博 士 （ 理 学 ） 川 本 ・ 思 心
学位論文 題名
Studies on the mechanism of head and tail regeneration in ETzchytraeus japone7zsis (Annelida ， Oligochaeta)
（ヤマトヒメミミズの頭尾再生機構に関する研究）
学位論文内容の要旨
L 両頭再生現象の解析
動物の再生は盛んに研究されている現象であるが、まだ解明されていないことも多い。
申請者は、環形動物貧毛綱に属するヤマトヒメミミズを用いて再生研究を行った。貧毛類 は全身再生をすることで有名な刺胞動物や扁形動物に比べると、より分化程度が高く体節 などの体制を備えているにもかかわらず、全身再生能を持つ種を含む興味深い動物群であ る。ヤマトヒメミミズは、自切によってできた断片から全身を再生するだけではなく、断 片の後方にも頭部を再生することがある。申請者はこの「両頭再生」現象に注目し、動物 の 再生にお ける頭 尾決定機 構を、組 織学及び実験形態学的手法を用いて解析した。
まず初めに、両頭再生が起こる条件について検討した。断片の切断法、麻酔の有無およ び断片化後の飼育法を組み合わせて比較実験した結果、人為切断が両頭再生に必須な前提 条 件 で あ り 、 切 断 前 の 麻 酔 が 両 頭 再 生 の 出 現 頻度 を 上 げる こ と がわ か っ た 。 次に、個体の様々な部分で人為的に切断して断片をっくり、両頭再生率を比較した。7 体節からなる頭部域で切断した場合は5割以上の高頻度で両頭再生が見られた。一方、胴 部からの断片では、部域による有意差はなく、平均して2割程が両頭再生した。頭部と胴 部で再生結果に違いが生じたため、両者の組織構築の違いを調べた結果、胴部の体節には 体節毎に1ケ所の自切部位が存在するが、頭部の第6体節までには自切部位はないことが 明らかになった。
次に、人為切断直後の傷口が体節内のどこにあり、それが両頭再生と関係しているのか どうかを検討するため、胴部断片の後端の神経筋肉構築を詳細に観察した。人為切断直後 には自切部位以外の場所で切れている断片がほとんどだったが、切断8時間後にはこのよ うな断片は減少していた。これは、自切部位以外で切られた体節はその後、傷口から近い 自切部位で自切が起こり、改めて切り離されたことを示していると考えた。一方、人為切 断前に麻酔をかけた場合は、8時間後になっても、切断直後と同じ部位で切れている断片
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がほとんどだった。さら に、自切部位以外の場所に 切断面をもつ断片の割合と、その後に 両頭再生が起こる割合は 似た傾向を示した。
最後に、両頭個体の後 方に形成された頭部の直前 部分、すなわち元断片の最後部体節を 詳細に観察したところ、 ほとんどの両頭個体は完全 な一体節の構造を持っていないことが わかった。この元の体節 がどこで切断されているか によって、後方頭部がどの位置から再 生したのかを推測すると 、正常な自切部位以外の任 意の場所から、後方に頭部が形成され ていることが分かった。
以上の結果から、人為 切断によって自切部位以外 で切断され、その場所から再生が起こ ると、断片の後端から頭 部が形成されることが明ら かになった。
一方、断片前端の傷口 については、それがどのよ うな場所で切断された場合でも頭部し か再生せず、尾部は決して再生しなかった。また、両頭個体を中央から切断して得られた、
後方に頭を持つ断片でも 前端に尾部を再生すること はなかった。
こぉことから、ヤマ卜 ヒメミミズにおいては、す べての切断面にはデフオル卜で頭部を 再生する性質があり、特 殊なケースにおいてのみ尾 部を再生するしくみがあることが推測 される。
II 組 織学 的観 察に よ る、 正常 頭尾 再生 表 の作 成
ヤ マ トヒメ ミミズはその高い再生能カ と飼育が容易であることなど から、再生研究を実 験す る 動物と して極めて優秀であるが、 本種を実験モデル動物として 確立するためには、
基礎 的 情報の 蓄積、および共有が重要で ある。今後その発展が期待さ れる分子生物学的な 研究 を 行う場 合にも基準となる、正常再 生における組織形態を詳細に 観察し、ステージ表 を作 成 した 。
は じ めに、 正常再生の実験にはどのよ うな断片を用いるのが適当か ということを検討す るた め 、直径 と体長の異なる個体を用い て、直径と長さの異なる断片 を繃lJ激で作製し、
再生 結 果を比 較した。その結果、再生実 験には太った個体を電気刺激 して得られた、長さ が4体節 以上 の 断片 を除 くと 、頭 部7体節 の 完全 な再 生が 起こりにく いことが明らかにな った 。
次 に 、 電 気 刺 激 に よ っ て得 ら れた 適切 な長 さお よ び太 さを 持つ 断片 を24℃ で飼 育し 、 SEMを用 いて 体 表構 造を 、螢 光ラ ベルさ れたアンタゴニストを用いて 筋肉及乙榊経筋接合 部を 、HE染 色パ ラフ イ ン切 片を 用い て細 胞 ・器 官構 造を 、BrdU抗体 染色を用いて分裂細 胞の 時 間・ 位置 的分 布 パタ ーン を、脂溶 性色素Dilを用いて感覚細胞 から脳への投射を観 察 し 、 頭 尾 再 生 芽 の 特 徴 か ら ス テ ー ジ ン グ を 行 っ た 。 以 下 に そ れ を 記 す 。 Stage0：再 生0‑12時間 。自 切と 創傷 治 癒。 自切 と傷 口の閉鎖は 、主に自切部位の環 状筋 の 収縮 によ って 起 こる 。小 さく開い た傷口はplugによって閉じ られ、約6時間後には
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体壁に付着している 間充織性細胞で細胞分裂が観察されはじめる。その後、Plugは消失し、
前端では表皮 と表皮、腸と腸が接着し、 傷口が完全に閉じる。一方、 後端では表皮と腸が 接着し、肛門が開く 。
Stagel：再 生12124時間。再生芽の 形成。前後の切断面の表皮の 細胞および暘の前後 端の細胞が分 裂を開始する。間充織性細 胞の分裂はさらに盛んになる 。また、各体節の新 成細胞も分裂 を開始する。表皮細胞の分 裂とともに、傷口の中心部か ら古いクチクラを破 るようにして 再生芽が形成されはじめる 。ステージ後期には再生芽の 長さと幅がほぼ等し くなる。
Stage2：再 生48時間 前 後。 再生 芽の 伸長 。 細胞分裂はさらに盛 んになり、頭部再生 芽は背側にや やそった形に伸長する。頭 では、腹側の表皮が陥入し、 腸と連絡し始め、腹 側神経索が著 しく伸張し、脳原基と血管 も形成され始める。尾部再生 芽では肛門のすぐ前 方に尾節が形成され る。
Stage3：再 生72時間 前後。再生芽の 分飾開娩頭部再生芽に体lが 形成さ加メ始める。
頭部再生芽で は体節間の溝と隔膜が形成 され、体節構造が明瞭になり 始める。頭部の体節 間溝 は 一度 に分 節し 、口 前 葉と7つ の頭 部体 節と 第8体節 の第1体 環に なる 。クチクラ層 や体壁筋肉が ほば完成し、口前葉と尾節 の感覚細胞が分化し始める。 尾部再生芽は成長帯 が形成されて再生が 完了し、新しい体節の付加 が始まる。
Stage4： 再生96時間前後。頭部再生 芽の分節完成。頭部再生芽の 体節聞溝が完成し、
体環間溝と剛 毛、隔膜腺が形成され始め る。分裂細胞がやや減少する が、腸と口前葉では 活発。口前薬 の感覚細胞から脳への投射 が完成する。この時期には、 再生個体は盛んに移 動をし始める。
Stage5：再生120時間前後。再生完了。各頭 部体節が伸長するとともに太さも増して、
元断片部と同 じ太さになる。神経筋接合 部や隔膜腺の形成が完了し、 頭部再生芽の再生が 完了する。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
学位論文題名
Studies on the mechanism of head and tail regeneration in ETzchytraeus jap07zensis (Annelida ，Oligochaeta)
（ヤマトヒメミミズの頭尾再生機構に関する研究）
近 年 、 再 生 医療 へ の 応 用 を視 野 に 入 れ た、 マ ウス ・ラッ トなど のモデ ル幼 物を使 った再 生研 究 が盛ん になっ てきて いる が、ヒ トを含 む哺乳 類の再 生能 は極め て限ら れたも ので ある。 一方、
無 脊椎 動 物 に は から だ の 断 片 から 全 身 を 再 生 する能 カを 持った 動物も 多い。 そう した無 脊椎動 物 の再 生 機 構 を 解析 す る こ と で、 進 化 で っ な がった 動物 におけ る再生 機構の 多様 陸と共 通性を 明らか にす ることができると期待される。しかし、古くから行われているヒドラやプラナリアなどの 無 脊椎 動 物 を 用 いた 再 生 研 究 から 提 出 さ れ た 数々の モデ ルのほ とんど は、実 験的 に検証 される ことな く、 今日に 至って いる。
無 脊椎動 物の研 究が このよ うな現 況にあ る中 、著者 は環形 動物貧 毛類の ヤマ 卜ヒメ ミミズ を用 い て頭尾 再生の 決定機 構を 実験生 物学的 に研究 した。 ヤマ トヒメ ミミズ を含む 貧毛 類は、 中枢神 経 系、 体 節 、 体 腔な ど 無 脊 椎 動物 の 中 で は 高 度に発 達し た体制 をもっ にも関 わら ず、全 身再生 能 をもつ 穏が多 数含ま れる という 、極め て興味 深い劫 物群 である 。また 、無脊 椎動 物の中 では分 子生物 学的 研究が もっと も発展 してい るシ ョウジ ョウバ ェなどのエクダイソゾアに対し、本種は異 なる体 制を もつロ フォト コロコ ゾアに 槭し ており 、無脊 椎動物における発生・再生現象の幅広い理 解に貢 献で きるこ とも期 待され た。
第1章 で は、 ヤ マ ト ヒ メ ミミ ズ の 再 生 にお け る 頭 尾 決定 の 組 織 学 的原 因を 探るべ く研究 を行 っ た 。 本 種 で は 、 稀 に 後 方 に も 頭 部 が 再 生 す る 両 頭 再生 現 象 が 知 ら れて お り 、 著 者は こ の 両 頭 再 生 現 象 に 注 目 し て 、 異 所 的 な 構 造 が 形 成 さ れ る異 常 な 頭 部 形 成過 程 か ら 正 常な 頭 尾 形 成 過 程 の 解 析 を 試 み た 。 は じ め に 、 動 物 の 切 断 方 法や 飼 育 条 件 な どの 条 件 を 検 討し た 結 果 、 人 為 的 な 切 断 が 両 頭 再 生 を 引 き 起 こ す 必 要 条 件 であ り 、 切 断 前 の麻 酔 処 理 が その 頻 度 を 上 げ る 効 果 が あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 体の 様 々 な 領 域 でナ イ フ に よ って 人 為 切 断 し た 場 合 、7体 節 か ら な る 頭 部 領 域 で 極 め て 高 い 両 頭 再 生 率 が 見 ら れ た が 、 それ 以 外 の 胴 部 領 域 で は ど の 部 位 で 切 断 し て も ほ ば2割 程 度 の 両 頭 再 生 が 見 ら れ 、 部 位 に よる 有 意 差も見 られ なかっ た。
次 に 、 頭 部 体 節 と 胴 部 体 節 を 詳 細 に 観 察 し た と こ ろ 、 す べ て の 胴 部 体 節 に は そ れ ぞ れ
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新 介
雄 兼
己 隆
駿 晴
正 正
内 渡
倉 下
原 水
栃 馬
片 山
若 清
授
授 授
授
授 授
教
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助
教 教
教
助 助
査
査 査
査
査 査
主
副 副
副
副 副
10所 の 自 切 部 位 が あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 人 為 切 断 後 の 傷 口 （ 後 方 切 断 面 ） を 詳 細 に 検 討 し た 結 果 、 人 為 切 断 直 後 は ほ と ん ど の 例 で 自 切 部 位 以 外に 切 断 面 が あっ た が 、 時 間 を 経 る に っ れ て 後 方 切 断 面 が 自 切 部 位 に な っ て い る 個 体 が 増 えた 。 こ れ は 、切 断 後 に 自 切 す る こ と に よ っ て 人 為 切 断 に よ る 異 常 な 切 断 面 を も つ 部 分 を 切り 捨 て て い るこ と を 意 味 し て い る 。 ま た 、 自 切 部 位 以 外 で 切 れ て い る 断 片 の 割 合 と 断 片 の両 頭 再 生 の 割合 が っ ね に 同 じ 比 率 を 示 す 傾 向 が あ る こ と と 、 後 方 に 形 成 さ れ た 頭 部 が 自 切部 位 で は な ぃと こ ろ か ら 付 加再 生さ れてい ること も示し た。
本 研 究 を ふ ま え て 、 著 者 は ヤ マ ト ヒ メ ミ ミ ズ に お い て は 、 体 節 内 の 切断 位 置 に よ っ て、
そ こ か ら 再 生 さ れ る 構造 が 頭 に な るか 尾 に な る かが 決 定 さ れ る とい う 作 業 仮 説を 提 出 し た 。 こ の 仮 説 で は 、 尾 部 は 自 切 部 位 で 切 断 さ れ た 場 合 に の み 後 方 ヘ向 け て 再 生 する の に 対 し 、 そ れ 以 外 の 部 位 で 切 断 さ れ た 場 合 に は 、 前 方 へ も 後 方 へ も 頭 部が 再 生 さ れ るこ と を 予 言 し てい る。
第2章 で は 、 ヤ マト ヒ メ ミ ミ ズの 正 常 頭尾 再生を 組織学 的に 観察し 、再生 表を作 成し た。過 去 の貧 毛類 の再生 研究で は、多 様な 種が用 いられ ている が、と りわ けシマ ミミズEisenia foetidaが 主 要 な 材料 で あ っ た。し かし、 シマミ ミズ の再生 能カは かなり 限定 的であ り、実 験室内 での大 量 飼 育 も 容易 で は な い 。 また 、 そ の 他 の種 に お い て も様 々 な 再 生の 例が報 告され ている が、い ず れ も 断 片的 で あ り 、 知 見が 散 乱 し て いる 。 環 形 動 物に お け る 再生 研究が 停滞し てしま った原 因 の ひ と っは 、 実 験 動物と して適 切な動 物を 選定す ること と、そ の動 物の基 礎情報 を共有 するこ と がで きな かった ことに ある。 この ことか ら著者 は、飼 育が容 易で 、きわめて強い再生能カをもっヤ マト ヒメ ミミズ を実験 動物と して 確立さ せるた めに、 詳細な 正常 再生表を作成することで、本種に おけ る再 生研究 の標準 化を目 指し た。
ま ず 、 正 常 再 生の 観 察 に 適 し た断 片 の 条 件 につ い て 検 討 した 。 断 片 作 製に 用 い る 個 体 の体 長 、 直 径お よ び 断 片 の 体節 数 に よ っ て、 再 生 に 違 いが あ る か どう かを調 べた結 果、や せた個 体 か ら 得 られ た 断 片 や 、4体 節 未 満 の 断片 に お い て は、 完 全 な 頭 部体 節 を 再 生 しな い 断 片の割 合 が 高 く な る た め 、 実 験 に 使 用 す る こ と を 避 け る べ き で あ る こ と を 示 し た 。 さ ら に 、 多 種 の組 織 学 的 手 法 を用 い て 詳 細 に再 生 過 程 を 観察 し 、 そ の 頭尾 再 生 芽 の 組 織学 的 特 徴 から 、 次 の ような 再生表 を作成 した 。Stage0で は、自 切が筋 肉の 収縮に よって おこり 、自 切 約6時 間 か ら 傷 口 直 下 の 間 充 織 性 細 胞 で 細 胞 分裂 が 観 察 さ れ る。Stagelで は 、 約12時 間 後 か ら 傷 口の 表 皮 細 胞、各 体節に ある幹 細胞 様の新 成細胞 が分裂 を開 始し、 再生芽 ができ 始める 。 Stage2で は 、頭 部 再生 芽が伸 長し、 内部に 各原 基が見 えるよ うにな る。Stage3では 、頭部 再生芽 に 隔 膜 と体 節 問 溝 が 形 成さ れ 始 め る 。尾 部 で は 成 長帯 が 形 成 され 、再生 が完了 する。Stage4で は 、 頭 部体 節 構 造 が 明 瞭に な り 、 外 部形 態 は ほ ば 完成 す る 。 そし てStage5で 隔膜腺 や体壁 の神 経筋 接合 部など が完成 し、再 生が 完了す る。
再 生表 の 記 械 と いう の は 地 味 な仕 事 の よ う に 見受 け ら れ が ちであ るが、 再生研 究の 基礎と し て は 非 常に 重 要 で あ り 、今 後 の 本 種 の再 生 研 究 へ の貢 献 は 計 り知 れない 。また 、この 研究の 過 程 で 頭 部後 方 の 体 節 に は再 生 が で き ない 部 域 が あ るこ と や 、 再生 芽にお いてマ クロフ ァージ 様 細胞 が存 在する ことを 見出し 、新 たな研 究テー マも提 案して いる 。
近 年 、 無 脊 椎 動物 に お い て も 分子 生 物 学 的 再生 研 究 が 盛 んに な り つ っ ある が 、 頭 尾 再 生の 決 定 機 構に つ い て は 、 まだ ぃ ず れ の 動物 に お い て も明 ら か に なっ ていな い。著 者は、 頭や尾 と いっ た再 生され る器官 の決定 が、 体節構 造と深 い関係 がある とい う新しいアイディアを提出した。
現 時 点 に お い て 、 そ の分 子 生 物 学 的機 構 に つ い ては 全 く 不 明 と はい え 、 体 飾 内の 領 域 陸 と 関 係 す る この 現 象 は 、詳細 に研究 されて いる ショウ ジョウ バェの 発生 におけ る体節 形成と 比較す る こ と で 、系 統 的 に み て 独立 に 進 化 し たと 考 え ら れ る両 動 物 群 にお ける体 節構造 の形成 に関す る 進化 発生 学的な 知見を 得るこ とも貢献できるであろう。こうしたことから、著者が今回得た知見は、
広 い 意 味 で の 動 物 の 発 生 ・ 進 化 研 究 へ の 展 開 が 期 待 で き る も の で も あ る 。 博 士研 究 に お いて 、著者 はヤ マトヒ メミミ ズの再 生につ いて の多く の知見 を記載 し、 無脊椎 動 物 と り わけ 環 形 動 物の研 究に対 しての 貢献 は大き い。よ って著 者は 、北海 道大学 博士（ 理学） の 学位 を授 与され る資格 がある もの と言忍 める。
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