非結核性抗酸菌の血清型分布と
糖ペプチド脂質の構造
The diversity of serotype−specific glycopeptidolipids from Mptcobacterium avium−intracellulare complex isolated from patients麗加祐永伸
田郷本原田
畑古山藤前
奈1・2）・久場川 る奈樹高二
七小中水
谷林
野PO 2
ヨ ヨ ユ紀太子崇子
美
早竜貴 津
1．緒 言 Mycobαcteriumαvium−intrαcellulαre complex（MAC）はヒトや動物 に感染する呼吸器系疾患、非結核性抗酸菌症の主要起因菌である。抗酸菌 は脂質画分に富み、MAC菌は細胞表面に抗原性をもつ特徴的な糖ペプチ ド脂質（glycopeptidolipid， GPL）（Fig．1）を産生する。全てのGPLは N−acylated tetrapeptide−amino alcoholのC末端に3，4−di−0−methyl rhamnose， D一αllo−threonineに6−deoxy−taloseを付加したコア部分を有 している。さらに6−deoxy−taloseからグリコシド結合により糖鎖が伸長 し、この糖鎖（oligosaccharide， OSE）の構造によって菌種特異的な血清 型が規定されている。現在、OSEの構造に基づいて31種類の血清型が 報告されており、そのうち16種類のGPL構造が明らかにされてい 1＞相愛大学人間発達学部発達栄養学科 2＞大阪市立大学大学院医学研究科細菌学分野 3＞カネ美食品株式会社 4＞アイビス株式会社 5）株式会社MBR 6）結核予防会結核研究所抗酸菌リファレンス部Schematic representation of the mycobacterial cell wall Glycopeptidolipid
繍 ⑳
Trehalose 6，6’一dimycolate E1i1yili co−Ppidl％flSS’ ge ceE waii proteins Arabinogalactan Peptidoglycan Plasma membrane Chatterjee D， Khoo KH．Cell Mol Life ＄ci． 2001 Dec；58（G4）：2018−42． Review． Q D−Phe−D−alloThr−D−Ala−L−alaninol矯樫灘警無ha
慧肋
Fig． 1 Structure of glycopeptidolipids （GPL） る1−3）。また、ヒトからの分離頻度には偏りがあり、特にエイズ患者では 4型菌が最も多く、次いで8型、1型と報告されている4・5）。本研究では、 日本国内の臨床分離株MAC 94株についてGPLを抽出し、薄層クロマ トグラフィー（TLC）及び質量分析（MALDI−TOFIMS）により、MAC 血清型の同定と、その偏在性について検討した。 2．方 法 ①菌の培養 ヒト臨床分離株M．αvium 94株を7H、、プレートで37℃、2週間培養し合田・久場川・古郷・森谷・山本・小林・藤原・中・前田・水野 た。 ②GPLの抽出・精製 定常期に達した群体を6mlのchloroformlmethanol（2：1， by vol．） が入ったねじ口試験管に回収し、15分間超音波破砕した。2mlのH、0 を加え二層分配し、有機層を回収・濃縮して総脂質画分を得た。乾固後、 02MNaO且1methanol、2．5 mlを加え、37℃、16時間、弱アルカリ加 水分解した。6．O M HCl 83μ1で酸性化し、 chloroform／methanol（2：1， by voL）、 H，0を加えて二層分配し、 GPLを含む有機層をアルカリ安定 脂質として得た。これらを乾固し、acetone 2 mlを加えリン脂質等を沈 澱化させて除去した。chloroformlmethanol（95：5， by vol．）1mlで平 衡化したSep−Pakカラム（Waters）にアルカリ安定脂質画分を添加し た。chlorofbrmlmethano1（95：5， by vol．）1mlで洗浄・し、 chlorofbrml methanol（1：1， by vol．）1mlで溶出して最終的にGPL非分を得た。
③G肌のTLC分析
前項で得られた臨床分離株のGPL士分と血清型既知GPLをTLCに スポットし、展開溶媒（Chloroform：methanol：H、0160：16：2， by voL）で45分間展開した。20％H、SO／ethanolを噴霧し、180℃、3分間 加熱して黄褐色に発色したGPLスポットの移動度を血清型既知GPLと 比較して血清型を分析した。 ④MA：LDI−TOF！MSによるGPLの分子量検定 展開したTLCからGPLスポット部分のシリカゲルを掻きとり、chlo− rofommlmethanol（2：1， by voL）で溶出した。遠心分離によりシリカゲ ルを除去し、上清を濃縮乾固した。GPL濃：薄明1μレ20μ1をターゲット プレートにスポットし、さらにmatrixとして10 mg／mlの2，5− dihydroxybenzoic acidを1μ1添加した。 MALDI−TOF／MS（Ultra且ex II， Brucker Daltonics）により分子量を検定した。3．結果及び考察 臨床分離株94株から抽出したGPL画分と血清型1、4、7、8、12、 16、17型GPLをTLCで展開した。臨床分離株由来GPLの移動度を血 清型既知のGPLと比較すると、1型GPLと同じものが11株、4型GPL と同じものが17株、8型GPLと同じものが10株、12型GPLと同じも のが3株、16型GPLと同じものが3株、血清型不明のものが46株、 GPL の検出できなかったものが4株あった（Fig．2）。血清型1、4、8、12、16 型GPLのTI．Cにおける移動度が特徴的であり、血清型GPI．の同定が 可能であった。 各移動度の同じGPLのスポットのうち産生量が明瞭で代表的な臨床分 離株GPLについてMALDI−TOFIMSを利用した質量分析を中心に構造 を解析し、血清型を確認した。Fig．3には血清型既知GPLの検出質量数 を示した。本研究で得られた臨床分離株のGPLスポットの検出質量数に は、血清型既知GPLに相当する質量数が検出され、それに基づいて臨床 分離株の血清型を同定した。1型GPLに特徴的な質量数は1372、4型
GPLでは1694、7型GPLでは1897、8型GPLでは1649、12型GPL
Eoooooevooov gvoo oooooooouooooo agooovooeooogyeoegooeお 笛 あ 1 9 の の の Φ Φ qo のSero l ＄efo 4 Sero 8 Sero f2 Seio a6
Fig． 2 TLC patterns of predominant MAC serotypes isolated ftrom patients合田・久場川・古郷・森谷・山本・小林・藤原・中・前田・水野 Ser・1〔亙画〕 で Sero 8 〔圃 i589．946 Ser・4 〔画 て ア Ser・12〔亙画 f75e a869．012 で マ ギ ・…1
㎜T
ねヨ コり り「［
1943．035 a927．043 1999．205 2e27．233 2041：MJ
一ド「 ｇｏｏ目@で650 1細S…17〔璽
1歯。 1909．歪51 1881．136準
rt i i i’， T． i950 Fig． 3 MALDI−TOF MS spectra t900 1950では1911、13型GPLでは1897、16型GPLでは1969、17型GPLで
は1925であった。 したがって、本研究で得られた臨床分離株の質量数と比較して考える と、今回質量分析を行った臨床分離株94株において、No．12、13、15、 17、27、28、29、31、37、38、39は1型、1、4、7、25、32、44、47、 49、50、51、53、58、61、71、72、77、78は4型、2、3、30、33、 40、42、69、79、81、93は8型、19、63、64は12型、65、86、94は 16型、その他は血清型不明またはGPLが検出されなかった。これらの 結果は、TLCでの移動度の比較による血清型の同定と同じであり、全て の臨床分離株の血清型を確定できた。Table 1 ’cistribution of MAC serotypes isolated from 94 patients
Serotype Numbers of isolates o／o
1 4 7 8 12 ． 16 17 unknown 11 P7 黷P033一50 9臼只︶ −i⊥ −∩03 1 53 To七a1 94 非結核性抗酸菌MACの血清型分布は、．過去の報告では4型が最多で 次いで8型、1型となっているが5）、本研究で実施した94株のMAC株 の解析でも、4型が最も多く、次いで1型、8型であり、12型、16型も ．検出された（Table 1）。血清型GPLのスポットは存在するが、現状では ．同定できない株、またGPLスポットの脱落した株も散見された。 今後はこれら血清型の偏在性が宿主病原性に関連していること、則ち血 清型特異GPLによる宿主応答の差異について検証し、血清型によるMAC 菌の病原性の違いを明らかにしたい。 参考文献 1 ） Chatterjee， D．， and K H． Khoo． 2001． The’surfaee glycopeptidolipids of mycobacteria ： structures and biological proPerties． Cell Mol． Life Sci． 58： 2018−2042． 2） Fujiwara， N．， N． Nakata， S． Maeda， T． Naka， M． Doe， 1． Yano， and K． Kobayashi． 2007． Structural characterization of a specific glycopepti− dolipid． containing a novel N−acyl−deoxy sugar from Mycobacterium intracellulare serotype 7 and ’genetic analysis of its glycosylation pathway． J． Bacteriol． 189： 1099−1108． 3） Fujiwara， N．， N． Nakata， T． Naka， 1． Yano， M． Doe， D． Chatterjee， M． McNeil， P． J． Brennan， K． Kobayashi， M． Makino， S． Matsumoto， H． Ogura， and S． Maeda． 2008． Structural analysis and biosynthesis gene cluster of an antigenic glycopeptidolipid from Mycobacterium in一
合田・久場川・古郷・森谷・山本・小林・藤原・中・前田・水野 4） 5） tracellulare． J． Bacteriol． 190 ： 3613−3621． Torrelles， J． B．， D． Chatteniee， J． G． Lonca， J． M． Manterola， V． R． Ausina， and P． J． Brennan． 2000． Serovars of Mblcobacterium avium complex isolated from AIDS and non−AIDS patients in Spain． J Appl Microbiol 88： 266−79． Tsang， A． Y．， J． C． Denner， P． J． Brennan， and J． K McClatchy． 1992． Clinical and epidemiological importance of typing of Mycobacterium avium complex isolates． 」． Clin． Microbiol． 30 ： 479−484．
