九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository
高解像度融解データの微分法解析による神経膠腫組 織における IDH1/2 と BRAF ホットスポット変異の 正確な検出方法の確立
波多江, 龍亮
https://doi.org/10.15017/1789433
出版情報：Kyushu University, 2016, 博士（医学）, 課程博士 バージョン：
権利関係：Fulltext available.
氏 名 ： 波 多 江 龍 亮
論 文 名 ：P recise Detection of IDH1/2 and BRAF Hotspot Mutations in Clinical Glio ma Tissues by a Differential Calculus Analysis of High-Resolution Melting Data （ 高 解 像 度 融 解 デ ー タ の 微 分 法 解 析 に よ る 神 経 膠 腫 組 織 に お け る IDH1/2 と BRAF ホ ッ ト ス ポ ッ ト 変 異 の 正 確 な 検 出 方 法 の 確 立 ）
区 分 ： 甲
論 文 内 容 の 要 旨
代 表 的 な 悪 性 脳 腫 瘍 で あ る 神 経 膠 腫 に お い て は 、 こ の 5－10 年 の 間 に 特 異 的 な 遺 伝 子 点 変 異 の 発 見 が 相 次 ぎ 、 診 断 の 確 定 や 治 療 感 受 性 の 判 定 に 有 用 で あ る こ と が 示 さ れ 、 そ の 解 析 は 臨 床 現 場 に お い て も 必 須 と な り つ つ あ る 。 し か し 、 従 来 の 遺 伝 子 解 析 法 は 煩 雑 で 、 臨 床 へ の 導 入 は 困 難 で あ る 。 近 年 、 新 規 の 遺 伝 子 解 析 法 と し て 、 リ ア ル タ イ ム PCR の プ ラ ッ ト フ ォ ー ム を 用 い た High Resolution Melting(HRM)法 が 開 発 さ れ た 。本 法 は 非 常 に 迅 速 か つ 簡 便 な 変 異 解 析 法 で 、 臨 床 へ の 導 入 に 適 し て い る 。 し か し 、 従 来 の 解 析 ア ル ゴ リ ズ ム は 、 再 現 性 が 低 く 、 明 確 な 判 定 基 準 が な い と い っ た 課 題 が あ り 、 臨 床 へ の 導 入 は 進 ん で い な い 。 我 々 は 、 本 研 究 で HRMの 新 規 解 析 ア ル ゴ リ ズ ム の 開 発 を 試 み た 。 HRM の 解 析 を 行 う 対 象 と し て 、 外 科 手 術 で 摘 出 し た 腫 瘍 凍 結 サ ン プ ル を 用 い た 。 IDH1R13 2と IDH2R1 7 2の 変 異 に 対 し て は 、192 例 の 神 経 膠 腫 、BRAFV600E 変 異 に 対 し て は 異 な る 51 例 の 脳 腫 瘍 サ ン プ ル セ ッ ト で 解 析 を 行 っ た 。
従 来 の 解 析 ア ル ゴ リ ズ ム で は 、 ま ず 融 解 曲 線 の シ グ ナ ル 強 度 に 補 正 を 加 え 、 次 に 遺 伝 子 変 異 に よ る 変 化 を 、 コ ン ト ロ ー ル で あ る 野 生 型 の 曲 線 と の 差 分 を プ ロ ッ ト(difference plot)す る こ と で 検 出 し 、 変 異 の 判 定 に 用 い る 。 我 々 は 融 解 曲 線 に 対 し 2 回 の 微 分 を 加 え る こ と で 変 異 判 別 の 精 度 の 向 上 を 期 し た 。 こ の 2 回 微 分 の 結 果 を プ ロ ッ ト し た 曲 線 (negative second derivative plot)で は 、変 異 に よ る 融 解 曲 線 の 変 化 が 増 幅 し 、正 常 波 形 と の 比 較 を 用 い ず に 、 明 確 な 視 覚 的 判 定 が 出 来 る よ う に な っ た 。 更 に 、 判 定 を 客 観 的 に す る た め に 、融 解 曲 線 の 変 化 の 程 度 を 数 値 化 し た HRM-MI と い う 指 標 を 開 発 し た 。こ の HRM- MI を 用 い た と こ ろ 、duplicate の 実 験 の 判 定 結 果 が 完 全 に 一 致 し 、再 現 性 が 100％ と な っ た 。ま た 、ダ イ レ ク ト シ ー ク エ ン ス 法 で は 検 出 で き な か っ た IDH1R13 2変 異 を 検 出 し 得 た 症 例 が 3 例 あ っ た 。こ の 新 規 解 析 法 は 、IDH1R13 2、 IDH2R 17 2お よ び BRAFV600E変 異 の 各 々 に お い て も 有 用 性 が 確 認 さ れ 、 腫 瘍 型 や 遺 伝 子 変 異 の 差 異 に 関 わ ら ず 、 普 遍 的 に 有 用 で あ る こ と が 示 さ れ た 。
本 研 究 に よ り 開 発 さ れ た HRM の 新 規 解 析 ア ル ゴ リ ズ ム は 、 従 来 法 よ り も 再 現 性 が 向 上 し 、 定 量 的 な 判 定 が 可 能 と な っ た こ と か ら 、 臨 床 導 入 へ の 端 緒 と な り 得 る 有 用 な ア プ ロ ー チ で あ る と 考 え る 。
