺の 腺房細 胞や 管細胞にお いて同 定さ れ、健常者 のコントロ ールか ら採 取された唾 液腺の 組織 と比較し著 しく増 えた ことを報告 した 22)。この研究において、われわれは 自己免疫性炎症性筋疾患患者の組織に
おいてADAM-17が発現していることを初めて見つけた。
次にわれわれは 自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中の ADAM-17 の発現に 焦点を置いた。自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中の ADAM-17はコントロー ルである健常者と比較し、著明に高値であることを明らかにした。われわれは以
前にRA患者の血清中の ADAM-17は健常者のそれと比較し著明に高値であるこ とを報告している 16)。サイトカインの発現に関しては、Lundberg らは自己免疫 性炎症性筋疾患患者の筋肉の組織においてサイトカインの発現は IL-1α、IL-1β、
transforming growth factor (TGF) β-3 が優位であったということを報告している
23)。われわれは ADAM-17の値は治療介入後に減少したことも示した。これらの 結果は、ADAM-17の発現が自己免疫性炎症性筋疾患の活動性と関連しているこ とを示唆している。
De BleeckerらはヘルパーT 細胞によって最も産生されるTNF-αは筋線維の萎
縮を引き起こし、主要組織適合複合体- I (MHC-I)と接着分子の発現を刺激してい
ることを報告した24)。Suzuki らは治療介入後の患者血清中の fractalkine/CX3CL1 は治療介入 前の患 者血 清中のそれ と比較 し著 明に減少し ている こと を報告した
17)。 わ れ わ れ は 自 己 免 疫 性 炎 症 性 筋 疾 患 患 者 に お い て ADAM-17 が
11
fractalkine/CX3CL1と相関していること、また、サイトカインやケモカインの分
泌を介して関与していることを明らかにした。
興味深いことに、Suzukiらは fractalkine/CX3CL1と CX3CR1の相互作用が ILD 合併の PM および DM において侵された筋肉と肺組織への炎症細胞浸潤に寄与 している可能性を示した 17)。Gonoらは IL-6、IL-8、TNF-α、interferon gamma- induced protein-10 (IP=10)/CXCL10 に よ り 動 員 さ れ る イ ン タ ー フ ェ ロ ン γ は
PM/DMにおける全体的な疾患活動性と関連しており、これらのサイトカインの
値は特にILD合併において高値であったことを示した 25)。われわれは ILD合併 の自己免疫性炎症性筋疾患患者において、ILD非合併患者と比較しADAM-17が 著明に高値 であっ たと いうことを 示した 。わ れわれの結 果は上 記の 報告を支持
している。合わせて、これらの結果は ADAM-17がILDと関連していることを明 らかにした。
結語
まとめると、われわれは自己免疫性炎症性筋疾患患者の筋生検組織に ADAM-
17 が発現していることを初めて見出した。自己免疫性炎症性筋疾患患者におい
て血清ADAM-17は健常者と比較し有意に高値であった。血清 ADAM-17は副腎
皮質ステロイドや免疫抑制剤での治療開始後に有意に減少した。ILD合併患者に おける血清 ADAM-17 は ILD 非合併患者と比較し有意に高値であった。これら のことは、ADAM-17が特に ILD合併自己免疫性炎症性筋疾患において治療標的
12 となり得ることを示唆している。
利益相反 なし
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17 Table 1: 患者背景
PM DM CADM Tot al
人数(%) 26( 37) 34( 49) 10(14) 70 女性の人数 ( % ) 17 (65) 22 (65) 6 ( 60) 45 (64)
年齢(歳) 57.2 ± 3.3 58.9 ± 2.8 53.8 ± 3.7 57.5 ± 1.9 新規発症数 25 29 10 64
血清 CK値 (IU/ l )
2864.6 ± 648.8
2603.9 ± 508.2
126.1 ± 35.6
2346.8 ± 358.9
IL D合併例 ( % ) 16 (62) 20 (59) 10 (100) 46 (66) 抗Jo-1抗体
陽性例 ( % )
4 (15) 3 ( 9) 1 ( 10) 8 ( 11)
副 腎 皮 質 ス テ ロ イ ドのみで加療(%)
6(23) 11(32) 0(0) 17(24)
副 腎 皮 質 ス テ ロ イ ド ＋ 免 疫 抑 制 剤 で 加療(%)
18(69) 23(68) 10(100) 51(72)
18 Table 2: ILD合併群と非合併群との比較.
IL D non ILD p val ue
人数(人) 46 24
年齢(歳) 57.5 ± 2.1 57.6 ± 3.7 0.665 女性の人数 ( % ) 35 ( 76) 10 (42)
PM/ DM/ CADM 16/ 20/ 10 10/ 14/ 0 血清 LDH値
(U/ l )
529.1 ± 52.2 570.8 ± 75.6 0.553
血清 CK値 ( IU/ l ) 1718.6 ± 319.5 3550.7 ± 805.2 0.039 血清K L-6値
( U/ ml )
790.8 ± 99.6 568.1 ± 207.1 0.006
抗 Jo-1抗体 陽性例(人)
8 0
19 図の説明
Figure 1
ADAM-17 は 自 己 免 疫 性 炎 症 性 筋 疾 患 患 者 の筋 組 織 上 に 発 現 し て いる 。A-D) 自己免疫性炎 症性筋疾 患 患者からの 筋組織の 検体の顕微鏡 写真をそ れぞれ示す 。
AとB) ADAM-17 で染色された切片である。ADAM-17が炎症細胞上に発現して
いる(円と矢印で示す)。A) 100 倍、B) 400倍。Cと D) コントロールIgG で染色 された切片である。C) 100倍、D) 400倍。
Figure 2
ADAM-17 は自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中で発現している。A) 自己
免疫性炎症性筋疾患患者の血清中の ADAM-17 は健常者のコントロールの血清 中のそれより有意に高値であった。B) 自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中の
ADAM-17 はステロイド and/or 免疫抑制剤による治療後に減少した。C) 自己免
疫性炎症性筋疾患患者の血清中のADAM-17はfractalkine/CX3CL1と有意に正の 相関を示した。D) 自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中のADAM-17はCXCL16 と有意に正の相関を示した。(n=number, p value<0.05)
Figure 3
A) ILD合併の自己免疫性炎症性筋疾患患者の血清中の ADAM-17 は ILD非合併
の自己免疫性炎症性筋疾患患者のそれと比較し有意に上昇していた。B) ADAM- 17 は治療前の血清 KL-6 値と有意な相関を認めた。C) ADAM-17 は治療前後の KL-6の差(ΔKL-6)とは有意な相関は認めなかった (n=number, p value<0.05)
20 Figure 1
ADAM-17 rabbit IgG
×100
×400
C A
B D
21 Figure 2
A
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
inflammatory myopathy (n=70)
healthy control (n=19)
ADAM-17 in serum (pg/ml)
*
* p<0.05
22 B
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
pre treatment post treatment
ADAM-17 in serum (pg/ml)
**
**p<0.01 n=31
23 C
fractalkine/CX3CL1 (pg/ml) 0
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
0 5000 10000 15000 20000 25000
ADAM17 in serum (pg/ml)
r=0.27 p<0.05
24 D
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
0 200 400 600 800 1000 1200
ADAM17 in serum (pg/ml)
CXCL16 (pg/ml)
r=0.34 p<0.01
25 Figure 3
A
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
ADAM-17 in serum (pg/ml)
ILD n=46
non ILD n=24 p<0.05
26 B
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
ADAM-17 in serum (pg/ml)
KL-6 (U/mL)
r=0.35 p<0.05 (n=53)
27 C
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
ADAM-17 in serum (pg/ml)
ΔKL-6 (U/mL)
28
ADAM-17 is expressed in the inflammatory myopathy, and is involved
with interstitial lung disease
Airi Nishimi, Takeo Isozaki, and Tsuyoshi Kasama
Division of Rheumatology, Department of Medicine, Showa
University School of Medicine, Tokyo, Japan
Abstract
Introduction/objectives: The “A disintegrin and
metalloprotease” (ADAM) family is thought to play an important role
29
in tissue destruction and inflammatory reactions. ADAM -17 was first
described as the protease responsible for tumor necrosis factor (TNF)-
α shedding. Here, we have revealed the expression of ADAM-17 in
inflammatory myopathy and demonstrated the role of inflammation in
interstitial lung diseases (ILD).
Material and method: ADAM-17 in inflammatory myopathy
serum [polymyositis (n=26), dermatomyositis (n=34) and clinically
amyopathic dermatomyositis (n=10)] and healthy control (n=19) was
measured using enzyme-linked immunosorbent assay. The relationship
between ADAM-17 and clinical data was examined. We performed
30
immunohistological analysis to investigate the expression of ADAM -
17 on the muscles of the inflammatory myopathy patients.
Results: ADAM-17 in inflammatory myopathy was
significantly higher than in healthy control (mean ± SEM; 1048 ± 312
pg/ml and 36 ± 18 pg/ml, respectively, p<0.05). ADAM-17 in post
treatment with corticosteroid and/or immunosuppressant serum was
significantly decreased compared with in pre treatment serum (1465 ±
562 pg/ml and 1059 ± 503 pg/ml, respectively, p<0.01). ADAM -17
was significantly positive correlated with fractalkine/CX3CL1 and
CXCL16. In addition, ADAM-17 in inflammatory myopathy with ILD
31
