博 士 学 位 論 文
内容の要旨及び審査結果の要旨 第 40 号
2016 年３月
京 都 産 業 大 学
本号は，学位規則（昭和 28 年４月１日文部省令第９号）第８条の規定による公表を 目的とし，平成 28 年３月 19 日に本学において博士の学位を授与した者の論文内容の 要旨及び論文審査結果の要旨を収録したものである。
学位番号に付した甲は学位規則第４条第１項によるもの（いわゆる課程博士）であ り，乙は同条第２項によるもの（いわゆる論文博士）である。
は し が き
目 次
課程博士
１．小谷 友理 〔博士（生物工学）〕 ········· １ ２．森 勇伍 〔博士（生物工学）〕 ········· ５ ３． 田 亜佑美 〔博士（生物工学）〕 ········· 11 ４．Ontongオ ン ト ン Pawaredパ ー ワ レ ッ ド
〔博士（生物工学）〕 ········· 17 ５．佐々木 大樹 〔博士（生物工学）〕 ········· 21 ６．Soonthornsitス ン ト ン ス イ ッ ト
Jeerawatジ ー ラ ワ ッ ト
〔博士（生物工学）〕 ········· 27
論文博士
１．上野 信洋 〔博士（生物工学）〕 ········· 31
― 17 ―
氏 名 （ 本 籍 ） Ontongオ ン ト ン Pawaredパ ー ワ レ ッ ド
（タイ）
学 位 の 種 類 博士（生物工学）
学 位 記 番 号 甲工第 23 号
学 位 授 与 年 月 日 平成 28 年３月 19 日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第４条第１項該当
論 文 題 目
Hyaluronan overproduction promotes acquisition of cancer stemness and drives metabolic reprogramming
（ヒアルロン酸の過剰産生はがん幹細胞性の獲得を促進し、代謝 リプログラミングを誘導する）
論 文 審 査 委 員 主 査 板野 直樹 教授
副 査 竹内 実 教授
〃 川根 公樹 教授
論 文 内 容 の 要 旨
T h e c a n c e r s t e m c e l l ( C S C ) m o d e l s u g g e s t s t h a t a s m a l l s u b p o p u l a t i o n o f c a n c e r c e l l s p o s s e s s e s t h e a b i l i t y t o s e l f - r e n e w a n d g i v e r i s e t o m a l i g n a n t p r o g e n y t h a t d r i v e c a n c e r p r o g r e s s i o n . R e c e n t r e p o r t s h a v e a l s o p r o p o s e d t h e e x i s t e n c e o f c e r t a i n e x t r a - o r i n t r a c e l l u l a r s i g n a l s t h a t a l l o w c a n c e r p r o g e n i t o r s t o d y n a m i c a l l y r e v e r t t o a s t e m - c e l l s t a t e . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g c a n c e r c e l l p l a s t i c i t y a n d C S C e x p a n s i o n a r e n o t e n t i r e l y c l e a r . P r e v i o u s s t u d i e s u s i n g a h y a l u r o n a n s y n t h a s e 2 ( H a s 2 ) t r a n s g e n i c m o u s e mo d e l d e m o n s t r a t e d t h a t h y a l u r o n a n o v e r p r o d u c t i o n c a u s e d r a p i d d e v e l o p m e n t o f a g g r e s s i v e b r e a s t c a r c i n o m a a t a h i g h i n c i d e n c e . I n C h a p t e r I , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t h y a l u r o n a n o v e r p r o d u c t i o n m a y a c c e l e r a t e c a n c e r p r o g r e s s i o n b y e x p a n d i n g C S C s u b p o p u l a t i o n s d u r i n g c a n c e r d e v e l o p m e n t . P r i m a r y c a n c e r c e l l s w e r e e s t a b l i s h e d f r o m m a m m a r y t u m o r s d e v e l o p e d i n t h e t r a n s g e n i c m i c e a n d s u b j e c t e d t o t h e H o e c h s t 3 3 3 4 2 d y e e x c l u s i o n a s s a y t o s o r t s i d e p o p u l a t i o n ( S P ) f r o m n o n - s i d e p o p u l a t i o n ( n o n - S P ) c e l l s . F l o w c y t o m e t r i c a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d t h e e n r i c h m e n t o f C D 4 4 h i g h / C D 2 4 l o w C S C - l i k e c e l l s i n t h e S P f r a c t i o n o f h y a l u r o n a n o v e r p r o d u c i n g c a n c e r c e l l s . T h i s s u b p o p u l a t i o n e x h i b i t e d s e v e r a l c h a r a c t e r i s t i c s t h a t
― 18 ―
w e r e s i m i l a r t o C S C s , i n c l u d i n g c a n c e r - i n i t i a t i n g a n d m a m m o s p h e r e - f o r m i n g a b i l i t i e s . E x c e s s h y a l u r o n a n p r o d u c t i o n d r o v e t h e e p i t h e l i a l - t o - m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n ( E M T ) p r o c e s s d e f i n e d a s t h e l o s s o f e p i t h e l i a l p h e n o t y p e s , u p - r e g u l a t i o n o f t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b e t a ( T G F -β ), and ind uc tion o f th e EMT- r e l a t e d t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r s S n a i l a n d T w i s t . I n h i b i t i o n o f T G F -β- S n a i l s i g n a l i n g o r s i l e n c i n g o f T w i s t e x p r e s s i o n a b r o g a t e d t h e e n t r a n c e i n t o a s t e m - c e l l s t a t e . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t h y a l u r o n a n o v e r p r o d u c t i o n a l l o w s p l a s t i c c a n c e r c e l l p o p u l a t i o n s t o r e v e r t t o s t e m - c e l l s t a t e s v i a T w i s t a n d t h e T G F -β- S n a i l s i g n a l i n g a x i s .
L i k e m a n y o t h e r s t e m c e l l s , C S C s p r e d o m i n a n t l y r e l y o n g l y c o l y s i s r a t h e r t h a n m i t o c h o n d r i a l o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n f o r s u r v i v a l . H o w e v e r , l i t t l e i s k n o w n o n h o w m e t a b o l i c r e p r o g r a m m i n g i n C S C s i s c o n t r o l l e d t o o r c h e s t r a t e t h e i r s t e m c e l l - l i k e p r o p e r t i e s . I n C h a p t e r I I , m e t a b o l o m i c a p p r o a c h e s c l e a r l y d i s c l o s e d a m e t a b o l i c s h i f t t o w a r d a e r o b i c g l y c o l y s i s a n d a c c e l e r a t i o n o f h e x o s a m i n e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y ( H B P ) f l u x i n h y a l u r o n a n - o v e r p r o d u c i n g b r e a s t c a n c e r c e l l s . A h i g h H B P f l u x a c h i e v e d b y f o r c e d e x p r e s s i o n o f g l u t a m i n e : f r u c t o s e - 6 - p h o s p h a t e a m i d o t r a n s f e r a s e - 1 ( G F A T - 1 ) r e s e m b l e d t h a t c a u s e d b y H A o v e r p r o d u c t i o n w i t h r e g a r d t o H I F -1 α s ta b ility a n d g lyc o lytic p rog ra m. C o n v e r s e l y , i n h i b i t i o n o f G F A T -1 s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d H I F -1 α s tab ility in HA- o v e r p r o d u c i n g c a n c e r c e l l s . P h a r m a c o l o g i c a l i n h i b i t i o n o f H I F -1 α ab roga ted HA- d e p e n d e n t a e r o b i c g l y c o l y s i s a n d m a r k e d l y r e d u c e d t h e C S C s u b p o p u l a t i o n . T h e s e d a t a p r o v i d e d e f i n i t i v e e v i d e n c e t h a t H A o v e r p r o d u c t i o n d r i v e s a e r o b i c g l y c o l y s i s v i a H B P -c o u p l e d H I F - 1 s i g n a l i n g t o e v o k e t h e m e t a b o l i c r e s p o n s e s r e q u i r e d f o r C S C p r o p a g a t i o n a n d o f f e r n o v e l i n s i g h t s i n t o t h e m e t a b o l i c n e t w o r k s g o v e r n i n g c a n c e r c e l l s t e m n e s s .
T h e r e s u l t s o f t h i s t h e s i s i n d i c a t e t h a t H A o v e r p r o d u c t i o n m o d u l a t e d C S C s s e l f - r e n e w a l v i a T w i s t a n d T G F -β- S n a i l s i g n a l i n g p a t h w a y . A l t e r n a t i v e l y , i t a l s o r e g u l a t e d C S C s m a i n t e n a n c e t h r o u g h t h e s w i t c h o f m e t a b o l i c p a t h w a y t o a e r o b i c g l y c o l y s i s a n d a c c e l e r a t e s H B P f l u x . A m o r e c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s c o n t r o l l i n g h o w H A m e d i a t e t h e s t e m n e s s o f C S C s w i l l b e c r u c i a l t o p r o v i d e s n e w o p p o r t u n i t i e s f o r t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o n w h i c h i m p r o v e t h e o u t c o me o f c a n c e r p a t i e n t s . i n t e r v e n t i o n w h i c h i m p r o v e t h e o u t c o m e o f c a n c e r p a t i e n t s .
― 19 ―
論 文 審 査 結 果 の 要 旨
本研究では、癌微小環境を構築している主要な細胞外マトリックス成分であり、かつ、癌進展 との間に密接な関係が示唆されているヒアルロン酸に着目し、その合成異常とがん幹細胞性との 関連について解明を試み以下の結果を得た。先ず、ヒアルロン酸を過剰産生する乳癌発症モデル マウスと対照マウスに発生した乳癌から乳癌細胞を樹立し、細胞表面における CD44 と CD24 の発 現を指標に、がん幹細胞の割合をフローサイトメトリー解析により測定した。その結果、ヒアル ロン酸を過剰産生する乳癌では、対照に比して CD44high/CD24lowがん幹細胞様細胞が増幅している ことを明らかにした。さらに、Hoechst 33342 色素の排除能を指標に分離した Side population (SP) 細胞と非 SP 細胞を用いて、CD44 と CD24 の発現をフローサイトメトリー解析した結果、ヒアルロ ン酸過剰産生乳癌由来の SP 細胞中には、CD44high/CD24lowがん幹細胞様細胞が濃縮されていること を明らかにした。次に、がん幹細胞性の指標であるスフェア形成能について検討し、ヒアルロン 酸過剰産生乳癌由来の SP 細胞は、対照の SP 細胞に比して、より高いスフェア形成能を示すこと を明らかにした。ヒアルロン酸過剰産生乳癌由来の SP 細胞と対照の SP 細胞をヌードマウスの乳 腺脂肪帯に移植後、造腫瘍性を解析した。その結果、ヒアルロン酸過剰産生乳癌由来の SP 細胞は、
対照の SP 細胞に比して高い造腫瘍能を示した。以上の結果は、がん細胞におけるヒアルロン酸過 剰産生が、癌幹細胞性の獲得に寄与していることを示唆している。
本研究ではさらに、がん細胞におけるヒアルロン酸依存的な上皮-間葉転換が、がん幹細胞性の 獲得に働く可能性を検討した。先ず、上皮細胞マーカー分子の E-カドヘリンの発現を免疫染色法 により解析した。その結果、ヒアルロン酸の産生増加が、がん細胞に上皮‐間葉転換を誘導する ことを明らかにした。また、上皮間葉転換に関連する分子の発現変化について、Beads array 法 と qRT-PCR 法により解析した結果、ヒアルロン酸過剰産生乳癌由来のがん細胞では、上皮-間葉転 換の制御因子である TNF-α、TGF-β、Snail および Twist の発現が亢進していることを明らかに した。さらに、これらの因子の活性や発現を抑制すると、がん細胞における上皮-間葉転換が減弱 し、がん幹細胞様細胞が減少した。以上の結果は、ヒアルロン酸過剰産生が、がん細胞の上皮- 間葉転換を誘導して、がん幹細胞性の獲得に働くことを示唆している。
がん幹細胞は、他の幹細胞と同様に、酸化的リン酸化から解糖系にエネルギー産生経路が変化し ていることが知られている。所属研究室では、質量分析により、がん細胞におけるヒアルロン酸 合成の促進が、ヒアルロン酸合成基質である UDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)の代謝経 路(HBP)の流束を増大し、解糖系を中心とする糖代謝プログラムを正に制御するという新事実を明 らかにしている。そこで本研究では、解糖系のマスターレギュレーターである HIF-1 に着目し、
その構成タンパク質の HIF-1αの安定化に HBP 代謝流束が働く可能性を検討した。先ず、HBP の律 速酵素であるフルクトース‐6‐リン酸アミド転移酵素(GFAT)の活性や発現の調節が、HIF-1αの 安定化と解糖系に及ぼす影響について、解糖酵素の発現や乳酸脱水素酵素の活性測定、そして乳 酸産生量の測定により解析した。その結果、GFAT の過剰発現によって、ヒアルロン酸の過剰産生
― 20 ―
と同様に HIF-1αの安定化と解糖系が促進されること、逆に、GFAT の活性を阻害すると HIF-1α の不安定化と解糖系が抑制されることを明らかにした。上述の解析により、ヒアルロン酸糖鎖が、
従来考えられてきた細胞外シグナルとしての機能の他に、その合成反応と共役した細胞内糖代謝 の調節機能を担っていることが強く示唆された。そして、薬理学的実験の結果、ヒアルロン酸過 剰産生による糖代謝リプログラミングが、がん幹細胞性の制御に働いていることが示唆された。
以上、得られた結果は何れも新規性があり、がん幹細胞性の制御機構を解明するうえで大変意 義がある。そして、がん幹細胞性の制御におけるヒアルロン酸の役割を詳細に解明した研究は、
本論文が初めての報告である。主査、副査の博士論文調査委員による論文審査の結果、論文全体 の内容は論理的で良くまとめられていることから、調査委員全員一致で合格と判定された。また 公聴会では、発表内容は論理的かつ明瞭にまとめられており、質疑応答に対してもほぼ的確に回 答していた。
尚、本論文に関する内容は、国際専門雑誌である Journal of Biological Chemistry, 289:
26038-26056, 2014.に掲載され、当該学位申請者は、この内容で第 24 回日本がん転移学会学 術集会において優秀ポスター賞の受賞している。
