博 士 （ 生 命 科 学 ） 小 倉 次 郎
学 位 論 文 題 名
小腸虚血再灌流によるABC トランスポー夕発現変動に 関する研究
学位論文内容の要旨
虚血 再 湛流(Ischemia‑reperfusion; I/R)は1985年McCordら によ り提 唱された概念で あ り、 一 過性 の虚 血状 態の後、 血流が回復する状態である。 小腸でのI/Rは小腸移植、壊 死 性腸 炎 、絞 扼性 イレ ウスなど 様々な疾患及び治療時に見ら れる。小腸I/Rが生じると多 量の 活性酸素が産生され、小腸粘 膜のバリア機能が障害され る。小腸粘膜のバルア機能の 障害 は小腸内腔からの細菌、内毒 素などの生体外異物の侵入 を容易にし、炎症性サイトカ イン の放出、アラキドン酸カスケ ードの亢進などの炎症反応を全身で惹起する。このため、
小 腸I/Rに よる 障 害は 虚血臓器で ある小腸に留まらず、肝臓 、腎臓、肺などの遠隔臓器へ と拡 散し、多臓器不全に発展する 。小腸、肝臓、腎臓は薬物 の吸収、代謝、排泄を担い、
薬 物の 体 内動 態に 影響 を及ぼす 重要な臓器である。小腸I/R後にはこれら臓器が障害を受 ける ことから、薬物の体内動態が 変動すると予想される。これまでに、アルベンダゾール、
ジ ルチ ア ゼム 、ア ンチ ピリン、 夕クロリムスなどの体内動態 が小腸I/Rにより変動するこ と が報 告 され てい る。 当研究室 においても、小腸I/Rによる ジゴキシンの体内動態変動を 見出 している。薬物卜ランスポ一 夕は薬物の各臓器への取り 込み、体外への排泄を行う輸 送 担体 で あり 、薬 物の 体 内動 態の 変動 に深 く 関わ って いる 。中 で もABCトランスポータ は広 範な基質認識性を有し、様々 な臓器に発現することから 薬物動態を規定する重要なフ ァミ リーである。薬物トランスポ 一夕の発現量は疾患により 大きく変動することから、病 態時 の薬物トランスポータに関す る知見は適正かつ安全な薬 物治療を施行する上で有用で あ る 。 そ こで 本研 究 では 、小 腸I/Rに よるABCトラ ンス ポ ー夕 発現 変動 およ び その 変動 機構 について解析した。
1）小 腸I/Rに よるABC卜ラ ンス ポ一 夕 発現 変動
初め に 、本 研究 で用いた小腸I/Rモデルラットの小腸、肝臓 、腎臓の障害を確認した。
小 腸組 織 切片 を観 察し たと こ ろI/R1h後に 絨毛 の脱 落が 見 られ た。 また、肝臓と腎臓の 障 害に 対 する マー カー を測 定 した とこ ろ、 肝障 害 の指 標で ある 血 漿中ASTレベルがI/R1 h後 に 、 血 漿 中ALTレ ベ ル がI/R 1‑6h後 に 上 昇 し た 。 ま た 、 腎 障 害 の 指 標 で あ るBUN はI/R 1‑6h後 に上 昇した。以上の ことから、作成した小腸I/Rモデルラットは虚血臓器で あ る小 腸 に加 え、 遠隔 臓器 で ある 肝臓 、腎 臓にも障害を生じ ていることが確認された。
続 い て 、作 成し た 小腸I/Rモ デ ルラ ット のABCト ラン スポ ー 夕発 現量 を検 討 した 。そ の 結 果 、P‑gp発現 量 は回 腸に おい てI/R6h後に 、 腎臓 にお いてI/R 24h後に 減 少し た。
Mrp2発 現 量 は 空 腸 お よ び 肝 臓 に おい てI/R6h後に 減少 して い た。P‑gp、Mrp2発現 量の 減 少 はmRNA量 の減 少 を伴 って おり 、転 写 抑制 に起 因し てい る こと が考 えら れ た。Bcrp 発 現量 は 回腸 にお いてI/R1h後 に細 胞 膜上 の発 現量 が減 少 した 。し かしながら、この減 少 はmRNA量の 減少 や タン パク 質発 現量 の 減少 に依 存せ ず、Bcrpの 細胞 膜移 行 の抑 制に 起 因し て いる と考 えら れた 。
2）小腸I/RによるMrp2発現変 動と核内受容体
核内受容体は病態時の薬物 卜ランスポータの発現制御に 関わる因子として注目されてい ‑ 383―
る 。MRP2の 転 写 に は 核 内 受 容 体 で あ るFXR、PXR、CARの 関 与 が 明 ら か と さ れ て お り 、 こ れ ら 核 内 受 容 体 が 小 腸I/Rに よ り 何 ら か の 影 響 を 受 け て い る と 考 え ら れ る。 そ こ で 、 小 腸I/R後 の 核 内 受 容 体 発 現 量 を 検 討 し た 。 肝 臓 に お け るFxr、Pxr、CarのmRNA量 、 夕 ン パ ク 質 発 現 量 お よ び 核 内 移 行 量 はMrp2と 同 様 、I/R6h後 に 著 し く 減 少 し て いた 。 一 方 、 空 腸 に お い て はI/R6h後 にFxr、Pxr、CarのmRNA量 、 夕 ン パ ク 質 発 現 量 お よ び 核 内 移 行 量 は 減 少 せ ず 、 空 腸Mrp2発 現 量 の 減 少 と 一 致 し た 時 間 推 移 で の 変 動 は 見 ら れ な か っ た 。 以 上 の こ と か ら 、 小 腸I/R後 のMrp2発 現 量 の 減 少 は 空 腸 と 肝 臓 で 異 な る メ カ ニ ズ ム に よ り 生 じ る と 推 察 さ れ た 。 こ の う ち 、 肝 臓 に お け るFxr、Pxr、Carの 減 少 に 起 因 し た Mrp2発 現 量 の 減 少 はIL‑6の 増 加 と 一 致 し た 時 間 推 移 で 生 じ て い た 。 さ ら に 、in vitroの 検 討 か ら 、IL‑6添 加 に よ りFXR、PXR、CARの 減 少 を 伴 うMRP2発 現 量 の 減 少 が 生 じ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 以 上 の こ と か ら 、 肝Mrp2発 現 量 の 減 少 はIL‑6に よ り 生 じ る と 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 空 腸Mrp2発 現 量 の 減 少 は 酸 化 障 害 と 指 標 で あ るMDA量 の 増 加 と 一 致 し た 時 間 推 移 で 生 じ て い た 。 さ ら に 、in vitroの 検討 か ら 、 活 性酸 素 の 一 種 であ る 過 酸 化 水 素 に よ りMRP2発 現 量 が 減 少 し た 。 以 上 の こ と か ら 、 空 腸Mrp2発 現 量 の 減 少 は 活 性 酸 素 に よ り 生 じ る と 推 察 さ れ た 。 し か し な が ら 、 活 性 酸 素 に よ るMrp2/MRP2発 現 減 少 メ カ ニ ズ ム に つ い て はNf‑iくb/NF‑KBの活 性 化 を 介 して い な い こ と が明 ら か と な った も の の 、 そ の 詳 細 は 未 だ 不 明 で あ る 。 活 性 酸 素 はI/Rの み な ら ず 加 齢 、 喫 煙 、 糖 尿 病 、癌 な ど 多 く の 病 態 で 過 剰 な 産 生 が 生 じ る が 、 薬 物 ト ラ ン ス ポ 一 夕発 現 変 動 に 関す る 詳 細 な 検討 は 行 わ れ て お ら ず 、 今 後 、 発 現 変 動 メ カ ニ ズ ム の 更 な る 解 明 が 求 め ら れ る 。
3） 小 腸I/R後 の 回 腸Bcrpジ ス ル フ ィ ド 結 合 形 成
BCRPは ハ ー フ 卜 ラ ン ス ポ ー タ と 呼 ば れ て お り 、 多 く のABCト ラ ン ス ポ ー タ が2つ の ATPase siteを 持 つ12回 膜 貫 通 型 夕 ン バ ク 質 で あ る の に 対 し、BCRPは1つ の パI丶Pase site を 持 つ6回 膜 貫 通 型 夕 ン パ ク 質 で あ る 。 こ の た め 、BCRPは タ ン パ ク 質 中 の603番 目 の シ ス テ イ ン 残 基 に 特 徴 的 なS‑S bondを 形 成 し 、 ホ モ ダ イ マ ー と し て 機 能 し て い る 。 このS‑S bondはBCRPの 細 胞 膜 局 在 と 関 連 し て お り 、S‑S bond形 成 が 行 わ れ な い 場 合 、BCRPは 細 胞 膜 上 に 移 行 し な い 。 そ こ で 、 小 腸I/R後 のBcrp S‑S bond形 成 を 評価 す る こ と とし た 。 そ の 結 果 、 小 腸I/R後 のBcrp S‑S bond形 成 は 細 胞 膜 移 行 の 抑 制 に 寄 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、BcrpのS‑S bond形 成 抑 制 メ カ ニ ズ ム に つ い てin vitroで 詳 細 に 検 討 し 、 キ サ ン チ ン オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 化 に よ る 活 性 酸 素 産 生 がBCRP S‑S bond形 成 を 抑 制 す る こ と を 見 出 し た 。 さ ら に 、 活 性 酸 素 産 生 時 に ミ 卜 コン ド ル ア 機 能障 害 が 生 じ る こと に 着 目 し 、 電 子 伝 達 系 阻 害 時 のBCRP S‑S bond形 成 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 ミ ト コ ン ド ル ア 機 能 障 害 時 に はBCRP S‑S bond形 成 が 抑 制 さ れ 、 細 胞 膜 移 行 が 抑 制 さ れ る こ と を 見 出 し た 。 以 上 の こ と か ら 、 小 腸I/R後 のBcrp S‑S bond形 成 の 抑 制 は 産 生 さ れ た 活 性 酸 素 が ミ ト コ ン ド ル ア 機 能 障 害 を 誘 導 す る こ と で 生 じ る と 示 唆さ れ た 。 さ らに 、 ミ ト コ ン ドリ ア の 電 子 伝 達 系 に 関 連 す るFAD、NADPがBCRPのS‑S bond形 成 に 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。
以 上 、 本 研 究 に よ り 得 ら れ た 知 見 が 小 腸I/Rに よ る 薬 物 の 体 内 動 態変 動 の 解 明 の一 助 と な り 、 小 腸I/R後 の 適 正 か つ 安 全 な 薬 物 治 療 の 施 行 に 貢 献 で き る こ と を 期 待 す る 。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 井 関 健 副 査 教 授 菅 原 満 副査 准教授 武隈 洋 副査 准教授 山口浩明
学 位 論 文 題 名
小腸虚血再灌流によるABC トランスポー夕発現変動に 関する研究
小 腸 I/R は 臨 床 現 場 の 様 々 な 場 面 で 見 ら れ る 現 象で、 酸化 障害 、炎 症性 反応 を 生 じ 、 多 臓 器 不 全を 引き 起こ す。 しか し、 薬物 の体内 動態 に関 与す る種 々の ト ラ ン ス ポ ー タ の 発 現 量 に つ い て 、遠 隔 臓 器 を 含 めた 小腸 I/R 後 の各 臓器 で、
そ の変 動機 構を検 討し た例 はな ぃ。
本 論 文 は ， 薬 物 卜ラ ンス ポー タの 中で も薬 物の 体内動 態へ の影 響が 大き く、
適 正 か っ 安 全 な 薬 物 治 療 を 行 う 上 で 重 要 な ABC 卜ラ ン ス ポ ー タ に 着 目 し 、 小 腸 I/R 後の 発 現 変 動 お よ ぴ その 変動 機構 につ いて 検討 し， 小腸 I/R 後 の薬 物治 療 を 最 適 化 す る た め の 有 益 な 知 見 を 得 る こ と を 目 的 と し た も の で あ る 。 第 1 章 で は 小 腸 I/R モ デ ル ラ ッ 卜 を 用 い 、 代 表 的 な ABC ト ラ ン ス ポ ー タ で あ る P‑gp 、 Mrp2 、 Bcrp 発 現 量 に っ い て 、 虚 血 臓 器 で あ る 小 腸 、 遠 隔 臓 器 で あ る 肝 臓 、 腎 臓 で 検 討 し 、 空 腸 の Mrp2 、 回 腸 の P‑gp 、 Bcrp 、 肝 臓 の Mrp2 、 腎 臓 の P‑gp 発 現 量 が そ れ ぞ れ 減 少 す る こ と を 明 ら か に し て い る 。 第 2 章 で は 小 腸 I/R 後 の Mrp2 発 現 変 動 機 構 に っ い て 核 内 受 容 体 に 着 目 し 、 小 腸 I/R 後 の Fxr 、 Pxr 、 Car の 変 動 は 空 腸 と 肝 臓 で 異 な り 、 空 腸 で は 活 性 酸 素 に よ る 酸 化 障 害 が 、 肝 臓 で は IL‑6 に よ る 炎 症 性 反 応 が Mrp2 発 現 量 の 減 少 に 関与 する ことを 明ら かに して いる 。
第 3 章 で は 小 腸 I/R 後 の Bcrp 発 現 変 動 機 構 に っ い て BCRP に 特 徴 的 な S‑S bond 形 成 に 着 目 し て 検 討 し 、 小 腸 I/R 後 の Bcrp 細胞 膜 移 行 の 抑 制 は S‑S bond 形 成 の 抑 制 に 起 因 して いる こと を明 らか にし てい る。さ らに 、in vitro で の検 討 結 果 か ら 、 小 腸 I/R 後 の Bcrp S‑S bond 形 成 の 抑制 は 産 生 さ れ た 活 性 酸 素 が ミ ト コ ン ド リ ア 機 能 障 害 を 誘 導 す る こ と で 生 じ て い る こ と を 見 い だ し た 。 以 上 の 知 見 は 、 小 腸 I/R 後 の 薬 物 ト ラ ン ス ポ ー タ発現 変動 およ びそ の発 現変 動 機 構 に つ い て 遠 隔 臓 器 も 含 め て 検討 し た 初 の 知 見で あり 、小 腸I/R 後の 適正 か っ 安 全 な 薬 物 治 療 を 施 行 す る 上 で 有 用 な 情 報 と な り 得 る 。 よっ て著 者は， 北海 道大 学博 士（ 生命 科学）の学位を授与される資格あるもの と 認め る。
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