博 士 （ 理 学 ） 前 田 博 昭
学 位 論 文 題 名
担 癌 モ デ ル マ ウ ス に お け る TGF‑ ロ の 免 疫 抑制 機 序に 関す る 研究 学 位 論 文 内 容 の 要 旨
悪性 腫瘍 患者 において腫瘍の進展にと もない免疫機能が低下する 傾向が多くみられる。担癌宿 主 に免 疫抑 制状 態を誘導する液性因子の 探索、および腫瘍宿主の免 疫抑制状態からの解除に関し て 既に 多く の研 究報 告 があ り、 抗腫 瘍 免疫増強の1つのターゲット となっている。この免疫抑制 状 態を 誘導 する 、いわゆる免疫抑制因子 として、腫瘍あるいは宿主 の産生するタンバク性因子が これまでに数多 く同定された。これらの中 で、近年多種の腫瘍より産生されることが明らかとなっ たTransforminggrowth factor．p(TGF．p）が注目されている。本研究では、マウス胸腺細胞腫EL4担 癌 モデ ルマ ウス にお け る腹 水中TGF‑pの 同定、さらに同担癌マウス におけるマクロファージ機能 抑 制、 およ びT細胞 サプ セッ ト 変化 に対 するTGF．pの影響の解析を 目的とする。本論文の要旨は 以下の4点であ る。
1．マウス胸腺細胞腫Eし4担癌モデルマウスの腹 水中にマウスリンバ球、ミンク肺上皮細胞株、
MvlLuの 増殖 を抑 制す る 因子 が存 在す る こと 、さ らにこの増殖抑 制活性が抗TGF‑p抗体添加に よ り阻害さ れることを見出した。また、 抗TGF pi抗体を用いたELISA法、およびウェスタンプロ ッ テイング法とぃった生 化学的手法によりEL4担癌マ ウス腹水中にTGF．piが検出されることを示し、
本因子がTGF゜piである ことを明らかにした。
2．EL4担癌 マ ウス の腹 腔内 マク ロ ファ ージ にお い て、 腫瘍 移植 後経日的な抗腫瘍 エフェクター 因 子で あるTNF．a、お よび 一酸 化 窒素(nitricoxide、NO)産 生 能の低下、およびEL4細胞に対す るin vitro抗腫瘍活性の低下が認めら れた。抗TGF‑[3抗体腹腔内 投与によりEL4担癌マウス腹水中 のTGF．pが 検 出限 界以 下に 中和 さ れる こと を確 認 後、 同抗 体投 与マウスマクロフ ァージのNO、 TNF．a産 生能、および抗腫瘍活陸を検討した。その結果、抗TGF．p抗体投与マウス由来マク口ファー ジ のNO．TNF‑a産生 が 、抗 体非 投与 マウ ス由来マクロフ ァージに比べ著明に増加し 、非担癌マウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ と 同 程 度 ま で 回 復 し た 。 ま た 、 抗 腫 瘍 活 性 の 増 強 も 認 め ら れ た 。
3. EL4担 癌マウス腹水中にTGF．D以外 に腫瘍進展にともなってinterleukin・10 (11．10)が増加 し てお り、 腹腔 内 マク ロフ ァー ジ のIL‑10産生能が正常マ ウスに比べて亢進している ことを見出 し た。RT．PCR法に よりIL・10 mRNAレ ベルを解析したと ころ、EL4腫瘍細胞にはIL‑10 mRNAは検 出 され ず、 宿主 マクロファー ジに腫瘍移植後経日的な【L・10 mRNAレベルの増加が認 められた。
さ らにin vitroに おい てEL4担 癌マ ウス マクロファージは 無刺激でIL‑10を産生し、LPS刺激によ りIL・10産 生は 促 進さ れ、IL‑10産 生能 亢進が認められた 。EL4担癌マウスに抗TGF・ 蹴体を投与 ―80―
したと ころ、腹腔内マクロファージ のin vitro IL‑10産生能、および【L．10 mRNAレペルは正常マ ウスレ ベルまで低下し、腹水中のIL‑10量も低下した。以上の結果から、EL4移植マウスマクロファー ジ は腫 瘍 由来TGF．pによりNO、TNF‑a産生能が低下し、逆に【L．10産生能は亢進しており、宿 主 の免疫 抑制状態の進展への関与が示 唆された。
4. EL4担癌 マ ウスT細胞 に 対す るTGF・p、 およ び【L‑10の関 与 を解明すべく 、抗TGF．晰体、
およ ぴ抗 【L 10抗体の 投与を試みた。抗体投与に先 立ってEL4担癌マウスT細胞 の抗CD3抗体刺激 によ る増 殖反 応 とサ イト カイ ン産 生 パタ ーン を解 析し た 。こ の結 果、EL4担癌 マウスT細胞は抗 CD3抗 体 刺激 に対 する 増殖 反 応が 著し く低 下 して おり 、IL．2レセ プター発現低 下をともなった IL．4依 存性 の増 殖能を 示した。またサイトカイン産 生バターンは、Thl型サイト カイン(IL．2、 IFN い産生が著しく抑制 されており、一方Th2型サイ トカイン(IL．4、IL．6、IL．10)の産生が促 進さ れて いた 。 抗TGF・隴 体 投与 マウ スのT細胞は増 殖抑制が解除されており、IL．2レセプター 発現 も正 常に 誘 導されIL．2依存性を回復していた。 さらにサイトカイン産生バ ターンはThl型サ イトカイン産生の亢進と、Th2型サイトカイン産生低下 が認められた。また、抗IL・10抗体投与マ ウス にお いて は 、T細胞 増殖能低下の部分的解除と、Th2型サイトカイン産生低下 が認められた。
しかし、抗IL．10抗体投与 の効果は抗TGF．p抗体投与 に比ベ弱く、このことはT細 胞サブセットの 変化にはTGF．Bの寄与の方 が大きいことを示唆した。
以上、腫瘍由 来TGF・pによる宿主免疫抑 制状態増悪の1つのメカニズ ムが明らかにされたとと もに、担癌宿主の免疫 抑制状態の改善におけるTGF．pの作用阻害、いわゆるTGF．pアンタゴニス トの有用性が示された 。
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学位論文審査の要旨 主査 教授 東 市郎
副査 教授 谷口和彌 副査 教授 菊池九二三 副査 講師 劉 永春 学位論文題名
担癌モデルマウスにおける TGF‑ ロの免疫抑制機序に関する研究
担 癌 宿 主 に は 一 般 的 に 免 疫 機 能 の 低 下 が み と め ら れ 、 そ の 原 因 と して 腫 瘍 細 胞よ り 産 生 さ れ る 免 疫 抑 制因 子 の 関 与が 考 え ら れて い る 。 担癌 宿 主 に おけ る 免 疫 抑制 状 態 を 誘導 す る 液 性因 子の探 索、お よび腫 瘍宿主 の免疫抑 制状態 からの 解除に 関して 既に多 くの研 究報告 が あ り 、 抗腫 瘍 免 疫 増強 の1つ の ター ゲットと なって いる。 この免 疫抑制 状態を 誘導す る、免 疫 抑 制 因子 として 、腫瘍 あるい は宿主 の産生す るタン パク性 因子が これま でに数 多く同 定され た 中で、近年多種の腫瘍より産生されることが明らかとなったTransforming growth factor‑p (TGF‑p) が 注 目さ れてい る。本 研究で は、マ ウス胸腺 細胞腫ELA担癌 モデルマ ウスに おける 腹水中TGF‑p の 同 定、 さらに 同担癌 マウス におけ るマクロ ファー ジ機能 抑制、 およびTネm胞サ ブセッ ト変化 に 対 す るTGF‑pの 影 響 を 解 析 し た 。 本 論 文 の 重 要 な 結 果 は 以 下 の4点 で あ る 。 1． マ ウ ス 胸 腺 細 胞腫EL4担 癌 マウ ス の 腹 水中 に マ ウ スリ ン バ 球 、ミ ン ク 肺 上皮 細 胞 株 、 MvILuの増殖 を抑制 する因子 が存在 するこ と、さ らにこ の増殖 抑制活 性が抗TGF‑p抗体添 加によ り 阻害され ること を見出 した。 また、 抗TGF‑[31抗 体を用いたELISA法、およびウェスタンブロツ テイング法により、本因子がTGF‑piであることを明らかにした。
2． EL4担癌マ ウスの 腹腔内 マクロファージにおいて、腫瘍移植後経日的な抗腫瘍エフェクター 因 子である 一酸化 窒素(NO）、およ びTumor necrosis factor‑a (TNF‑a）産生能の低下、および EL4細 胞に対 するin vitro抗腫瘍 活性の 低下が 認めら れた。 そこで 抗TGF‑p抗体 の腹腔 内投与 に よ る マ クロ フ ァ ー ジのNO、TNF‑a産 生 能、 お よ び 抗腫 瘍 活性の 変化を 検討し た結果 、抗TGF‑p 抗 体投与マ ウス由 来マク ロファ ージのNO，TNF‑cx産 生が、非担癌マウスヤクロファージと同程度 ま で 回復 し、抗 腫瘍活 性の増 強も認 められ、EL4担癌 マウス マクロフ ァージ はTGF‑pに より機 能 低下が誘導されているものと思われた。
3. EIA担癌マウ ス腹水 中に腫 瘍進展 に伴っ てTGF‑p以外 にinterleukin‑10 (11‑10)が増加して お り、腹腔 内マク ロファ ージの 加vitr0 11‑10産 生能亢 進、お よびIL‑10 mRNA発現増強が認めら れた。そこで、EL4担癌マウスに抗TGF‑ptjL体を投与した結果、腹腔内マクロフアージのin vitr．。
IL‐10産生能 、およ びIL‐lomRNAレベル は正常マ ウスレ ベルま で低下 し、腹 水中のILI10量も低 下 した。以 上の結 果から 、EL4担癌マウスマクロファージは、腫瘍由来TGF‐DによりIL‐10産生能 が亢進しており、宿主の免疫抑制状態の進展への関与が示唆された。
4．EL4担癌 マ ウ ス 脾臓T細胞 の 抗CD3抗体 刺 激 に よる 増 殖反応と サイト カイン 産生バ ターン を解析した結果、IL‐2依存性増殖反応の著明な低下が認められ、またThl型サイトカイン（IL．2、 IFN・Y）産生能の低下、さらにTh2型サイトカイン（IL4、IL．6、IL‐10）の産生促進が認められた。
そ こでEL4担 癌マウ スT細胞 に対す るTGF．p、 およびIL．10の関与を解明すべく、抗TGF‐p抗体、
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および抗IL‑10抗体投与によるT細胞反応性の変化を解析した。その結果、抗TGF‑13抗体投与マウ スT細胞にIL−2依存性増殖能の回復、さらにThl型サイトカイン産生亢進と、Th2型サイトカイン 産生低下が認められた。また、抗IL‑IO抗体投与マウスにおいては、T細胞増殖能低下の部分的 解除と、Th2型サイトカイン産生低下が認められた。以上の結果からEL4担癌マウスにおけるTh2 型反応の亢進はTGFーBとそれにより誘導されるIL‑10によるものであることが示唆された。また、
抗rCF‑p抗体、および抗IL‑10抗体併用投与によりELA担癌マウスに明らかな延命効果が認められ、
免 疫 抑 制 状 態 の 改 善 が 直 接 担 癌 宿 主 の 延 命 に っ な が る こ と が 示 さ れ た 。
以上、申請者は腫瘍由来TGF‑pによるマクロファージ機能異常を伴った宿主免疫抑制状態増悪 の1つのメカニズムが明らかにするとともに、担癌宿主の免疫抑制状態の改善におけるTGF‑pの 作用阻害、いわゆるTGF‑pアンタゴニストの有用性が示された。これらの成果は担癌宿主の免疫 病態の機構解明に大きく奇与するものと高く評価される、審査員一同は申請者が博士（理学）
の学位を受けるに充分な資格を有するものと認めた。
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