博 士 （ 農 学 ） 稲 場 純 一
学 位 論 文 題 名
Analysis of the mechanism for host gene regulation by the く 1 ′ 銘 C 勿 ケ 髭 ろ ピダ 7nosazc ぴ i7‑iits 2b protein
(Cucumber mosaC ぴ Z 〆甜 S2b 夕ン ノ弋ク質 による 宿 主 遺 伝 子 発 現 調 節 機 構 の 解 析 ）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
Cucumber mosaic virus (CMV)は3分 節 ゲ ノ ム 構 造 を 持 つRNAウ イ ル ス で 幅 広 い宿 主範 囲 を 持 つ 。 本 研 究 で はCMVを 改 変 し た ウ イ ル ス ベ ク タ ー を 用 い て 宿 主 遺 伝 子 の 転 写抑 制の 誘 導やCMV感染と宿主との相互作用につ いて研究を行った。
(1) Cucumber mosaic virusベクターを用いた内 在性遺伝子を標的としたtranscriptional gene silencing (TGS)の誘導
近年、small interfering RNA (siRNA)bミ遺伝子の転写抑制を引き起こす、transcriptional gene silencing (TGS)に つ い て 多 く の 研 究 が な さ れ 、siRNAを 介 し て 生 じ るDNA methylationと histone modificationの変 化 が引 き金 とな り、 遺伝子の転写が抑えられるこ とが明らかとなっ て い る 。 本 研 究 で はCMVを 改 変 し た ウ イ ル ス ベ ク タ ー(Alベ ク タ ー ） に ペ チ ュ ニ ア の chalcone synthase (CHS)遺 伝 子 のpromoter領 域 を 挿 入 し たAl‑CHSproを 用 い てCHS遺 伝 子 を 標 的 と し たTGSの 誘 導 を 試 み た 。 こ れ ま で に 植 物 に 対 し 人 為 的 に 内 在 性 遺 伝子 を標 的 と し たTGSを 誘 導 す る と い う 研 究 は 多 く の 論 文 で 試 み ら れ て き た が 、 ウ イ ル ス ベク ター を 用 い て の 内 在 性 遺 伝 子 を 標 的 と し たTGSの 誘 導 が 成 功 し た 事 例 は 報 告 さ れ て い な い 。 Al‑CHSpro接 種 当 代 で は 、 花 弁 に 細 か な 白 い 斑 点 が 現れ 花粉 の稔 性 が低 下し た。Real‑time RT‐PCRに よ りA1．CHSpro接 種 当 代 の 花 弁 で のa硲 遺 伝 子 のmRNA蓄 積 量 はA1接 種 個 体 に 比 べ 、 大 き く 減 少 し て い た 。 こ の 時Al―CHSpro接 種当 代 ではTGSの引 き金 とな る、siRNA も 検 出 さ れ て い る 。 ま たA1−CHSpro接 種 当 代 の 花 弁 のaおpromoter領 域 で はDNA memylationとhistonemodiflcationの変化が観察 された。さらに、A1．CHSpro´が存在しなぃ、
A1−CHSpro接 種 後 代 の 花 弁 で も 同 様 の 白 い 斑 点 が 観 察 さ れ 、a拇 遺 伝 子 のmRNAの 低 下 が 確 認 さ れ た 。 こ の 個 体 の 花 弁 で は 、aおpromoter領 域 に お い てDNAmethylationとhistone modiflcationの変 化 が生 じて いる こと が 明ら かと なっ た。 こ れら の結 果か ら 、A1−CHSproの 接 種 に よ り 、aむ 遺 伝 子 に 対 し 、 後 代 へ と 遺 伝 す るTGSの 誘 導 が 可 能 で あ る こ と が 明 ら か となった 。
(2) Arabidopsis thaliana における、CMV 2b によるゲノムレベルでのDNA methylation と
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histone modificationの変化
多 く の 真 核生 物 では ストレ スシグ ナルに 反応しDNA methylationやHistone modificationな どのepigenetic modificationを 通して 遺伝子 の発現 を制御 していることが知られている。また Arabidopsisに お い て も 、 塩 害 、 寒 さ 、 熱 と い っ た ス ト レ ス に よル ゲ ノ ム レベ ル で のDNA methylationが 誘 導 され る こ と がわ か っ て いる 。 本 研 究で は こ れ らの ス ト レ スと 同 様 にCMV の感染 がArabidopsisにおい てゲノム レベル でのepigenetic modificationを 誘導す るか解析し た 。そ の 結 果 、CMVの 感 染 によ り 、DNA methylationの上 昇とHistone modificationの変 化が ゲ ノ ム レ ベ ル で 生 じ て い る こ と が 示 さ れ た 。 ま たCMV 2bを 組 み 込ん だ 形 質 転換 体 に お い て も同 様 の 反 応が 観 察 さ れた こ と か ら、2b依 存的 に ゲ ノ ムレ ベ ル でのDNA methylationの 上 昇とHistone modificationの変化が生じる、と考えられる。またtiling arrayを用いた解析により、
2bによ るepigenetic modificationの 変 化 は 特にCMVの 抵 抗 性に 関 わ る 遺伝 子 の 発 現を 抑 制 す る こ と が 示 さ れ た 。 っ ま り 、CMVの感 染 に よ って 生 じ た 、ゲ ノ ム レ ベル で のepigenetic modificationの 変 化 は植 物 が ス トレ ス に 適 応す る た め に誘 導 し た のでは なく、CMVが自 身の 複製に適した条件を作り出すために誘導したと考えられる。
(3) Arabidopsisにおけ る、CMV 2bに よる開 花促進
植物 に お い て、 低 肥 料 や乾 燥 と い った 環境ス トレス は春化 処理と 同様に 開花を促 進する こ とが 明らか となっ ている 。しか し、ウイ ノレス 感染に よるス トレス が開花 に影響 するかは明ら か と な っ て い な ぃ 。 本 研 究 ではCMVの 感 染 が与 え る 開 花へ の 影 響 に着 目 し 研 究を 行 っ た 。 そ の 結 果 、CMVの 感 染 は 開 花 を 促 進 し 、 そ の 反 応 は2b依 存 的 な も の で あ る こ と が 示さ れ た 。 ま た2bに よ る 開 花 促 進 は 開 花 を 抑 制 す るFL〇WERING工 〇CUSC(FLの の 発 現量 の 低 下 が ： 凡C遺 伝子 領 域 内 でのhistonemodinc川0nの 変 化 によ っ て 生 じた た め に 誘導 さ れ た 現象 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 っ ま り 、CMVは2bに よ る 凡CORF領域 内 のhistonemodiflcation の 変 化 を 介 し て 、 凡Cの 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 開 花 を 促 進 す る と 考 え ら れ る 。
(4) CMV 2bと 宿 主 のCatalaseと の タ ン パ ク 質 レ ベ ル で の 結 合 に よ る え そ 病 徴 の 誘 導 現 在 ま で にウ イ ル ス のタ ン パ ク 質と 結 合 す る様 々 な 宿 主因子 が同定 され、 それら の結合 は ウ イル ス の 増 殖や 全 身 移 行に 大 き く 関わ る こ と が報 告 さ れて いる。 こうし たウイ ルス因 子と 宿 主因 子 の結 合が直 接、病 徴の決 定に関 わること を明ら かにし た研究 事例は ごく少 数であ る。
本 研 究 で は 、CMV‑HLの 感 染はArabidopsisに お い てえ そ 病 徴 に関 し てCMV 2bとArabidopsis のCatalase3(CAT3)が 結 合 す る こ と に よ り 生 じ る こ と を 明 ら か に し た 。CMV 2bはCAT3と の 結 合 に よ り 、H202分 解 のkey enzymeで あ るCAT3の 機 能 を 阻 害 し 、 そ の 結果 と し てH202 が 蓄 積 し て 細 胞 死 が 生じ る 。 ま た2bとCAT3と の 結合 は2bのRNA silencing suppressorと し て の 機 能 を わ ず か に 阻 害 す る も の の 、CMVの 増 殖 を 大き く 抑 制 する に 到 ら ない 。 っ ま り2b とCAT3の 結 合 は 宿 主 のCMVに 対 す る 抵 抗 性 反 応 で は な く 、 ウ イ ル ス に よ る 病 徴 誘 導 機 構 と して の 意 味 合い が 強 い と考 え ら れ る。
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
Analysis of the mechanism for host gene regulation by the く、′ ucu7nber 7nosazc vz7‑rts 2b protein
(Cucz,tmber mosazc vints 2b 夕ンノ弋ク質による 宿 主 遺 伝 子 発 現 調 節 機 構 の 解 析 ）
本研究ではCucumber mosaic‑ virus (CMV) を改変したウイルスベクターを用いて の宿 主遺伝 子の 転写 抑制 の誘 導や CMV 感 染と宿主との相互作用にっいて研究を 行った。
(1) CMV ベクターを用いた内在性遺伝子を標的としたtranscriptional gene silencing (TGS) の誘導
近年、small interfering RNA (siRNA) が遺伝子の転写抑制を引き起こす、TGS につ い て 多く の 研 究 が な さ れ 、 siRNA を介 し て 生 じる DNA methylation と histone modification の変化が引き金となることが知られている。本研究ではCMV を改変 したAl ベクターにペチュニアのchalcone synthase (CHS) 遺伝子のpromoter 領域 を 挿 入し た Al‑CHSpro を 用 い て CHS 遺 伝 子 を 標的 とし たTGS の誘 導を 試み た。
Al‑CHSpro 接種 当代 では 、花 弁に細かな白い斑点が現れた。Al‑CHSpro 接種当代 の 花 弁で の CHS 遺 伝 子 の mRNA 蓄 積 量は Al 接 種 個体 に比 べ、 大き く減 少し た。
この 時 Al‑CHSpro 接 種当 代で はTGS の引 き金 とな る、 siRNA も検出された。また Al‑CHSpro 接種 当代 の花 弁の CHS promoter 領 域で はDNA methylation とhistone modification の変化が観察された。さらに、Al‑CHSpro が存在しない、Al‑CHSpro 接種後代の花弁でも同様の形質変化と、CHS 遺伝子のmRNA の低下、CHS promoter 領域でのDNA methylation とhistone modification の変化の維持が確認された。これ らの結果から、Al ベクターを用いることで、後代へと遺伝するTGS の誘導が可能 であることが示された。
(2) Arabidopsis thaliana における、CMV 2b によるゲノムレベルでのDNA methylation 税 郎
章
一
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増 上
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授 授
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教
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とhistone modification の変化
多 く の 真核 生 物で は ス トレ ス シグ ナ ル に反 応 し DNA methylation や histone modification などのepigenetic modification を通して遺伝子の発現を制御されている。
本 研究 では これらの ストレスと 同様に CMV の 感染がArabidopsis に おいてゲ ノム レベルでの epigenetic modification を誘導するか解析した。その結果、CMV の感染 により、 DNA methylation の上昇とhistone modification の変化がゲノムレベルで生 じることが示された。また CMV 2b 形質転換体においても同様の反応が観察された。
またtiling array を用いた解析により、2b によるepigenetic modification の変化は特 に CMV の 抵抗性 に関わる 遺伝子の発 現を抑制 すること が示され た。っま り、 CMV の感染によって生じた、ゲノムレベルでのepigenetic modification の変化はCMV が 自 身 の 複 製 に 適 し た 条 件 を 作 り 出 す た め に 誘 導 し た と 考 え ら れ る 。
(3) Arabidopsis における、 CMV 2b による開花促進
植物において、乾燥などの環境ストレスは春化処理と同様に開花を促進すること が明ら かとなっ ている。 本研究で は CMV の感染が与える開花への影響に着目し研 究 を行 っ た 。そ の 結果 、 CMV の感染は 開花を促 進し、その 反応は 2b 依 存的なも の で あ っ た 。 ま た 2b が 存 在 す る こ と で 開 花 を 抑 制 す る FLOWERING LOCUSC (FLC) の発現量の低下とその遺伝子領域内でのhistone modification の変化が生じる ことが確認された。っまり、 CMV は 2b による FLC ORF 領域内のhistone modification の変化を介して、 FLC の発現を抑制することにより開花を促進すると考えられる。
(4) CMV 2b と宿 主の Catalase とのタンパク質レベルでの結合によるえそ病徴の誘 導
現在までにウイルスのタンパク質と結合する様々な宿主因子が同定されている。
本研 究では、 Arabidopsis において CMV‑HL の感染に より生じる えそ病徴 は、 CMV 2b が Arabidopsis の Catalase3(CAT3) との結合 により、 H202 分解の key enzyme で ある CAT3 の機能を 阻害し、 その結果 としてH202 が蓄 積して生 じること を明らか にし た。っま り 2b と CAT3 の結 合はウイ ルスによる 病徴誘導 機構とし て考えられ る。
よって審査員一同は、稲場純一氏が博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格を 有するものと認めた。
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