雌ウマの卵巣機能調節機構に関する研究

Title

雌ウマの卵巣機能調節機構に関する研究( 内容の要旨 )

Author(s)

長嶺, 夏子

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第087号

Issue Date

2001-03-13

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/2141

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

氏 名(本籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及 び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 長 嶺 夏 子 (熊本県) 博士(獣医学) 獣医博甲第87号 平成13年3月13日 学位規則第4条欝1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 東京農工大学 雌ウマの卵巣機能調節機構に関する研究 主査 東京農工大学 教 授 田 谷 副査 帯広畜産大学 教 授 山 田 副査 岩 手 大 学 教 授 三 _宅 副査 東京農工大学 教 授 加茂前 副査 岐 阜 大 学 教 授 工 藤 論 文 の 内 容 の 要 旨 善 三一夫 明 一純陽 秀 忠 ウマは､典型的な長日性繁殖動物であり､日本では､春から初夏にかけて繁殖期を迎え､ 雌ウマは約21日周期で排卵を繰り返し､雄ウマは､精巣での造精機能が先進する｡雌ウマ は､生殖生理学上多くの特性を有しており､卵巣機能調節機構について■も未だ不明の点が 多い｡ 本研究では､ウマの卵巣機能調節機構の解明を目的として､近年新しい卵巣ホルモンと してその生理作用が明らかにされつつある｢インヒビン｣の作用■を中心に基礎的研究を行 った｡また､■その基礎的知見を基にして､ウマ生産現場で間恩となっている原因不明の不

妊症および早期涜産についてその病因を解析する目時で､実際にこれらの症状を呈した繁

殖雌ウマについて内分泌学的に精査した｡さらに､■ウマ生産現場で将来応用可能なホルモ

ンの測定法について検討した｡

第1章では､緒論として､ヒトとウマの共生の歴畢､雌ウマの繁殖特性､インヒビンの

発見とウマにおけるインヒビンの研究､卵胞発育とFSH分泌調節､雌ウマの繁殖障害､ホ ルモンの測定法の改良と臨床応用について記述し､本研究の目的を述べた｡ 第2章では､本研究に共通する実験材料および方法について記述した｡ 第3章では､正常に発情周期を回帰する雌ウマの卵巣機能調節に関与する下垂体および

卵巣ホルモンの分泌状態を明らかにする目的で､①血中各種ホルモン濃度の変化､②超音 波画像診断装置を用いた卵巣の観察および③免疫組織化学キこよるインヒビンサブユニット とステロイド生合成酵素の局在についての知見をまとめた｡ 発情周期を回帰する雌ウマの卵巣機能を､内分泌学的および免疫組織化学的手法を用い て検討した｡①血中インヒビンおよびエストラジオール濃度は､いずれも卵胞期に上昇し､ 排卵1日前から低下し､黄体期には低値を示した｡インヒビンは､排卵日に一過性の上昇

が認められた｡②卵胞のサイズ別に卵胞液中各種ホルモン濃度を測定した結果､インヒビ

ンpro-αC､インヒビンAおよびエストラジオ丁ル濃度は､卵胞のサイズが大きくなるに

伴い濃度が上昇した｡インヒビンB濃度は､小型卵胞に比べて中型および大型卵胞で高い

値を示した｡③インヒピンα鎖､βA鎖およびβB鎖並びにα鎖とβA鎖の戯Aは､小型､

中型および大型卵胞の顆粒層細胞と大型卵胞の内卵胞膜細胞に局在が認められた｡以上の

結果から､雌ウマでは､卵胞が発育初期からインヒビンを分泌し､成熟に伴ってインヒピ ンAとエストラジオールの分泌量が著しく増加するものと推察された｡ 第4章では､本論文筆3章の研究で発見した周排卵期で認められた血中イ･ンヒビン濃度 の一過性上昇と排卵の関係についての知見をまとめた｡ 血中インヒビン濃度の上昇と排卵時刻との関係を明らかにする目的で､卵巣に直径 3.5cmの卵胞が出現した時点から4時間ごとに血中ホルモン濃度を測定し､排卵との関係 をリアルタイムに解析した｡その結果､成熟した卵胞が破裂する時刻に一致して血中 i皿mOreaCtive(ir)-J(ンヒビン､インヒビンPrO-αCおよびインヒビンA濃度が一過性に 上昇することが判明した｡以上の事実から､この現象は､成熟した卵胞が排卵に際して破 裂する際にインヒビンを多量に含有した卵胞液が腹腔内に漏出し､そのインヒビンが血中 へ吸収ざれる結果､血中インヒビン濃度が一過性に上昇することにより生ずるものと推察 された｡ 第5章では､ウマ生産現場で最も深刻な問窺となる早期胚死滅の診断ある･いは早期妊娠

診断等に応用するための基礎的知見を得る目的で､妊娠初期における各種ホルモンの分泌

ついて精査した｡その結果､_血中草体形成ホルモン(L田濃度は､基底値を維持し､交配

後60日頃をピークとしてウマ絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)の分泌が認められた｡血中

卵胞刺激ホルモン(FSH)およびir-インヒビン濃度は､それぞれ平均15日および8∼18 日間隔でウェーブ状の変動を示したム血中エストラジオール濃度は､ウェーブ状の変動を

示す個体が多かったが､ウエーブの間隔には個体差が認められた｡血中プロジェ欠テロン

濃度は､妊娠20∼40日の間に一度低下する傾向 を示し､40日以降はeCG の上昇に伴って

再甲上昇した｡血中テストステロン濃度は､妊娠40日頃にeCGめ分泌上昇に伴って明らか

な上昇を示じた｡以上の結果から､妊娠初期のeCG分泌開始までの間は､いわゆる卵胞発 育ウェーブが出現しているものと推察された｡

第6章では､ウマ生産現場で深刻な問題の一つである原因不明の不妊症について内分泌 学的に検討する目的で､①交配時に劉ナる雌ウマの内分泌状態と受胎の関係､②原因不明 の不妊症､および③顆粒膜細胞腫についての知見をまとめた｡ 1)交配時における雌ウマの内分泌状態と受胎の関係

交配時の雌ウマの血中エストラジオールとブロジエステロン濃度により､4群に分類し

た(第1群:p≧1ng/皿しE≧20pg/ml;第2群:P≧1喝/皿1､E<20pg/ml;尭3群:P<1 ng/ml､E≧20pg/血1;第4群:P<1ng/ml､E<20pg/皿1)｡その結果､交配時の雌ウマの数 は､第3群(60.0%)>第4群(26.鴫)>第1群(7.6%)>第2群(6.4%)の順であっ

た｡それぞれの群内での受胎率は､第1群で25.9%､第2群で17.8%､東3群で51.7%

および第4群で41.8%であり､第3群の受胎率が最高値を示した｡次いで､これらの雌ウ マの交配時における発情教候を､-1∼3までの5段階に分類した｢試情スコア｣を作成し

て検討した結果､いずれの群においても試情スコア0∼1が最も受胎率の高い内分泌状琴

であることが判明した｡ 2)原因不明の不妊症 競走馬の生産現場で原因不明のまま複数回の交配を繰り返した7頭の雌ウマについて､ 血中各種ホルモン濃度を継続的に測定した結果､いずれも交配時に血中プロジエステロン 濃度が1ng/mlと高い値を示した｡これらの中には､子宮内に子宮内膜杯の遺残が疑われ た症例､子宮内膜炎に伴うshortlutealpha,Seを示した症例､あるいは､泌乳ストレスに よる卵巣静止が疑われる症例等が観察された｡ 3)顆粒膜細胞腫 顆粒膜細胞腫と診断された3頭の雌ウマの内分泌学的特徴を精査した｡ 内分泌学的特徴をまとめると以下のごとくである｡①血中LHとFSH.濃度は､雌ウマの発 情周期中の値と比較して低いかあるいは著しく高いかの2通りのバターンを示した｡②血 中ir-インヒビンとテストステロン濃度は､雌ウマの上限値と同レベルかあるいは､著し

く高いレベルを示した｡③血中エストラジオールとプロジエステロン濃度は｣低値を維持

した｡また､④腫瘍摘出手術により､全例共血中ir-インヒビン濃度が明らかに減少した｡ さらに､羅患卵巣におけるインヒビンサブユニット(α鎖､βA鎖､βB鎖)の局在を調べ た結果､上記3種類のサブユニットのすべてが腫瘍組織に局在するものと､α鎖のみが局 在するものがあり腫瘍のインヒビン分泌能は多様であることが明らかとなった｡以上の結

果から､顆疲膜細胞腫は､インヒビンを分泌することが確認されたが､分泌されるインヒ

ビンの種類と分泌量は､腫瘍細胞により異なるもめと推察された｡

第7章で埠､ウマ生産現場で応用可能な内分泌検査法について検討する目的で､放射性

同位元素を用いないエンザイムイムノアヅセイ(EIA)と時間分解蛍光測定法(TR-FIA)に

よるプロジエステロンとテストステロンの測定法について検討した｡それぞれの測定法で

得られた値を､現在広く用いられているラジオイムノアツセイ(RIA)により測草した値と

比較すると､測定値は多少異なる場合もあるが変動パターンは良く一致したことから､EIA とTR-FIAは､いずれも臨床での応用が可能と考えられた｡ 審 査 結 果 の _要 旨 本研究では､ウマの卵巣機能調節機構の解明を目的として､近年新しい卵巣ホルモンと してその生理作用が明らかにされつつある｢インヒビン｣の作用を中心に基礎的研究を行 った｡また､その基経的知見を基にして､ウマ生産現場で問題となっている原因不明の不 妊症および早期涜産についてその癖困を解析する目的でこ実際にこれらの症状を呈した繁 殖雌ウマについて内分泌学的に精査した｡さらに､ウマ生産現場で将来応用可能なホルモ ンの測定法について検討した｡ 1.正常発情周期中の卵巣機能調節

発情周期を回帰する雌ウマの卵巣機能を､内分泌学的および免疫組織化学的手法を用い

て検討した｡i)血中インヒピンおよびエストラジオール濃度は､いずれも卵胞期に上昇し､

排卵1日前から低下し黄体期には低値を示した｡インヒビンは､排卵日に一過性の上昇が

認められた｡2)卵胞のサイズ別に卵胞液中各種ホルモン濃度を測定し卑結果､インヒビン

pro-αC､インヒビンAおよびキストラジオール濃度は､卵胞のサイズが大きくなるに伴い 濃度が上昇した｡インヒビン針濃度は､一小型卵胞に比べて中型および大型卵胞で高い値を 示した｡3)インヒビンα鎖､βA鎖およびβB鎖並びにα鎖とβA鎖の血甜Aは､小型､中 型および大型卵胞の顆粒層細胞と大型卵胞の内卵胞膜細胞に局在が認められた｡以上の結 果から､雌ウマでは､卵胞が発育初期からインヒビンを分泌し､成熟に伴ってインヒビン Aとエストラジオールの分泌量が著しく増加するものと准察された｡ 2.周排卵期における各種ホルモン分泌

血中インヒビン濃度の上昇と排卵時刻との関係を明らかにする目的で､卵巣に直径

3.5鱒の卵胞が出現した時点から4時間ごとに血中ホルモン濃度を測定し､排卵との関係 をリアルタイムに解析した｡その結果､成熟した卵胞が破裂する時刻に一致して血中 i皿munOreaCtive(ir)-インヒビン､インヒビンPrO一年CおよびインヒビンA濃度が一過性に 上昇することが判明した｡以上の事実から､この現象は､成熟した卵胞が排卵に際して破

裂する際にインヒビンを多量に含有した卵胞液が腹腔内に漏出し､そのインヒビンが血中

へ吸収される結果､血中インヒビン濃度が一過性に上昇することにより生ずるものと推察 された｡ 3.妊娠初期の内分泌学的特徴

ウマ生産現場で最も深刻な問題となる早期胚死滅の診断あるいは早期妊娠診断等に応用 するための基礎的知見を得る目的で､妊娠初期における各種ホルモンの分泌ついて精査し た｡その結果､血中黄体形成ホルモン(LH)濃度は､基底値を推持し､交配後60日頃をピ ークとしてウマ絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)申分泌が認められた｡血中卵胞刺激ホルモ

ン(FSH)およびir一インヒビン濃度は､それぞれ平均15日および8∼18日間痕でウェー

ブ状の変動を示レた｡血中エストラジオール濃度は､ウェーブ状の変動考示す個体が多か

ったが､ウェーブの間隔辛こは個体差が認められた｡血中プロジエステロン濃度は､妊娠20 ∼40白の間に一度低下する傾向を示し､40日以降はeCGの上昇に伴って再び上昇した｡血 中テストステロン濃度は､妊娠40日頃にeCGの分泌上昇に伴って明らかな上昇を示した｡ 以上の結果から､妊娠初期のeCG分泌開始までの間は､いわゆる卵胞発育ウェーブが出現 しているものと推察された｡ 4.不妊症馬の内分泌像 本研究では､不妊症馬の内分泌像を明らかにすべく､次の3項目について精査した｡ 1)交配時における雌ウマの内分泌状態と受胎の関係 交配時の雌ウマの血中エストラジオールとプロジエステワン濃度により､4群に分類し た(第1群:P≧1ng/ml､E≧20pg/ml;第2群:P≧1ng/ml､E<20pg/ml;第3群:P<1 ng/ml､E≧20pg/ELl;第4群:P<1ng/ml､E<20pg/ml)｡その結果､交配時の雌ウマの数 は､第3群(60.0%)>第4群(26.硝)>第1群(7.6%)>第2群(6.4%)の順であっ た｡それぞれの群内での受胎率は､第1群で25.9%､第2群で17.8%､第3群で51.7% および第4群で41.8%であり､第3群の受胎率が最高値を示した｡次いで､これらの雌ウ マの交配時における発情敏候を､-1∼3までの5段階に分類した｢試情スコア｣を作成し て検討した結果､いずれの群においても試情スコア0∼1が最も受胎率の高い内分泌状態 であることが判明した｡ 2)原因不明の不妊症

競走馬の生産現場で原因不明のまま複数回の交由を繰り返した7頭の雌ウマについて､

血中各種ホルモン濃度を継続的に測定した結果､いずれも交配時に血中プロジエステロン 濃度が1ng舟1と高い値を示した｡これらの中には､子宮内に子宮内膜杯の遺残が疑われ た症例､子宮内膜炎に伴うsbortlutealpbaseを示 した症例､あるいは､泌乳ストレスに よる卵巣静止が疑われる症例等が観察された｡ 3)顆粒膜細胞腫

顛粒膜細胞腫と診断された3頭の雌ウマの内分泌学的特徴を精査レた○

内分泌学的特徴をまとめると以下のごとくである｡①血中LHとFSH濃度は､発情周期中 の雌ウマの値と比較して低いかあるいは著しく高いかの2通りのパターンを示した｡②血

中ir-インヒビンとテストステロン濃度は､雌ウマの上限値と同レベルかあるいは､著し く高いレベルを示した｡③血中エストラジオールとプロジエステロン濃度は､低値を維持

した｡､また､④腫瘍摘出手術により､全例共血中ir-インヒビン濃度が甲らかに減少した｡

さらに､羅患卵巣におけるインヒビンサブユニット(α鎖､βA鎖､卵鎖)の局在を調べ

た結果､上記3種類のサブユニットのすべてが腫瘍組織に局在するものと､α鎖のみが局

在するものがあり腫瘍のインヒビン分泌能は多様であ阜ことが明らかとなった｡･以上の結

果から､顆粒膜細胞腫は_､インヒビンを分泌することが確認されたが､分泌されるインヒ ビンの種類と分泌量は､腫瘍細胞により異なるものと推察された｡ 5.ホルモン測定法の検討と臨床応用 ウマ生産現場で臨床応用が可能な測定法として､放射性同位元素を用いないエンザイム

イムノアツセイ(EIA)と時間分解蛍光測定法(TR-FIA)によるプロジエステロンとテスト

ステロンの測定法について検討した｡それぞれの測定法で得られた値を､現在広く用いら

れているラジオイムノアツセイ(RIA)により測定した値と比較すると､測定値は多少異な

る場合も奉るが変動パターンは良く一致..したことから､EIAとTR-FIAは､いずれも臨床で

の応用が可能と考えられた｡ 以上について､審査委貞全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論 文として十分に価値あるものと認めた｡

学位論文の基礎となる学術論文

1･Nagamine,N･,Nambo,Y,Nagata,S･,Nagaoka,K･,Tsunoda,N･,職niyama,H･,

Tanaka,Y,Tbhei,A.,W誠anabe,G.and

_{Taya,K.L(1998)Inhibin}

_{secretionin the}

rhare:localizationofinhibinα,βA,andPBSubunitsintheovaryBiology'of

Reproduction59,1392-1398.

既発表学術論文

1･Kishi,H･,Kondoh,M.,甲agamine,N.,Shi,F.,Wぬnabe,G.andTaya,K.(1997)Rol由

Ofthebasal1evelofLHandFSHrintheregulationoffo11iculardevelopmentduring PSeudopregnancyintherat･JournalofReproductionandDevelopment43,279-287･ 2･Nambo,Y,Kaneko,H.,Nagata,S.,Oika申,M.,Ybshihara,T.,Nagamine,N.,

Ⅵねtanabe,G･andTaya,K･(1998)E飴ctofpassiveimmunizationagainstinhibinon

FSHsecretion,fo11iculogenesisandovu1ationrateduringthefo11icularPhaseofthe estrouscycleinmares.Theriogenology50,545-557: 3二Nagata,S･,TsunOda,N.,Nagamine,N.,Tanaka,Y,Taniyama,H.,Nambo,Y,

Wぬnabe,G.andTaya,K.(1998)Tbsticularinhibinin.thestallion:Cellularsource

andseasonalchangesinitssecretion.`BiologyofReproduction59,62-68.■

4･Nagata,S･,Miyake,Y-I･,Nambo,Y,Nagamine,N･,･Watanabe,G･,T如noda,N･,

Taniyama,H･,Hondo,E･,%maヰJ･andTaya,K･(1998)Inl1ibinsecretioninthe

Stal1ion.EqulneV如erinaryJouma130,98-103. 5.N?gaOka,K.,Nambo,Y,Nagamine,N.,Nagata,S.,Tanaka,Y,Shinbo,H.,Tsunoda,N.,

Taniyama,HっW如anabe,G.,Groome,N.PandTaya,K(1999)Aselectiveincreasein

Circulat享nginhibinandinhibinpro-αCatthetimeofovu1ation,inthemare･American

JournalofPhysiology277･鱒ndocrinologyandMetabolism40),E870qE875･

6.-Kishi,H.,koh,M.,Ⅵhda,S.,%kinari,Y,Tanaka,Y,Nagamine,N.,〈Jin,W-Z.,

Watanabe;G.andTaya,K.(2000)k血ibinisanimportantfactorintheregulationQf

FSH _secretionin the _{adult male} hamster.AmericanJournalof Physiology EndocrinologyandMetabolism278,E744-E751.