-酸性糖タンパク質の 構造及び機能特性の評価

熊本大学学位論文

膜−水相界面におけるα

-酸性糖タンパク質の 構造及び機能特性の評価

2004 西  弘 二

Evaluation of structural and functional characteristics of α

-acid glycoprotein on membrane–water phase

Koji Nishi

Evaluation of structural and functional characteristics of

-acid glycoprotein on membrane–water phase

Koji Nishi

-Acid glycoprotein (AGP), a member of the lipocalin family, is a polypeptide with 2 disulfide bonds and 5 carbohydrate chains, which account for about 45% of its total mass of 40 kD. It is a major binding protein for neutral and basic ligands. Although its three-dimensional structure and biological functions are still unknown, circular dichroism (CD) measurements and molecular modeling lead to the conclusion that this protein has a largely β-sheet structure in aqueous solution.

 The hypothesis that membrane transport of a drug depends on the concentration of

the non-bound drug is widely accepted. However, because this hypothesis does not fully explain the uptake mechanism of some AGP-binding drugs, a protein-mediated uptake system has been proposed. In such a system, structural changes in the protein due to the interactions with the membrane surface decrease its drug-binding capacity.

Here, we report structural and functional properties of AGP in the interaction with the membrane and various factors involved in it.

1) In reverse micelles used as the membrane model, new peaks for AGP at 209nm and 222nm appeared in the CD spectrum. This result suggests that, as the result of the interaction with the membrane, the structural conformation of AGP changes to an

- helix structure from the original

-sheet structure in native state. From experiments of its drug-binding properties, the binding capacity of AGP to three representative drugs in reverse micelles becomes significantly decreased. These results support the validity of the AGP mediated ligand-uptake model.

2) Based on experiments using liposomes under mildly acidic conditions, it appears that

AGP is converted into an

membrane by the electrostatic interaction, and the unique structural conformation of

AGP under mildly acidic conditions becomes a trigger for its interaction. The binding

capacity of AGP to progesterone was significantly decreased as the result of the

interaction with the membrane. These results also strongly support the view that some

AGP-binding drugs are taken up into the tissue in the AGP mediated ligand-uptake model. In addition, an expression system of recombinant AGP (rAGP), which had not been previously established, was constructed using yeast (Pichia pastoris), and the findings indicate that rAGP had similar structural and functional properties to AGP. On the examination using tryptophan (Trp, W) mutants (W25A, W122A and W160A) produced by this expression system, Trp25 and Trp160 appear to be present in the hydrophobic region in the interior of the membrane and Trp122 was on the outside.

3) In mildly acidic condition (pH4.0), methanol and other alcohols significantly induced an α-helix structure formation in AGP. It was also observed that this

was formed under strong acidic (pH2.0) and highly ionic (1.5M NaCl) conditions.

These results indicate that hydrophobic interaction involve in the formation of an

- helix structure for AGP, and an

-helix structure of AGP observed in its interaction with the membrane is formed inside the membrane.

4) Since the structural properties of reduced asialo-AGP (RA-AGP) are similar to molten-globule structure observed under strongly acidic (pH2.0) and highly ionic (1.5M NaCl) conditions and in the presence of alcohol, RA-AGP might serve as a useful model of an

membrane. The results obtained herein using RA-AGP indicate that, in the formation of a molten-globule structure of AGP, two steps are involved, that is, the first is a fast step (seconds to minutes) and the second a slow one (〜hrs). Moreover, using histidine mutants and chemically modified AGP, the findings indicate indicated that His97 and His100 are important residues in the formation of an α-helix structure of AGP.

 These results provide useful basic information for the appropriate use of an AGP

binding-drug, in which the protein-binding rate is its index. Moreover, it would also be

interesting to evaluate the relationship between the biological function of the molecule

and structural characteristics.

本論文で使用した略語一覧

AGP

-酸性糖タンパク質

-Acid glycoprotein

A-AGP

AGP Asialo-AGP

Ala; A

Alanine

AOX1

1 Alcohol oxidase 1 Asn

Asparagine

1,4-Bu(OH)

1,4-ブタンジオール 1,4-Butandiol

BSA

Bovine serum albumin

CD

Circular dichroism

CYP

P450 Cytochrome P450 DMI

Desipramine Es

Estradiol

ESR

Electron spin resonance

EtOH

Ethanol

Et(OH)

Ethandiol

GPF

F Glycopeptidase F

hAGP

AGP Human AGP

His; H

Histidine

HSA

Human serum albumin IMP

Imipramine

MeOH

Methanol

NMR

Nuclear magnetic resonance

PC

Phosphatidyl-choline PE

Phosphatidyl-ethanol-

amine

PG

Phosphatidyl-glycerol PL

Propranolol

PrOH

Propanol

1,2-Pr(OH)

1,2-プロパンジオール 1,2-Propanediol

PS

Phosphatidyl-serine

RA-AGP

AGP Reduced asialo-AGP

rAGP

AGP Recombinant AGP

R-AGP

AGP Reduced-AGP

TFE 2,2,2-トリフルオロエタノール Trifluoroethanol

Trp; W

Tryptophan

WT

Wild type

本論文は学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである。

(1)

Structural and Drug-binding Properties of

-Acid Glycoprotein in Reverse Micelles

Biochim. Biophys. Acta,1601, 185-191 (2002).

Nishi K, Sakai N, Komine Y, Maruyama T, Halsall H.B, Otagiri M.

(2)

Binding of α

-Acid Glycoprotein to Membrane Results in Unique Structural Change and Ligand Release

Biochemistry, submitted for publication.

Nishi K, Maruyama T, Handa T, Halsall H.B, Otagiri M.

(3) Role of Histidine Residues on the Formation of α-Helix Structure of α1

-Acid Glycoprotein

In preparation.

Nishi K, Fukunaga N, Komine Y, Maruyama T, Halsall H.B, Otagiri M.

目次

第

1

第

2

-酸性糖タンパク質（AGP）と逆相ミセルの相互作用に

 第

1

---5

 第

2

AGP

---5

2-1

AGP

2-2

AGP

---6

 第

3

---8

第

3

---10

 第

1

---10

 第

2

AGP

---10

2-1

pH

---10

2-2

---14

 第

3

AGP

---15

3-1

---15

3-2 pH

---17

3-3

---18

 第

4

AGP

---19

 第

5

AGP-リポソーム複合体の構造特性評価 ---20

5-1

---20

5-2

AGP

---21

5-3

AGP

---25

5-4 Trp

---27

 第

6

---28

第

4

-ヘリックス構造形成機構に関する検討 ---31

 第

1

---31

 第

2

AGP

---31

2-1

2-2 AGP

---32

 第

3

AGP

---34

3-1 AGP

3-2 Stern-Volmer

Trp

---35

 第

4

---36

第

5

-ヘリックス構造形成における各種因子の検討 ---38

 第

1

---38

 第

2

---38

2-1

AGP

---38

2-2

---39

2-3 CD

---40

2-4

---41

 第

3

---43

第

6

実験の部

---48

謝辞

---54

参考文献

---55

第

1

 α1

-酸性糖タンパク質（AGP）は、183

る分子量約

40kD

約

45%と他の糖タンパク質のなかでも極めて高いため、 X

NMR

シート構造に富んでいることが報告されている^2,3)。

N

C

164

183

54 38 15

5

85 75

72 147

Figure 1. Structural model of AGP

 ：Glycan、■：-S-S- bond

 このタンパク質の生物学的意義は現在までのところ不明であるが、疎水性化 合物の輸送担体として機能しているタンパク質、リポカリンファミリーの一員 として分類されている ^4,5)。事実、血中では多くの塩基性薬物やステロイドホル モン類の主要結合担体として働き、結合薬物の体内挙動に影響を及ぼしている

1,6)。また、AGP は生体反応の急性期（ストレス、外傷、炎症、腫瘍等）に血中 及び組織中で著しく増加する急性相反応物質の一つでもあり ^7-9)、Cytochrome

P450（CYP）をはじめとする一連の薬物代謝酵素を誘導するフェノバルビター

10,11)。このような

AGP

に変化をもたらし、その体内動態、ひいては薬理効果に影響を与える可能性が 十分に考えられる。事実、従来の

in vivo

in vitro

ンスジェニックマウスを用いた検討で、血中の

AGP

UCN-01

9R*, 10R*, 12R*)-2, 3, 9, 10, 11, 12-Hexahydro-3-hydroxy-9-methoxy-8-methyl-10- (methylamino)-8, 12-epoxy-1H, 8H-2, 7b, 12a-triazadibenzo[a, g]–cyclonona[cde]

trinden-1-one; 7-Hydroxy-staurosporine）のヒトにおける体内動態（総クリアラン

In vitro n/Kd (mM-1 )

0.1

1 10 100

1 10 100 1000

0.1

PL-AGP

PL-BSA Es-BSA

Trp-BSA

In vivo n/Kd (mM-1)

Figure 2. Relationship between in vivo and in vitro ligand binding (n/Kd) to plasma protein

The solid line represents a 1:1 relationship. Abbreviations are as follows: BSA, bovine serum albumin; PL, propranolol; IMP, imipramine; DMI, desipramine;

Es, estradiol; Trp, tryptophan.

IMP-AGP DMI-AGP

 その一方で、これら

AGP

AGP

同じ輸送タンパク質であるヒト血清アルブミン（

HSA）においても観察されて

いる ^15-17)。このような背景には、タンパク質介在性のリガンドの組織移行機構

の存在の可能性が考えられる。これは、細胞表面に結合した一部の血中タンパ

ク質が生体膜との相互作用により構造変化を惹起し、次いで、結合型リガンド を解離・放出するというものである（

Figure 3）。実際、ヒト白血球（リンパ球、

顆粒球、単球）及び赤血球表面上での AGP の存在が蛍光電子顕微鏡により確 認されている ^18,19)。最近、AGP は血管内皮細胞の表面に結合し、エンドサイト ーシス→エキソサイトーシスという過程（トランスサイトーシス）により血中 から消失するという報告もあり、この過程における

AGP

Membrane Blood Tissue

L

Protein L

L Ligand

Protein

L L

Figure 3. Proposed model for protein-mediated ligand uptake into tissue

 最近、Bychkova らは、生体内でタンパク質が生体膜と相互作用する際、タン パク質の構造に一種の変性状態である 緩み が起こることから、この状態が 天然状態と変性状態の中間にあるのではないかという仮説を提唱している^22,23)。 実際に、生理的条件下ではタンパク質の変性構造として、ランダムコイルのよ うな高度な変性状態は考えにくく、むしろ中間状態として様々な機能を果たし ていると考えるほうが、極めて合理的でありかつ魅力的である。このことは、

AGP

結合型リガンドを組織へ放出するのみでなく、生理活性を誘起させる可能性を も期待させる。

 これまで、生体膜を構成している脂質二重膜や糖脂質等は細胞内小器官を内 封するためだけに存在する器官として、その機能は極めて消極的なものと考え られてきた。しかし最近の報告から、生体膜は非常に多彩な機能を持つことが 明らかにされつつある。そのなかの一つに生体内に存在するタンパク質との相 互作用がある。この場合、その因子として生体膜自身が持つ様々な物理化学的 性質が挙げられる。一般に生体膜表面は負の電荷を帯びることから、その静電 的ポテンシャルにより周囲のバルク相からプロトンが引き寄せられ、局所的に

pH

れている ^25-30)。そのため、AGP と生体膜の間にもこのような因子が関与し、相

互作用を促す可能性が十分に考えられる。

 このような背景のもと、AGP と生体膜の相互作用様式とその際の

AGP

2

3

AGP

4

AGP

AGP

AGP

5

6

AGP

S

AGP

第

2

-酸性糖タンパク質（ AGP）と逆相ミセルの相互作用に関する

第

1

 疎水性領域と親水性領域を兼ね備えた界面活性剤のミセルは、生体膜の最も 単純なモデルとして親水効果の研究過程にしばしば用いられる^31,32)。なかでも、

逆相ミセル内部は、膜-水相界面のミミックとして数多く用いられてきた。この 逆相ミセルは、界面活性剤、有機溶媒、水の三種混合系であり、このうち

AGP

第

2

2-1 逆相ミセル中の AGP

 これまで、CD スペクトルや分子モデルの設計から、

AGP

AGP

CD

AGP

遠紫外領域においては、219nm付近のピークと

209nm

CD

したがって、逆相ミセル中で観察された三次構造の欠如は、これら分子内相互 作用が崩壊し側鎖の運動の自由度が高くなったことを示している。また興味深 いことに、遠紫外領域では、209nmと

222nm

ス構造に特有なスペクトルが増大した。これらの結果から、

AGP

-50

250 350

(B)

Wavelength (nm) -6

0 6

200 250

-12

Wavelength (nm)

0 50

[θ] (deg・cm2・dmol-1)

[θ]×10-3 (deg・cm2・dmol-1) 100

(A)

N I

N

I

Figure 4. Far (A) and near (B) UV CD spectra of AGP in native state (N; solid line) and membrane interaction mode (I; dashed line)

2-2 逆相ミセル中の AGP

 これまでに、

AGP

AGP

AGP

AGP

 AGP は、その分子内に三つのトリプトファン（

Trp）残基を有しており、こ

Trp

70%、プロゲステロンでは 20%で消光に飽和が観

Trp

プロマジンやジクマロールにおいては二つの

Trp

Trp

AGP

CH3

CH3 C CH3

O

H H

H O

O

OH

O

OH OO

N S

Cl (CH2)3N(CH3)2

Chlorpromazine Dicumarol Progesterone

Figure 5. Chemical structures of chlorpromazine, dicumarol and progesterone

0 1

0 1 2 3 4 5 6

Relative Trp fluorescence intensity

Figure 6. Fluorescence quenching titration curves of various drug-binding to AGP

Each symbol represents chlorpromazine (■), dicumarol (▲) and progesterone (●) respectively.

[Drug] / [AGP]

 逆相ミセル中での結合性を水溶液中のそれと比較すると、塩基性薬物のクロ ルプロマジンは、結合サイト数の変化なしに結合定数の著しい低下が認められ た。対照的に、酸性薬物のジクマロールの結合性はほとんど変化しなかった。

また、プロゲステロンにおいては、わずかな結合定数の低下に加え、結合サイ ト数の有意な減少が認められた。事実、結合能の指標である

nKa

-ヘリックス構造への転移過程において、それぞれの結

in Buffer in Reverse micells

n Ka nKa

Dicumarol Chlorpromazine Progesterone

1.04±0.17 0.95±0.08 0.99±0.09

2.83±0.09 3.61±0.34 2.14±0.19

2.95±0.50 3.42±0.33 2.13±0.31

1.29±0.14 0.91±0.32 0.57±0.01^＊

3.10±0.05 0.98±0.25^＊＊＊

1.61±0.31

n Ka nKa

4.00±0.42 0.88±0.37^＊＊＊

0.94±0.18^＊＊

n; the number of binding sites, Ka; the association constant (x10⁶M-1).

All values are the means ± S.D. (3-5 experiments)

＊Significantly different from value in buffer, p<0.05

＊＊Significantly different from value in buffer, p<0.01

＊＊＊Significantly different from value in buffer, p<0.001

Table 1. Apparent binding parameters of drugs to AGP by fluorescence quenching method

第

3

 本章では、生体膜のモデルとしてアニオン性の逆相ミセルを作製し、AGP と 逆相ミセルの相互作用について検討した。逆相ミセル中の

AGP

CD

AGP

AGP

1）逆相ミセル存在下、AGP

CD

222nm

たなピークが観察された。これは

AGP

2）逆相ミセルと相互作用した際、三種の薬物のうち塩基性薬物のクロルプロ

結合能の減少が観察された。そのため、生体膜との相互作用による

AGP

 これらの知見は、これまでに報告された

AGP

in vivo

in vitro

AGP

また、生体膜との相互作用により観察されたα-ヘリックス構造体には、これま で解明されていない

AGP

第

3

第

1

 人工脂質二重膜、リポソームは生体膜の最も単純なモデルとして、膜の物性 のみならず、タンパク質、ペプチド及び低分子化合物等との相互作用に関する 研究に汎用されている ^35,36)。同じ生体膜モデルである逆相ミセルは、界面活性 剤や有機溶媒などタンパク質の性質に影響を及ぼしやすい物質から形成される が、一方でリポソームは実際に脂質二重膜を形成しているリン脂質から調製さ れるため、逆相ミセルよりもより生体膜に近いモデルであると言える。そこで、

中性リン脂質であるホスファチジルコリン（PC）、酸性リン脂質であるホスフ ァチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルセリン（PS）及びホスファチジ ルエタノールアミン（PE）を用いて中性及びアニオン性のリポソームを調製し、

AGP

AGP

第

2

2-1 電荷及び pH

 生体膜表面は、そのポテンシャルにより負の電荷を帯びており、さらにこれ がバルク相のプロトンを引き寄せることにより、生体膜近傍の環境は緩和な酸 性条件下にあることが報告されている ²⁴⁾。このような条件が、AGPと生体膜の 相互作用に関与している可能性は高い。そこで、酸性領域の各

pH

AGP

PG

PC

その結果、pHの低下に伴う

PG-membrane

AGP

AGP

pH6.0

pH4.5

間で急激に上昇した理由として、このような

pH

AGP

0 100

4 5 6 7 8

PG-membrane

PC-membrane

% Bound AGP

pH

Figure 7. Effect of pH on AGP-membrane (PG (■)- and PC (●)-membrane) interaction 80

60 40 20

T a b l e 2 . A p p a r e n t a s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K a ) o f A G P w i t h P G - a n d P C - m e m b r a n e a t v a r i o u s p H s

Lipid

PG

PC

pH Ka (M

)

7.4 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 7.4 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5

100 ± 40 140 ± 60 330 ± 30 830 ± 60 3,500 ± 280 63,000 ± 9500

60 ± 20

90 ± 10

80 ± 10

90 ± 10

240 ± 10

200 ± 230

 一般にタンパク質と生体膜の結合は、タンパク質の正の電荷と生体膜の負の 電荷との静電的相互作用による場合が多い。事実、これまでに、生体膜との静 電的相互作用により相互作用を引き起こすタンパク質の存在が数多く報告され

ている ^25-30)。このような静電的相互作用の関与を確認する方法としては、イオ

ン強度を変化させ、その影響を観察するのが最も一般的である。すなわち、

NaCl

AGP

pH4.5

NaCl

AGP

PG-及び PC-membrane

Table 3

PG-

membrane

得られた結果と合わせて考えると、AGP は膜近傍の環境と類似した緩和な酸性 条件下で膜との結合性を示し、そこには静電的相互作用が関与していることが 強く示唆された。

0 50 100

0 75 150 0 75 150

NaCl concentration (mM)

% Bound AGP

N.D.

(A) (B)

PG-membrane PC-membrane

Figure 8. Effect of ionic strength on the binding of AGP to membrane at pH7.4 (A) and pH4.5 (B)

N.D. : not determined

Table 3. Effect of ionic strength on the apparent association constant (Ka) of AGP to membrane at pH4.5

Lipid PG

PC

NaCl (mM) Ka (M

) 0

75

150 330 ± 400

1,500 ± 170 63,000 ± 9,500

0 75 150

200 ± 230 100 ± 110

N.D.

N.D. : not determined

 さらに、PGと同じ酸性リン脂質である

PS、PE

AGP

0 100

PG PS PE PC

% Bound AGP

80 60 40 20

Figure 9. Binding of AGP to PG-, PS-, PE-, and PC-membrane at pH4.5

 PS は

PG

Figure 9

PG

AGP

AGP

2-2 シアル酸の影響

 AGP はその分子内の五つのアスパラギン（Asn）残基に枝分かれ構造を有す る糖鎖が結合しており，血清タンパク質のなかでも最も糖化されているタンパ ク質の一つである。いずれの糖鎖末端にも、負に帯電したシアル酸が数多く存 在しているため、最も小さな

pI

ている ^37-40)。AGP の場合も、生理機能発現や自身の安定性の維持に糖鎖が関与

していると考えられているため、これらシアル酸が AGP と生体膜の相互作用 にどのように関与しているのかを明らかにすることは、非常に興味深いことと 思われる。そこで、AGP の糖鎖先端に存在するシアル酸を酵素的にすべて除去 したアシアロ AGP を調製し、PG-membrane との結合性について検討した（Figure 10）。

Figure 10. Effect of sialic acid on the interaction between AGP and PG-membrane at pH4.5

*Significantly different from value of native AGP, p<0.05

0 100

Native Asialo

% Bound AGP

80 * 60 40 20

 その結果、AGP と比較してアシアロ AGP と膜との結合性は有意に低下した。

これは、AGP の糖鎖、特にシアル酸が生体膜との結合を促進する作用を有する 可能性を示唆する。本来、シアル酸は負に帯電しているため、同じく負に帯電 している生体膜とは互いに反発することが予想される。しかし得られた結果は

予想に反し、シアル酸の存在が AGP と生体膜との相互作用に正に作用すると いうものであった。その原因としては、pH4.5 といった緩和な酸性条件下にお ける AGP 分子のプロトン化による正電荷の増加や、それに伴う構造変化を、

シアル酸が促進したためと考えられた。

第 3 節 AGP の構造特性評価

3-1 電荷の影響

 これまでの結果から、AGP は生体膜と静電的相互作用により結合している可 能性が示唆された。その場合、AGP がどのような構造状態をとって生体膜と結 合しているのかを明らかにすることは重要である。そこで、pH4.5において

PG-

及び

PC-membrane

AGP

ペクトル法を用いて、α-ヘリックス含量の指標となる

222nm

Figure 11. Effects of PG- and PC-membrane on the conformational structur e of AGP at pH4.5

(A) Far UV CD spectra of AGP in the absence (solid line) or presence (dashed line) of PG- membrane at pH4.5 and (B) -[θ] at 222nm of AGP interacting with PG (■) - a n d P C (●) -

membrane.

- [θ ] x 10-3

at 222nm (deg·cm

2·dmol-1)

4 14

0 60

PG-membrane

PC-membrane

[Phospholipid] / [AGP]

12 10 8 6

20 40

-20 -10 0 10

200 250

Wavelength (nm)

[θ ] x 10-3

(deg·cm

2·dmol-1)

(A) (B)

 pH4.5 において、PG-membrane では、その濃度に依存してα

-ヘリックス含量

PC-membrane

-ヘリックス含量の変化は観察されなかった。またデータには示

PG-及び PC-membrane

 ここで観察された静電的相互作用の関与を確認するために、

AGP

PG-

membrane

NaCl

その結果、

NaCl

-ヘリックス含量の減少が観察されたことより、

静電的相互作用の関与が示唆された。また、NaClの濃度が

150mM

AGP

CD

PG

6 14

0 50 100 150

NaCl concentration (mM)

Figure 12. Effect of ionic strength on the conformational structure  of  AGP

(A) Far UV CD spectra of AGP interacting with PG-membrane in the absence (solid line) or presence ( d a s h e d l i n e ) o f N a C l ( 1 5 0 m M ) a n d ( B ) - [θ] a t 2 2 2 n m o f A G P i n t e r a c t i n g w i t h P G - m e m b r a n e i n various concentrations of NaCl.

10 12

8

- [θ ] x 10-3

at 222nm (deg·cm

2·dmol-1)

-20 -10 0 10

200 250

Wavelength (nm)

[θ ] x 10-3

(deg·cm

2·dmol-1)

(A) (B)

3-2 pH

 生体膜と

AGP

このような相互作用が緩和な

pH

pH

AGP

伴ってα-ヘリックス含量の増加が観察された。一方、データには示していない

が、PG 非存在下では、pH の変化に関わらずα

-ヘリックス含量に有意な変化は

pH

PC-membrane

4 14

4.5 6.5

pH

PG-membrane

PC-membrane

Figure 13. Effect of pH on the interactio n between AGP and PG (●) - and PC (■) - membrane

12 10 8 6

5.0 5.5 6.0

- [θ ] x 10-3

at 222nm (deg·cm

2·dmol-1)

 膜タンパク質の膜貫通ドメインの多くが、膜内部（疎水性領域）で疎水相互 作用によりα-ヘリックス構造を形成していることから、AGP と生体膜の相互作 用は、膜への結合からβ→α構造転移という過程を経ており、この構造転移の駆 動力として疎水相互作用が働いていると考えられる。また、この構造転移が

NaCl

示唆された。さらに、AGP と生体膜の相互作用において、両者の結合過程が律 速であり、そこに緩やかな

pH

 また、PG-membrane との相互作用によるα

-ヘリックス含量の増加は、このよ

AGP

pH4.5

Figure 14(A)）と

AGP

PC-membrane

特殊な構造変化による

AGP

-10 0 10

200 250

-100 0 100

250 350

Wavelength (nm) Wavelength (nm)

[θ] (deg・cm2・dmol-1) [θ]×10-3 (deg・cm2・dmol-1)

Figure 14. The far-(A) and near-(B) UV CD spectra of AGP at pH7.4 (solid line) and 4.5 (dashed line)

(A) (B)

3-3 シアル酸の影響

 リポソームと

AGP

このようなシアル酸の作用が、生体膜との相互作用における構造特性の変化に どのような影響を及ぼすかについて、PG-membrane との相互作用によるβ→α構

造転移を

CD

 その結果、アシアロ

AGP

AGP

1）アシア

AGP

AGP

アシアロ

AGP

AGP

AGP

AGP

AGP

4 14

0 60

[PG] / [AGP]

12 10 8 6

20 40

- [θ ] x 10-3

at 222nm (deg·cm

2·dmol-1)

AGP

asialo AGP

Figure 15. Effect of sialic acid on the conformational structure of native (■) and asialo (●) AGP interacting with PG-membrane at pH4.5

第

4

生体膜との相互作用による

AGP

pH7.4〜4.5、PG-membrane

AGP

pH

クス含量に対してプロットした（

Figure 16）。その結果、生体膜との相互作用

AGP

Figure 16）。また結果には示

pH7.4〜4.5

Figure 16. Correlation between 

binding of progesterone and

contents of AGP interacting with PG-membrane at various pHs

60 70 80 90 100

6 7 8 9 10 11 12 13

-[θ] x 10-3 at 222nm (deg·cm

·dmol

)

Progesterone bound to AGP (%)

第

5

5-1 トリプトファン（Trp）残基の蛍光スペクトル

 これまでの結果から、AGP は生体膜と結合しα-ヘリックス構造を形成するこ とが示唆されたが、果たして

AGP

当と思われる。そこで、PG-membrane 存在または非存在下、蛍光スペクトル法 を用いて

AGP

Trp

Trp

 その結果、PG-membrane存在下、AGP分子の

Trp

Trp

0.8 1 1.2

335 340 345

PG+NaCl none PG

Fluorescence intensity (arbitrary unit)

Wavelength (nm)

Figure 17. Effect of PG-membrane on Trp fluorescence intensity of AGP

Each symbol represents fluorescence intensity and λmax of AGP at pH4.5 (▲), pH4.5 + PG (●) and pH4.5 + PG + NaCl (150mM) (■) respectively.

5-2 組換え型 AGP

Trp

Trp

Trp122、 Trp160）のいずれかが膜内部に存在することが示唆された。

どの

Trp

位の解明にもつながるものと思われる。その場合、一般的には発現系を用いて

Trp

AGP

pPIC9

8.0 kb

5'AOX1 3'AOX1 (TT)

HIS4

3'AOX1 ColE1

Ampicillin

-factor s.s

Bgl II

Bgl II

AGP cDNA

Xho I EcoR I

Linearization wtih Bgl II

Pichia genome (HIS

) Pichia genome (his4)

Figure 18. Expression construct for the recombinant AGP (rAGP)

in Pichia pastoris (GS115)

 そこで、異種タンパク質発現宿主として、多くの組換え型タンパク質発現系 に用いられている、メタノール資化酵母である

Pichia pastoris（GS115

AGP（rAGP）の発現系を構築した

pPIC9

1（AOX1）プロモーター及びシグナル配列（

factor）の下流に AGP cDNA

rAGP

分泌機構により、培地中に効率よく分泌されるように構築した。この発現ベク ターを制限酵素サイト

Bgl II

メタノール資化能を有する

Pichia pastoris

DNA

single crossover

 形質転換体の大量培養は、まず

1L

BMGY

1% yeast extract, 2%

polypepton, 100mM potassium phosphate (pH6.0), 1.34% yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids, 4 x 10

% biotin, 1% glycerol）（growth phase）

で培養を行い、その後、発現誘導炭素源であるメタノールを含む

1L

BMMY

yeast nitrogen base with ammonium sulfate without amino acids, 4 x 10

% biotin, 1%

methanol）（induction phase）へと培地を交換し、96

rAGP

1%となるようにメタ

 組換え体の精製は、遠心分離（6,000 x g, 10min, 4°C）により菌を分離後、培

地上清を

65%硫酸アンモニウム分画（pH4.0）で濃縮・粗精製を行い、その後、

陰イオン交換、ゲルろ過クロマトグラフィーに付し、透析、凍結乾燥を経て、

最終的に

rAGP

 Figure 19 (A) には、得られた

rAGP

AGP

（hAGP）と比較して、rAGP では分子量の低下が観察された。

hAGP

は

N-結合型糖鎖が五本存在しており、そのどれも複合型糖鎖と呼ばれるもので

あるが、酵母の場合すべて高マンノース型糖鎖と呼ばれるマンノースに富んだ 糖鎖が付加される。一般に、高マンノース型糖鎖の一本当たりの分子量は複合 型糖鎖のそれより小さい。そのため、このような組換え型での分子量の低下は、

酵母で付加された糖鎖含量の低下によると考えられた。また、

rAGP

AGP

(A) (B)

20.1 30 45 66 97

1 2 1 2

KDa

Figure 19. SDS-PAGE (A) and Western blotting (B) of hAGP (lane 1) and rAGP (lane 2)

 それでは、なぜ分子量の異なる複数のバンドが出現したのであろうか。原因 として、次のことが考えられる。

1）発現-分泌過程において何らかの原因でペ

AGP

AGP

C

SMD1168

C

rAGP

rAGP

2）につい

glycopeptidase F

rAGP

 GPF で糖鎖をすべて除去すると、hAGP と

rAGP

hAGP

AGP

また、データには示していないが、糖鎖結合アミノ酸である

Asn

ージコロニー刺激因子を

Pichia

KDa

20.1 30 45 66 97

1 2

Figure 20. SDS-PAGE of hAGP (lane 1) and rAGP (lane 2) treated with glycopeptidase F

5-3 組換え型 AGP

 hAGP と異なる

rAGP

CD

Trp

AGP

Figure 21(A)の遠紫外領域の CD

rAGP

に有意な差は観察されなかった。これは、

rAGP

hAGP

Trp

rAGP

hAGP

Trp

AGP

Trp

AGP