平成２１年 ４月３０日 独立行政法人科学技術振興機構 ＪＳＴイノベーションプラザ福岡 館 長 持 田 勲 殿 （受託者） 住所 名称 契約者名 印
研究成果報告書の提出について
平成２０年度シーズ発掘試験（発掘型）について、契約書第 13 条の規定に基づき下記の課題に ついて報告します。 記 課題番号 課題名 代表研究者 研究期間 15-051 機能性フラーレンを利用する 細胞評価チップの開発 国際環境工学部 講師 礒田隆聡 自平成 20 年 7 月 15 日 至平成 21 年 3 月 31 日課題番号 １５－０５１
平成２０年度シーズ発掘試験（発掘型）研究報告書
報告日：平成２１年
４月
30 日
技術分野
７５
課題名
：
機能性フラーレンを利用する細胞評価チップの開発
研究期間：契
約
締
結
日～平成２１年３月３１日
１.担当コーディネータ 氏 名（役職） 北井 三正（科学技術コーディネータ） 所属機関名 財団法人 北九州産業学術推進機構 連 絡 先 所在地 〒８０８－０１３５ 北九州市若松区ひびきの２－１ TEL/FAX ０９３－６９５－３４４０/０９３－６９５－３４３９ E-mail [email protected] ２.代表研究者（代表研究者のみ記入してください。） 氏 名（役職） 礒田 隆聡（講師） 所属機関名 北九州市立大学 国際環境工学部 連 絡 先 所在地 〒８０８－０１３５ 北九州市若松区ひびきの１－１ TEL/FAX ０９３－６９５－３２８５/０９３－６９５－３３７７ E-mail [email protected] ３.共同研究者（JST と委託研究契約を締結した共同研究機関の場合のみ記入してください。） 氏 名（役職） 所属機関名 連 絡 先 所在地 TEL/FAX E-mail４.試験研究の結果報告 (1)試験内容
(1)試験目的
本研究は、細胞から生産される極微量の抗体を測定し、病態との関連を評価するための「細胞評 価チップ」の開発を目標としている。抗原との特異反応を利用して、試料に含まれる抗体量を測定 する方法に「Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ILISA: 酵素結合免疫吸着法)」が広く行われ ている。このアッセイでは、ハンドリングに数時間～数日かかること、測定装置を含めコストが高 いこと、試料量が数 100μl 以上必要であること、検出には蛍光抗体や発色酵素等が別途必要であ ること等課題が多い。一方、本研究ではチップ平面に配列した微小電極に、抗原を固相化できる絶 縁感応膜を成膜し、微量液滴中に含まれる抗体を反応させる。(図 1) 反応前後では感応膜/液滴 界面の誘電分極が変化するため、電極間に電圧を負荷させるとこの変化量が電圧変化となって検出 できる。そのため試料量を 10μl 程度まで低減できること、蛍光標識化処理が不要となること、検 出は数秒であり測定時間を緒幅に縮小できる等、従来法での課題を克服できることが期待される。 図１ 細胞評価チップによる抗原-抗体反応の検出原理と開発課題 しかし細胞から分泌される抗体は極めて微量であることから、センサの検出電圧の精度をいかに して向上させるかが課題となっている。そのためには、感応膜界面で誘電分極が安定に発現し、抗 体濃度に対して線形応答を示す感応膜の開発が必要である。 本研究では細胞評価チップのセンサ検出機能の精度の向上を目的として、種々の材料の中からフ ラーレンの機能性に着目した。フラーレンは炭素電極をアーク放電させる際、電極上に生成する煤 （スート）中に含まれる。スート中には、C60 の他に C70、巨大フラーレン、またカーボンナノチ ューブ等が混在している。工業的には溶剤による分離精製を経て製品化されるため収率が低く、高 価である。また表面化学修飾等の二次加工を行わないと水溶性が発現しない。そのため医療やバイ オ分野への用途が限定されているのが現状である。そこで本研究では、フラーレンの溶剤中での相 変化に着目した。（図 2）
図 2 フラーレンの溶剤中での相変化 図 2 Case1 ではフラーレンが特定の溶剤に可溶化する性質を利用して、その可溶成分（以下 C60(S)）を分別し、溶液形態で利用する方法である。フラーレンを可溶化する溶媒としては、トル エン、ジクロロベンゼン等が知られている。いずれも可溶化率は 10wt%前後である。図 2 Case2 では C60(S)にフラーレンを可溶化しない溶媒を混入させて、フラーレン結晶の集合微粒子を形成 させる。この場合は、微粒子が溶剤に分散した形態で利用する方法である。どの場合も高純度に C60 が含まれ、また溶剤に均一に溶解あるいは分散した状態であるため、バインダーに添加して薄 膜状態に成型することが可能である。 (2)実施内容と数値目標 図 3 実施年度における開発の数値目標 図 3 に当該年度における開発の実施内容と数値目標を示す。実施項目は以下の 3 段階で行った。 （1） C60(S)成分をドーピングしたセンサ感応膜成型方法の確立 （2） C60(S)成分ドーピングセンサ感応膜の Na イオン検出精度試験 （3） C60(S)成分ドーピングセンサ感応膜のイムノグロブリン抗体(以下 IgG）検出精度試験
(2)得られた成果 (1)C60(S)成分をドーピングしたセンサ感応膜成型方法の確立 図 4 細胞評価チップの概観と構造 図 4 に細胞評価チップの概観と構造を示す。ガラス基板上に Cr/Au を積層させ、フォトリソグラ フィー法にて電極をパターニングした。さらに光感応性樹脂を積層させ、同様に電極上部にウェル 開口部をパターニング形成した。 図 5 C60 ドーピング膜の作製①（均一溶解膜） 図 5 に、溶剤に均一に溶解した C60(S) (図 2 Case1 に対応)をドーピングしたセンサ感応膜の作 製方法を示す。（以下、均一溶解膜と記載）市販 C60 に、ジクロロベンゼンを混合、溶解させ、遠 心分離で可溶成分を分離した。この C60(S)をポリイミド系樹脂含有溶剤と 1：1 比で混合した溶液 を、図 4 で作製したセンサチップに滴下し、スピンコーティング法で電極上に薄膜を成型させた。 図 6 に、溶剤に均一に分散した C60 結晶微粒子 (図 2 Case1 に対応)をドーピングしたセンサ感 応膜の作製方法を示す。（以下、微粒子分散膜と記載）Case1 と同様に C60(S)溶液を調製した。こ の C60(S)を塩化ビニル系樹脂含有溶剤と 1：1 比で混合した溶液を、図 4 で作製したセンサチップ に滴下し、スピンコーティング法で電極上に薄膜を成型させた。 膜 作製 均一溶解膜 C60（純度99%）※：10〜30mg ※ (株)製 ：nanom purple C60 ：500μ ｌ 中 混合 溶解 遠⼼分離 可溶分抽出：Ｃ60（Ｓ） 成分添加 ： 系樹脂含有溶剤 成分：Ｃ60（Ｓ）=１：１混合液 滴下 C60（S）均⼀溶解膜形成 ※分離孔：100nm 膜 作製 均一溶解膜 C60（純度99%）※：10〜30mg C60（純度99%）※：10〜30mg ※ (株)製 ：nanom purple C60 ：500μ ｌ 中 混合 溶解 遠⼼分離 可溶分抽出：Ｃ60（Ｓ） 成分添加 ： 系樹脂含有溶剤 成分：Ｃ60（Ｓ）=１：１混合液 滴下 C60（S）均⼀溶解膜形成 ※分離孔：100nm
図 6 C60 ドーピング膜の作製②（微粒子分散膜） 図 7 C60 ドーピング膜の顕微鏡画像①（均一溶解膜） 図 7 に均一溶解膜の顕微鏡写真を示す。左は C60(S)をドープした膜である。右は比較のために 不溶分（C60(IS)）を混入させたものである。C60(S)は感応膜中に均一にドーピングされているこ とが明白である。 図 8 C60 ドーピング膜の顕微鏡画像②（微粒子分散膜） 膜 作製 微粒子分散膜 C60（純度99%）※：10mg ※ (株)製 ：nanom purple C60 ：500μ ｌ 中 混合 溶解 遠⼼分離 可溶分抽出：Ｃ60（Ｓ） 成分添加 ：塩化 系樹脂含有溶剤 成分：Ｃ60（Ｓ）=１：１ 沈殿 滴下 C60（S）微粒⼦分散膜形成 ※分離孔：100nm 膜 作製 微粒子分散膜 C60（純度99%）※：10mg C60（純度99%）※：10mg ※ (株)製 ：nanom purple C60 ：500μ ｌ 中 混合 溶解 遠⼼分離 可溶分抽出：Ｃ60（Ｓ） 成分添加 ：塩化 系樹脂含有溶剤 成分：Ｃ60（Ｓ）=１：１ 沈殿 滴下 C60（S）微粒⼦分散膜形成 ※分離孔：100nm 均一溶解膜 顕微鏡画像 可溶分 均一溶解膜 不均一膜 中心点 均一溶解膜 顕微鏡画像 可溶分 均一溶解膜 不均一膜 中心点 可溶分 均一溶解膜 不均一膜 中心点 微粒子分散膜 顕微鏡画像 可溶分 再結晶分散膜 比較 中心点 微粒子分散膜 顕微鏡画像 可溶分 再結晶分散膜 比較 中心点
図 8 に微粒子分散膜の顕微鏡写真を示す。左は C60(S)をドープした膜である。右は比較のため にドープ無の場合である。画像中の白色微粒は、抗体を固相化させるための添加成分である。膜中 に粒径 10～20μm の黒点が観察された。(図中矢印) 図 9 に図 8 の低倍率画像を示す。C60(S)の再結晶微粒子は、ウェル内部の感応膜に広範囲に分散 して存在していることが明らかである。 図 8 C60 ドーピング膜の顕微鏡画像②（微粒子分散膜） (2) C60(S)成分ドーピングセンサ感応膜の Na イオン検出精度試験 図 9 センサ測定機器概観（バイオセンサモジュール 2006 モデル：アーズ（株）） 図 9 にセンサ測定機器を示す。測定はセンサチップを子機端末（画面左）に装着し、チップ上に 所定濃度の生理食塩水(以下 PBS×N：N＝規定濃度 1 に対する濃度比)を所定量滴下した。センサ検 出電圧(アナログ信号)は子機中の信号回路でデジタル変換され、無線回路によって親機（画面 右) へ常時送信される。親機で受信した信号は PC へ転送され、時間 vs 電圧のグラフが表示、保存 される。 図 10 に、C60(S)ドーピング量を変えた均一溶解膜のセンサチップを用いて、各ウェルに蒸留水 4μl を滴下した場合の、C60(S)ドーピング量(※注：分離前の C60 の総量)と 検出電圧の関係を示 す。比較のため C60 不溶分(C60(IS))を混入させた場合のセンサチップでの結果も示す。蒸留水測 定の場合、検出電圧は 700mV と小さく、また C60(S)ドーピング量に関係なくほぼ一定値を示して 再結晶分散膜 顕微鏡画像 再結晶分散膜 顕微鏡画像 膜 評価 検出精度 感度補正機構 株 膜 評価 検出精度 感度補正機構 株
いる。これは蒸留水の場合、センサ感応膜の界面で生じる誘電分極が小さいため、膜の組成による 影響が現れないことを示している。 図 10 C60(S)ドーピング量と検出電圧の関係① 図 11 C60(S)ドーピング量と検出電圧の関係② (測定試料：4μl 蒸留水) (測定試料：4μl PBS×1) 図 11 に、C60(S)ドーピング量を変えた均一溶解膜のセンサチップを用いて、各ウェルに PBS×1 溶液 4μl を滴下した場合の、C60(S)ドーピング量(※注：分離前の C60 の総量)と 検出電圧の関係 を示す。比較のため C60 不溶分(C60(IS))を混入させた場合のセンサチップでの結果も示す。PBS 測定の場合、検出電圧は C60(S)のドーピング量に大きく依存し、ノンドープで 1300mV であるのが、 ドーピング 10mg で最大値 1800mＶを示している。これは感応膜に不溶分が含まれている場合は変 化が緩慢になっている。このことから C60(S)をドーピングすると、センサ感応膜の界面で生じる 誘電分極が顕著に増加することを示している。 図 12 感応膜の違いによる Na イオン応答性への影響 (感応膜：ポリイミド系樹脂膜（バインダー）のみ(左)； C60(S)均一溶解膜(中央)；C60(S)+C60(IS)不均一溶解膜 (右)，測定試料：PBS×N（N＝0.2，1，2.3）各 4μl) 測定 感度補正機構 蒸留水測定 実施例 均一溶解膜 特性 添加量 検出電圧 添加量 電圧値 関係 添加量 電 圧 値 不溶分含有 可溶分 均一溶解膜 不均一膜 測定 感度補正機構 蒸留水測定 実施例 均一溶解膜 特性 添加量 検出電圧 添加量 電圧値 関係 添加量 電 圧 値 不溶分含有 可溶分 均一溶解膜 不均一膜 添加量 電圧値 関係 添加量 電 圧 値 不溶分含有 可溶分 均一溶解膜 不均一膜 測定 感度補正機構 実施例 均一溶解膜 特性 添加量 検出電圧 生理食塩水測定 添 加 量 電 圧 値 関 係 添 加 量 電 圧 値 不 溶 分 含 有 可 溶 分 均一溶解膜 不均一膜 測定 感度補正機構 実施例 均一溶解膜 特性 添加量 検出電圧 生理食塩水測定 添 加 量 電 圧 値 関 係 添 加 量 電 圧 値 不 溶 分 含 有 可 溶 分 均一溶解膜 不均一膜 添 加 量 電 圧 値 関 係 添 加 量 電 圧 値 不 溶 分 含 有 可 溶 分 均一溶解膜 不均一膜 測定 感度補正機構 系樹脂 膜 実施例 均一溶解膜 特性 濃度 検出電圧 精度 濃度 平均電圧値 濃度 平 均 電 圧 測定 感度補正機構 系樹脂 膜 実施例 均一溶解膜 特性 濃度 検出電圧 精度 濃度 平均電圧値 濃度 平 均 電 圧 測定 感度補正機構 実施例 均一溶解膜 特性 濃度 検出電圧 精度 濃度 平均電圧値 濃度 平均電圧 均一溶解膜 測定 感度補正機構 実施例 均一溶解膜 特性 濃度 検出電圧 精度 濃度 平均電圧値 濃度 平均電圧 均一溶解膜 測定 感度補正機構 実施例 均一溶解膜 特性 濃度 検出電圧 精度 濃度 平均電圧値 濃度 平 均 電 圧 不均一膜 測定 感度補正機構 実施例 均一溶解膜 特性 濃度 検出電圧 精度 濃度 平均電圧値 濃度 平 均 電 圧 不均一膜
図 12 に感応膜の種類を変えたセンサチップを用いて、各ウェルに PBS×0.2，1，2.3 の濃度にな るように PBS 溶液を 4μl ずつ滴下した場合の、検出電圧と PBS 濃度の関係を示す。図左は感応膜 がポリイミド系樹脂膜（バインダー）のみ、図中央は C60(S)均一溶解膜、図右は C60(S)+C60(IS) 不均一溶解膜を成膜した場合の結果である。図中のプロットは、5 センサで得られた検出電圧の平 均値であり、プロット上のバーはバラつきの最大値、最小値を示している。また図中には最小二乗 法による一次近似直線と、(R 相関係数2値)を示した。グラフはバー表示が小さい程、バラつきが 小さいことを示す。また相関係数は理想直線では 1.0 となるため、R2=1.0 に近い程、濃度との相関 が高いことを示す。 PBS×1 の主成分は Na イオンであり約 3%含まれる。各々の感応膜での相関係数は、ポリイミド系 樹脂膜では 0.9959、C60(S)均一溶解膜では 0.9960、C60(S)+C60(IS)不均一溶解膜では 0.9996 であ り、理想直線に極めて近い応答を示している。このように PBS 濃度と検出電圧の間には良好な相関 が見られ、主成分である Na イオン量と感応膜の誘電分極量が線形的に応答していることが明らか である。 しかしプロットのバラつきは、大きい方から C60(S)+C60(IS)不均一溶解膜＞ポリイミド系樹脂 膜＞C60(S)均一溶解膜の序列となっている。このことから C60(S)のドーピングは、5 センサの検出 電圧のバラつきを減少させる効果があることが明らかである。 (3) C60(S)成分ドーピングセンサ感応膜のイムノグロブリン抗体検出精度試験 図 13 感応膜の違いによるイムノグロブリン抗体応答性への影響① (感応膜：塩化ビニル系樹脂膜（バインダー）のみ；同一センサチッ プの左側測定(左図)および右側測定(右図)，固相化物質：マウス IgG， 測定試料：マウス抗 IgG＝0.5，1，4，7，10μg/ml）各 12μl) 図 13 にバインダーを感応膜としたセンサチップにイムノグロブリン抗体(IgG)を固相化し、抗原 (抗 IgG)試料を滴下した場合の、抗原濃度とセンサ相対応答値の関係を示す。バインダー組成は塩 化ビニル系樹脂膜に抗体固相化剤を添加した。センサ試験に先立ち、予め FITC 標識 IgG 抗体を用 測 定 感 度 補 正 機 構 塩 化 系 樹 脂 膜 抗 体 塗 布 実 施 例 微 粒 子 分 散 膜 特 性 抗 抗 体 検 出 電 圧 精 度 解 析 電 圧 減 少 率 解 析 電 圧 減 少 率 測 定 感 度 補 正 機 構 塩 化 系 樹 脂 膜 抗 体 塗 布 実 施 例 微 粒 子 分 散 膜 特 性 抗 抗 体 検 出 電 圧 精 度 解 析 電 圧 減 少 率 解 析 電 圧 減 少 率
いて、抗体濃度、量、ウェル滴下時間を変えた固相化条件の最適化を行った。その結果、感応膜上 への抗体固相化は、100μg/ml IgG 溶液 5μl を各々のウェルに滴下し 5 分間放置後、蒸留水で洗 浄することで条件を統一した。各ウェルには予め PBS×0.2 溶液 4μl を滴下し、一定時間後、マウ ス抗 IgG＝0.5，1，4，7，10μg/ml 溶液（各 12μl）を、各々のウェルに滴下した。センサ相対応 答値は、最小検出電圧と最大検出電圧の応答幅に対して、抗原滴下後の平衡電圧の比とした。図 13 の左右のグラフは、同一センサチップの左側 5 センサ及び右側 5 センサを測定し、2 回の測定か ら再現性を確かめたものである。バインダーのみを感応膜とした場合、相関係数は同一チップの左 側測定で 0.1625、右側測定で 0.3837 であり、抗原濃度とセンサ応答性の相関は低い。また再現性 も乏しい。 図 14 感応膜の違いによるイムノグロブリン抗体応答性への影響② (感応膜：C60(S)微粒子分散膜（バインダー組成は図 13 と同一）；同一 センサチップの左側測定(左図)および右側測定(右図)，固相化物質： マウス IgG，測定試料：マウス抗 IgG＝0.5，1，4，7，10μg/ml） 各 12μl) 図 14 に、C60(S)微粒子分散膜に IgG を固相化し、抗 IgG 試料を滴下した場合の、抗原濃度とセ ンサ相対応答値の関係を示す。バインダー組成は図 13 の実施例と同一である。バインダー中に C60(S)が分散している感応膜での抗 IgG 測定では、相関係数は同一チップの左側測定で 0.8846、 右側測定で 0.8355 である。バインダーのみを感応膜とした場合と比較して、高い精度が得られて いる。またチップ左右の側での測定で、再現性が向上している。このことから C60(S)の微粒子融 合体のドーピングは、センサ検出のバラつきを低下させ、再現性を高め、抗原濃度測定における濃 度と応答値の相関性を向上させる効果があることが明らかとなった。 測 定 感度補正 機構 実施例 微粒子分散膜 特性 抗 抗体 検出電圧 精度 微粒子分散膜 抗 体塗布 解析 電圧減少 率 解析 相 対応 答率 測 定 感度補正 機構 実施例 微粒子分散膜 特性 抗 抗体 検出電圧 精度 微粒子分散膜 抗 体塗布 解析 電圧減少 率 解析 相 対応 答率
(3)今後の展開 本研究成果は現在、(財)北九州市産業学術推進機構の知的財産部にて特許出願の審査中である。 平成 21 年度内には特許出願を 1 件予定している。その後、海外専門誌へ論文投稿を予定している。 (4)知的財産権について （3）の予定と同じ (5)今後のフォローアップ等について（コーディネータ記載） 本研究代表者は、北九州学術研究都市で実施中の文部科学省知的クラスター II 期事業に平成 21 年度～23 年度の期間で参画することが決定している。(テーマ名：MEMS センサ・デバイスの高感度 化とシステム化技術の研究開発 分担：抗原-抗体センサチップ“Micro-ELISA”の量産事業化 初 年度予算 7,837 千円）本研究は、その中で事業化の一要素技術として展開していく予定である。 同財団の知的クラスター事務局の科学技術コーディネーターおよび参与にフォローアップが継 続される予定であり、今後の展開が期待される。
