研究 要因 関す 変化 誘 け 網膜電図 発糖尿病

金 沢大 学十 全医 学 会 雑 誌 第1 0 8巻 第3 号 3 0 3 ^‑ 3 2 9 (1 9 9 9)

ス トレプ ト ゾ トシ ン誘発 糖 尿 病^{ラ ッ トにお}け^る網 膜 電 図変化^と

そ ^の 要因に関 する研 究

金 沢 大学 医 学 部 医 学 科眼 科 学 講 座 (主 任^二河 崎^一 夫 教授)

酒 井 宏 之

3 0 3

スト レ プ ト ゾ ト シ^ン(str ep t^{o z o}to cin,S T Z) 誘 発 糖 尿 病^ラッ ト に おけ^る網 膜 機 能 変 化を 網 膜 電 図 (^{ele ctr o r etin o}gr a m ,

E R G) ^の a波,b波お よ び律 動 様 小 波 を 指 標と し て検 討し た^｡ また糖 尿 病 状 態^の血液^･ 眼 関 門^への影 響を蛍 光 眼底 検 査, 硝 子 体

フ ル オロ フ ォトメト リ^ー お よ び組 織 学 的 検 査 法^{に て}検 討^{し た. さ ら に}本^{モデルラッ ト に}認め ら れ る E R G 変化^{が S T Z の}毒 性^に よ るのか,また は糖 尿 病 状 態に よっ て惹 起さ れ るのかを解 明 す^ることを目 的に, 糖尿 病状 態 を^一 定 期 間維 持し た後に イン スリン を投 与^し,E R G 変 化^に対 する イ^{ン ス}リン の漉 度依 存 的な治 療効 果 を検 討し た. また糖 尿病に おける E R G 変 化^の原 因の究 明 を 目 的と し て, 糖尿 病ラ^ッ ト に おける網 膜血流 速 度 を 走 査^レー ザ ^ー 検 眼 鏡に よ る^{フ ル}オ^レセ イン^ーN_a色 素希 釈 法^で測 定し, さら に酸 素 分 圧^の変 化に よ る網 膜 機 能 変 化 をウ サ ギ摘 出服 杯^のE R G の a波,b波お よ び律 動 棟 小波を指 標と し て検 討し た^. S T Z 投 与 後

の糖 尿 病 状 麿に おけ^{る a}波^{お よ び b} 彼^の振 幅^と頂 点 潜 時^{は S T Z} 投 与⁶週 間^{に わ た}り 変 化^{し な かっ た が},律 動 様 小 波^の振 幅^は ぎI Z 投 与3週 後より 有 意に低下 し,律 動 様 小 波^の頂 点 潜 時と頂 点 間隔は m 投 与2週 後より 有 意に延 長^{し た. S T Z}投 与6週 後に は 血液 ^･ 眼 関 門 機 能^の有 意 な低下 が み ら れ た が, その際^の蛍 光 眼 底 所 見^{お よ び}網 膜組 織 学 的所 見^に明^{ら か}な異 常は み ら れ な か

った^. イン スリンはこれ らの電 気 生 理 学 的な網膜 機 能 異常 を濃 度 依 存 的に回 復 させ た が, 血液^･ 限 関 門 機 能に対し て は明ら か な回 復 効 果 を 示^さず, また その際^の眼 底 所 見お よ び網 膜 組 織 学 的 所 見に異 常を認め な か^った. S T Z は投 与2週 目で網 膜 血 流 量 を 有 意^に低下 さ せ た が, イ^{ン ス}リ^ン5^.0単 位/^kg/ 日 1週 間^の投 与は 血糖 値^の改 善^{と と}もに網 膜^血流 量 を 明^{ら か に}回復 さ^せ, 同 時 に E R G も 回復さ せ た. ウ サ ギ摘 出 限杯に おいて酸 素 分圧 を1 0 0^.0 % か ら 9 9^.5 お よ び9 5^.0 % ^へと低下 さ せ る こ と に よりa披に有 意な変 化は み ら れなか^っ た が,b 波^{で は 9 5.0 % へ の}低下 に より 有 意^な振 幅^の低^{下 と}頂点 潜 時^の延 長^{が み ら れ た.} 律 動 様 小 波^で は 9 9^.5 % ^への低下 に よ^って頂 点潜 時お よ び頂 点 間 隔は有 意に延 長^し,9 5^.0 % ^へ の低下 で は さ ら に頂 点 潜 時^は顕 著に延 長し振 幅 は低下 し た^. こ れ らの変 化^{は 可}逆 的^であ り,1 0 0.0 % 酸 素^に置換 す^{ること に よ}り3 0分以内に は回復し た^. m 誘 発 糖 尿 病ラッ

ト に おける E R G 異 常^は, 血液^･ 眼 関 門 機 能 低下 な ら び に網 膜 組 織 学 的な異常に先 行し て律 動 梯小 波^に特 徴 的^{に み ら れ}, これ ら の穫 能 変 化^{は m の}毒 性に起 因せず,そ^{の 一} 因と し て糖 尿 病 状 葱に由来 する網 膜血流 量^の低下 な^いし低 酸 素状 態が想定さ れ る^.

Eey ^{w o r}d s diabete s_,O S Cillato ry p^ote ntial, ele ctr o r etin og^{r a m} ,in s ulin_,blo od r e也n al ba rri e r

糖 尿 病 網 膜 症 (^{以 下 で は}網 膜症と略 記) は, 我 国お よ び欧 米^の 先 進 国^での主 な 失 明 原 因^であ^る糖 尿 病 合併 症^である^{l 卜=】)}. 近 年

の糖 尿 病 治 療^の進 歩に より 糖 尿 病 患 者^の長 寿が 可能に なり,そ れ に伴^い慢性 合併 症 を 持^{っ た}儒 病 期 間^の長^い糖 尿 病 患 者が年^々 増 加^{の 一} 途を た どり,厚生省に よ る疫 学 調査で は我 国に おけ^る 網 膜 症に より 失 明に至る患 者は年 間3 0 0 0 人 を越 え,成人失 明 原 因^の■_首位を占め ている^{4 )}. 網 膜 症^{は 生}命 予 後^に直接 関^{わ る}合 併 症で は な^いが, 進行 すれ ば患 者^の生活に著し^い支 障を釆たすか ら, その発 症 ^･ 進展^の阻 止^は糖 尿 病^の管 理^上の重 要 課 題^{の 一 つ} である^. 本 症^の管 理^の難し さ^の原 因^{と し て}, 臨床 的に そ^の病 態 が十 分に把 墟さ れ て^いな^{い こ}と, 眼 底 所 見以外に そ^の進 行 程 度 を 把 撞 する検 査 法が乏し^{い こ}と, さ ら に は治 療 薬^の開 発^の遅^れ な ど が挙 げら れ る.

網 膜 症^の成 因^に関^{し て ポ リ オー ル}代 謝 異常 仮 説^{5 )}, レ ドック^ス

変 化 仮 紛^う), グ リ ケ ^ー ション仮説^{7 )},酸 化^{ス トレ ス}仮 説^{8 )}お よ び プ

ロ テ インキ ナ^ー ゼ C(pr otein k in a s e C,P K C) 仮 説

l

りなど^の諸 説

が従 来 提 唱さ れ てきた が, 最 も有 力な説^{の 一 つ}は ポ リ オ^ー ル代 謝 異 常 試である. これ は高血糖に よりポ リ オ ^ー ル代 謝が完 進 し,細 胞 内^{での ソ ルビ トー ル の}蓄 積^{に よって}細 胞 機 能^が障 害^さ れ, さ まぎま な合 併 症が出 現 する との説である^. ポ リ オ^ー ル代 謝^の中^{でグルコ ー スか らソ ルビ ト ー ル への}過 程 を 触媒^{す る}酵 素 がア ルド^{ー ス}還元酵 素である^. 数 種 類^のア^ルド^{ー ス}還元酵 素 阻 害 剤 (^{al do s e r edu cta s einhib it or}, A RI) ^が近 年 開 発さ れ つうあ り^川, そ^の治 療 効 果が期 待さ れ て^いる^. そ れ ら^の薬 効 を 評 価 す る 上 で動 物^モデルでの薬 効^の検 証が不可欠^である が,実 験 動 物

モデルに お け る網 膜 症^に対 す^る薬 効 評 価^の骨 法^は得^{ら れ ていな}

い^. し た がっ て薬 剤 開 発^の面か らも動 物^{モデルに お}ける網 膜 症

の定 量 的 評価 法^の確^{立 は}極^{め て}重 要である.

平 成^{1 0}年¹²月^{2 5 日}受付^, 平 成¹¹ 年3 月2 6日受理

A b br evi ati o n s : A R I, aldo s e r edu cta s e inh ibito r; D A G,dia cyl_gl_yc e r ol_; D C C T,diabete s c o ntr ol an d c o m plic atio n s tri al_;E O G, ele ctr o^‑O C ulog^{r am} ;E R G, ele ctr o r etin og^{r am} ; G A B A, γ^{‑ am} in o bu研^{ic a cid}; α^‑GI, α^‑glu c o sida s einhibito r; I D D M ,in s ulin^‑d ep^{e n}de nt diabete s m ellitu s; M C T, m e an Cir c ulatio n tim e; N I D D M ,n O n^‑in s ulin^‑dep^{e n}de nt diab ete s

30 4^｣

Yo n e m u r a ら^川 は網 膜 電 図 (ele ctr o r etin ogr a m ,E R G) が糖 尿 病 患 者^{に おい て}早 期か ら異 常 を畢^{す ろこiとを 発}見^{し, こ の所 見}

が網 膜 症^の早 期 診 断の有 力な指 標である こ と を明ら か に し た^. 以 来^{こ の}知 見は多 く^の追 試 確 認 を 経^て,広 く 臨 床に活 用 され て いる1 2 卜 1 4 )

. し か し糖 尿 病に おけ^る律 動 様 小 波 所 見と そ^の他^の眼 検 査 所 見や糖 尿 病 治療 効 果との関 連について は ほ と ん ど検 討 さ れ ていない. そ^{こ で}本 研 究^{で は グルコサ ミン のN‑メチルニ トロ}

ソ誘 導 体であるスト レ プ ト ゾ ト シン(str ep t^{o z o}to cin, 耶) 誘 発 糖 尿 病^{ラッ ト に おい て}律 動 横 小 波 所 見^に併^{せ て}網 膜^血流 動 態 を 調^べ,さら にこれ らの所 見が イン スリ^ン治療に よっ て改 善 す^る か検 討^{し た,}

対 象お よび方 法

Ⅰ^. 実 験動 物

実 験 動物に は,日本^{エ スエ ル}シ^ー ( 静 岡) ^より入荷し,予め 1週 間 検 疫 飼育^{し た}体 重^{1 8 0 ､} 2 5 0 g^の雄性 ^{Br o w n‑No n v}叩系 有 色^ラ

ッ トを 主に使 用し た^. ラッ ト は温 度2 3 ±1 ℃, 湿 度5 5 ±1 0 % ,

設 定 換 気 回数^{1 5}回/ 時 間,明 暗^{サ イ クル1 2}時 間 (午 前⁷ 時 点 灯,

午 後7時 消 灯) ^の条件を 備 え^た飼 育 室 内で ラット ブ ラ ケ^ッ ト ケ

ー ジ(^{2 3×4 3×2 0c m} ,日本ク^レア,東 京) ^に3匹ずつ収 容し て飼

育し た^. 飼 育に際し て は固 形飼 料C E^‑2 (日本ク^レア) お よ び水 道 水 を 自 動 給 水 装 置P C P^‑P D (^{ラボエ ンジニ アリング}社,

･静 岡)

に より 自 由^に摂 取 さ^{せ た. な お}不 実験^{で は}実験 開始 前^の眼底 検 査に て網 膜に異 常が認め ら れ た ラッ ト,お よ び E R G検 査に て左 右 差^が明^{ら か}なラッ ト 匝 波 振 幅^{に て 2 0 %} 以上) ^を用^いなかっ

た^. また糖 尿 病 誘 発ラッ ト に お^い て は m に よ る糖 尿 病 誘 発¹ 週 後^{に おいて}血 糖 値^{が 3 0 0m}g/^{dl 以 下のラッ ト を}用^いな か^っ た.

酸 素 分 圧^の影 響に関 す^る実 験で は_,北 山^{ラペ ス} ( 長 野) ^より入 荷し,予め 1週 間 検 疫 飼 育し た体 重2^.5 ^〜3^.5 k_{g の}白 色ウ サ ギを 用^{いた. ウ サ ギ は}温 度^{2 3 ± 1}℃,湿 度5 5 ± 1 0 % , 設 定 換 気 回 数 1 5 回/ 時 間, 明 暗サ イ クル 1 2時 間 ( 午 前7 時点 灯, 午 後7時 消 灯)

の条 件 を 備 え^た飼 育 室 内^で半 間定 式^{ウ サ}ギ用ケ^ー ジ(^{4 9 ×5 9 ×} 3 6 c m ,日本クレ ア) に 1 匹ず^つ収 容し て飼 育し た^. 飼 育に際し て は固形 飼料^{R C‑4}(^{オ リエ ンタル}酵 母,東 京) ^{お よ び}水 道 水 を自 動給 水装 置P C P^‑P D (ラ ボ^{エ ン}ジニアリ^ング社) ^{に よ}り 自 由^に摂 取さ せ た.

Ⅰ. ス トレプトゾト シ ン に よ る糖 尿 病 誘 発 方 法

S T Z (Si_gm a,St. Leuis,U S A) を 投 与 直 前に 0^.1 M ク^{エ ン}酸/¹) ン酸 緩衝 液q郷 ^4.6) ^に溶 解^し,1 2時 間 絶 食^{し た ラッ トの}腹 腔 内

へ2 7 ゲ ^ー ジの注 射 針^{に て}投 与 量^{が 6 0m} g/kg に な る ように単 回 投 与^{し た.} なお,S T Z は溶 液 中で は不 安 定である との報 告があ

る^{1 5 )の}で, 秤量 後に は溶 解^せず 粉 末^のまま水 冷下 で保 存^し, 投 与

直 前に溶 解し実 験に供し た. また m の投 与に際し て は通 常 用

いら れ る尾 静 脈 内 注 射^{で は}急 激^{な 血}糖 値^の上昇^{のた め か}, 急 性 期に死 亡例が み ら れ ること があるので, 本研 究で は腹 腔 内 投 与 方法^を用^いた. 本 研 究^{で は S T Z} 投 与彼^{の死 亡 例は皆 無であっ}

た^.

肌 ラッ ト の体 重お よび血糖 値 測 定 方 法

体 重 を, m 投 与 前^{お よ び}投 与後1週 間間 隔^で体 重 計^{L C‑4 2 0 1} (^ザルトリ ウ^ス, 東京) ^{に よっ て}測 定し た^. また 血糖 値^の測 定は 心 腹 内^より 無 麻酔下^{で 2 7 ゲ ー ジ}針 を 用^いて採 取^{し た}動 脈^{血 を}

遠心 分 離機^{C F 7 D} (^{日 立},東 京) ^{に て}遠 心 分 離 (^{1 0 0 0} × g^,5分 間) して; 得ら れ た 血清 を 用^いて,G lu c o s e N鱒^{Te st, Kit @ (ベ ー 1) ン}

ガ ^ー マ ンハイ^ム山 之 内,東 京) ^{に よって}行^{っ た.} 測 定 値 を^盲± S E M で示し た^. 群 間^の平 均 値^の有 意 差 検 定に は対 応^のな^い標

本の t検 定 を 行^い,危 険 率5 % 以 下を 有 意 差 あ りと判 定し た.

Ⅳ^, ラッ ト の眼底 検 査方 法お よび 蛍光 眼底 検 査 方 法 生 理食 塩 水に て 1^.0 % に調 製 し た塩 酸^{フ ユ ニ レ フ} リ^ン (Sig^{m a})^{お よ び}硫 酸^{アトロ ピン}(^{ミニム ス ⑧,} 千寿 製薬,大 阪)^の点 眼に よ^軒)極 大に散 瞳さ せ た^. 塩 酸^{ケ タ ミン}(ケ タ ラ ^{ー ル ⑳}5 0,

三共,東 京) ^{3 2.Om}g/^kgお よ び塩 酸^{キ シ ラ ジン}(^{セ ラ ク タ ー ル ㊥},

日本^バイ^エル_, 東 京)2 0m g/kg の腹 腔 内 投 与に より 不 動 化し た 後,暗 室^{に て}双 眼 倒 像 鏡 (^{オー ト ビュ ー ピル}倒 像 鏡,甲 南キ ^ー ラ

ー

,大 阪) ^{に よっ て}眼 底検 査を行^った^{. つ い}で^{フ ル}オ^レセ イン ^ー Na溶 液 (^{フ ルオ レ サ イ ト⑧}注 射 液1号, 日本^{ア ル コ ン},東 京) 2 0mg/kg を尾 静 脈 内に注入 し て蛍光 眼底 検 査 を 行^{っ た. フ ル}オ レセ イ^ンー^{Na溶 液は体 重1 k}g あたり2 0m g になる ように生理食 塩 水^を用^いて希 釈^し, 全 量^{1 0 0}/^Jl を投 与^{し た.} 投 与^{1 5 〜2 0}秒 後^の蛍 光 眼 底 像を黄色 干 渉^{フ ィ ル}タ ^ー W^･1 5 G (^コ ダック, 東 京) を 介^{し て}眼 底^{カメラ R C‑2}(^{コ ー ワ},東 京) ^{に よっ て}連続 的に写 真 撮 影し た^. 眼 底 検 査 を^{S T Z}投 与 前お よ び投 与 後】週 間 間 隔で行

い

, 蛍光 眼底 検 査を S T Z投 与 前お よ び投 与3週 また は 6週 間後 に行^{っ た.}

Ⅴ^. ラッ ト の E R G 検 査 方 法

生 理 食 塩 水^{に て 1.0 % に}調 製 ^{し た}塩 酸 ^{フ ユ ニ レ フリン} (Si_gm a)お よ び硫 酸^アト^ロ ピン(ミ^ニム ス ⑧_, 千 寿 製 薬)^の点 眼に より 極 大^に散 瞳^{さ せ た. 2} 時 間^の暗 順 応 を 施し た ラッ トを 塩 酸 ケ タ ミ^ン(ケ タ ラ ^{ー ル ㊥}5 0,三共) ^{3 2.Om}g/kgお よ び塩 酸キ シ ラ ジ^ン(^{セ ラ タ タ ー ル ㊥}, 日本^バイ^エル)^{2 0m}g/k_{g の}腹 腔 内 投 与に よ り不 動 化し,1 0^{ル ッ}クス の赤 色 光下 で 0^.4 % 塩 酸^{オ キ シ プロ} カ イ^ン(ベ ノキ シ^{ー ル ㊤}, 参天製 薬,大 阪) を点 眼後,E R G 用 電 極 を 装 着^{し た. E R G} 用 関 電 極^{に は},体 重^{2 0 0},2 5 0 お よ び 3 0 0g のラ

ッ トを 用^{い て}歯 科 用石膏 (ジ ^ー シ^ー シ ^{ュ ー} フ レッ ク^{ス ⑧}, G C De ntal Indu strial, 東 京) ^{に て}角 膜面^の鋳 型に合わ せ て作 製し た3 種 類^の川畑 式 白 金^{コ ン}タ ク ト レンズ型 閤 電 極 ( 直 径^{3.5,4.0 お よ} び 4.5皿 m, 京 都コ ンタ ク ト^{レ ン}ズ_,京 都) ^を用いた^. 測定に先立 ち 関電 極 を 予^め各^{ラッ トの}角 膜^に装 着^し,装 着 良 好^{なコ ンタ ク} ト レ^ンズ電 極を 上記3種 類^のう ちか ら選 択し た^. 不 関電 極と し て は脳 波用 針 電 極 ^{N E‑2 3 3 S} (^日本 光 電,東 京) ^を鼻 腔 皮^{下 に}, 接 地 電 極と し て は同 種^の針 電 極を尾の先 端^の皮下 に刺人留 置^し た. 光 刺 激^{のた めのキ セノ ン}放 電 管 を 被 検 眼^の角 膜 前 方1 0c m の位 置に設 置し, 仝 視 野 刺 激 効 果を得る 目的^で閃 電 榛^の前 面^に ピンポ^ン球 を 半 割し た拡 散 板を置^いた^. 2 0 ジュ

ー ル の単 発白 色 放 電 閃 光 を 用^{いて a}披お よ び b 披^を両 眼 同 時^に記 録^{し た}後, さ

ら に 5 分 間^の暗 順 応 後に,再 度2 0 ジュ

ー ル の単 発 白 色 放 電 閃 光 に より 律動 様 小 波 (^{o s cillato r}y pote nti al, O P) を 両 眼 同 時^に記 録 し た^. 光 刺 激に より 惹 起^{さ れ た}両 眼^の E R G ^のa 披お よ び b 披^に

ついて は時 定 数0.3秒,O P につ いて は 3 ミ リ秒で交 流 増 幅 器36 6 型ポ リ グ ラ^フ(日本 電 気三乳 東 京) ^{に よ}り 増 幅^{し た}後, シ グ ナ ルプロセッサ ^ー 7 T O 7 A (^日本電 気三栄) 上 に表 示さ れ た波 形^を

Ⅹて^{レコ ー} ダ 8 U 1 6 (日本 電 気^三栄) ^{に よ}り 描 画 す^{る と と}もに,表 示 され た E R G波 形 をE R G 解 析プ^ログ ラム( 参天製 薬) を 用^いて

m e1^{1itu s}; O P_, O S Cillato ry p ^{ote n}ti^al_; P K C _pr otein k in a s e C_; S B F, S eg ^{m e n}tal b l^{o o}d flo w; S L O, S C a n ning la s e r Oph也由m o s c op^e;S T Z,,^{Str ePtO Z OtO Cin}