腫 瘍培 養細 胞 に

金沢 大学 十全 医学会稚誌 第8

7

巻 第

5

^･ 6 号 6

1

9‑⁶

³

5 (

1

9

7 8

)

脳腫 瘍培 養細 胞^に対する vin c ristin e の 影響

一 光顧 及び電顕 ^{によ る}検 索 ^一

金 沢大学 医 学 部脳神経 外 科学 講 座 ( 主 任

^;

山 本 信

^二

郎 教 授)

木 谷 隆

( 昭和53 年1 0月1 6 日受 付)

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a

l

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の

^一 種

で

あ る

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は

J

^o

h

n s o n に

よ^っ

て

196 0年

^に

白 血 病を移 植さ れ た

^マ

ウ ス に

射し治療 効 果

^の

あ る事が証 明さ れ た^‑

^I

,

ヒ ト の

脳

腫 瘍

^に

対 し

て

は 1962 年 A

r m s t r o n g

ら

が^,

V

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n e

を

a s t r o c y t o m a に

使 用し, 以 来髄 芽 踵, 多 形膠 芽 腫

^に

も 治 療 効 果

^の

^{あ る}専が報 告さ れ た²

^州

.腫瘍 細 胞

^に

対す る

^{こ の}

物 質

^の

作 用 機 序

^に

関し

て

は有糸 分裂 停止 作 用

^に

よ る

c y t o s t a t

i

c

効 果が重 要

で

あ る と考え ら れ

て い

る

^{8 ト}

^ー2

⁾

. し か し癌

に

対す る臨床 使 用経験

^で

は^, 腫瘍

^の

縮 小と有 糸 分 裂停 止

^の

程 度が, 比 例し な

い

事 実が 認 め ら れ,

V

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lk

a

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o

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の

抗 腫 効果作用を単な る有 糸 分 裂停 止

^の

み

で

は説 明

^で

き な

い

挙が指摘さ れ た^一

^{3 冊}

^{. 一} 方

^v

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n e

を作 用さ せ た 細胞

^の

核 酸 代 謝

^の

研 究

で

は, R N A 前 駆 体

^の

里^･

u r

id i

n e

は 45 S R N A 檎3 2 S R N A

に

蓄 積し^, 1 8 S R N A や 2 8 S R N A ^へ 移 行し難

^い

事よ り

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は リ

^ポ

ゾ^ー

ム

R N A

の

生 成を阻 害す る作 用を有 する事 が 証明さ れ た^{1 5}

^I

^{1 6}

⁾

リ

^ポ

ゾー

^ム

^{R N A は}核 小 体

^に

由 来す る も

の で

あ る^{‑ 7}

^メ

^. 形態 学 的検 索

に

よ れ ば, 核小 体 内

^に

お

い て

, ま ず 細線練成 分が 合成さ れ^t

こ

れ

か

ら顆粒成 分

が

合成 さ れる^. 又生化学

の デ

^ー

タ

と

の

検 討

^に

よ り 4 5 S R N A が細 線 練 成分

^に

. そ し

て

2 8 S R N A が顆 粒 成 分

^に

含ま れ る事が 知ら れ, し か も顆 粒 成 分が リ

ポ

ゾ^ー

^ム

R N A

の

直 接

^の

前駆 体と考え ら れ

て い

る^用

^J

^. 従^っ

て

リ

ボ

ゾー

^ム

^{R N A}

の

代謝

^に

変 化

の

あ る場 合

^に

は核 小体

^の

形羞削

^こ

も何ら か

の

変化

^の

あ る事が推 定さ れ る^.

本実験

で

は臨 床 上使 用^{さ れ る}濃度

^の v

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を 多形腰芽 腫と髄 膜 腫

^の

初 代培 養脳腫 瘍 細 胞

^に

作 用さ せ･ 光顕及 び電顧 を用

^{い て}

細 胞 質と核 小 体

^の

形 態

^の

変 化を検索し た^.

61 9

材 料お よび 方 法

手 術

に

よ^っ

て

別 出さ れ た 3例

^の

多 形 膠芽 歴と 3 例

^の

髄膜 脛を実 験

に

供し た. 無 菌 的に採 取さ れ た腫瘍 租 税 を 0 .5 ^〜 1.O

m m

角

^に

細切し^, 0 .1 % ト リ プ

^{シ ン}

液 中

で ピ ペ

ッ

テ ィ ン

グ を施し た^.

こ の

操 作

^に

^よっ

^て

細胞は

ほ

と ん ど 1 個1 個

に

分 離さ れ.

こ

れ を 500

r p m

3分 間 遠心 し, 上 澄み液

に

^ハ

ン

ク

の

プ

ラ ス

液を加え^.

ト

リ

プ

シ ン の

消 化 効 果各停 止さ せt lOOO

r p m

5 分 間 遠心 し,

上澄 み液を捨

て

.そ

の

沈査

^に

20 % 仔 牛 血清 添 加1 9 9 培 養液を加え^, ガ

ラ ス

瓶

に

よ る単層 培 養を行^った^. ガ

ラ ス

瓶は小 角 培 養瓶 ( 池 本理 研) ^を用

^い

^. そ

の

中

^に

5

^{m m}

X

l O

m m

め

カ バ

ー^グ

^{ラ ス}

を置き^, そ

の

上

に

増 殖し た細

胞を実験

に

使用し た^. 培 養液は3 日

に

1 回

^の

頻度

で

交 換し^. 培 養16 日 ^〜 1 8 日目

^に

そ

の

初 代 培 養 細 胞

^に

V

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を 0 .1

F E g / m

L

の

濃 度

で

2 4時 間作 用さ せ^t

コ

ン ト

^{ロ ー}

ル

群と対 比 検索し た^.

コ ン ト

^{ロ ー}

ル

群と

^v

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作 用 群と を同日

^に

固 定し た.

カ ^バ

^ー グ

ラ ス

上

^に

付 着し

て い

る細胞を燐 酸 緩 衝 液

に て

洗 浄 後, 0^,1 M

カ

^コ ジ

ル

酸

ナ ト

リ

ウ ム

緩衝液

に よ

る 2^.5 % ダ

^ル ク

^ー

ル ア ル デ ヒ ド

(

p

H 7.4)

^{に て}

4⁰c

で

2 0分 間 固定し た後,鉄

に て カ ^バ

^ー グ

ラ ス

を切 断 し^{. 〜}部を光 顕用

^に

ギ

^ム

ザ染色を施し た. 残り

の カ ^バ

ー グ

^{ラ ス}

上

^の

細胞を 4⁰c

に て

0.1 M

カ コ ジ ル

酸 緩衝 1

%

^{オ ス ミ ウ ム}

酸 (

p

H 7.4)

で

3 0分 間 後固定し た後^. 上 昇 ^エタ

ノ

^ー

ル

系 列

^{に て}

脱 水し, 酸 化プ^ロ

^{ピ レ ン}

で置 換 後, 5 % ^コロ

^ジ

オ

^ン

液( 和 光純 薬)

^の

入^っ た

シ _ャ

^ー

レ に

3 0 分 間浸し た^.

カ ^バ

^ー グ

ラ ス

を^コロ

ジ オ ン

液か ら取り 出し

て

, 室 温

に て

5 分 間乾燥^{さ せ る と, カ}

^バ

^{ー グ}

^{ラ ス}

上

に

轟

^{い コ}

^ロ

ジ オ ン の

膿が

で

き る^.

^{こ の コ}

^ロ

ジ オ ン

膜 を 蒸留 水 中

で カ ^バ

^ー グ

ラ ス

よ り剥 離す る と, 培 養 細 胞

Eff

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U

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^.

は す

^べ て コ ロ

ジ オ

^ン

厳

に

含ま れ る.

こ の

剥離し た

^コ

^ロ

ジ

オ

^ン

膜を恒 温槽

^で

37⁰c

に て

約20 分 間 乾 燥さ せ た 後.

こ

れ を L

u

f

t の

方 法^一

⁹

厄 従い 調 合し た

^ェ

ボ

^ン

8 12 樹 脂と酸 化プ

^{ロ ピ レ ン}

液

の

混 合液 (⁹

^:

¹)

^に

て60分^〜 90 分 間 振 塗し

て

軟化さ せ,塊状

に

し

て

平 板 包埋 板

^の

く

ぼ み

に エ ボ ン

樹脂と共

^に

入れ脱 気し た^. 脱 気 後^,

^サ

^ー

マ ノ

ック

ス カ ^バ

^ー

ス

リッ プ に

て

く ぼ み

に

蓋を し, 四隅 を針

で

止め, 包 哩 板を 4 5⁰ に傾 斜さ せ た ま ま恒 温 槽内

で

80⁰c

に て

2 4 時 間 重 合さ せ, L K B Ⅱ型

ウ ル

ト

^{ラ ミ} ク ロ

ト ^ー

^ム

を用

^{い て}

超 薄切 片を作 製し た. 電 子 染 色は 2 % 酢 酸

ウ ラ

^{ニ ー}

ル

水 溶液と佐 藤

^の

ク

エ ン

酸鉛 液

^{2 01 に}

よ る 二重染 色を行な

^い

.日立H U ‑ ^{1 1 D S 型,日本 電 子} JE M l O O B 塾 電子 顕 微 鏡

に て

観 察し,直 接 培率1 800 倍 よ り 1 2 万倍

^に

わ た り写 真撮 影し た^.

成 績

写真1 は多 形 膠 芽腫 培 養1 7 日呂

^の

光 顕 所 見を示す^. 細 胞^は大小 不 同^が著る し く, 突 起 を除く大 きさ は最 も 大き

^い

も

の で

長 径100

〟

^, 小さ

^い

も

の で

は長 径 20

〃 で

あ る^.大 型

^の

細 胞は長径が 1 00

〟

^〜 50

J J の

大き さ

で

,小 数

^で

あ る. 細胞

^の

形は 5 な

い

し6 角 形を な し, 細 胞 突 起は太く短か

い

.比 較 的大き な類 円 形

^の

核が み ら れ る^. そ

の

大き さ は約20

〟 ×

1 2

〃 で

あ る. 中 型

^の

細胞は長 径 50

/ J

^〜30

〝 で

あ り^. 多 数み ら れ. 概ね 2

つ の

形 態を示 す^. そ

の

^一

つ

は台形な

^い

し長方 形を な し, 2 な

^い

し 3 本

^の

太

^い

突 起を有 する細 胞

で

あ る. 他

^の

型

の

細胞は 5 な

^い

し 6 角 形を示 すが, 長短 様

々

な6 な

^い

し9 本

^の

突 起を持

^っ

た め. 細胞 辺 縁が不 規 則

^で

あ る^.

^こ

れ ら

の

細 胞

の

核は大 小 不 同で あ る. 小 型

^の

細 胞^{は 3}0

〟

以下

で

数 は少な く類 円形な

^い

し 三角 形を示す^. 突 起

^の

数は少な く 0 ^〜2 個で あ る^. 核は約1仙

^×

6

J J で

あ る^.大 型お よ び中型

の

細胞

の

核

の

約 半 数

^に

辺 縁

^の

不規 則 性が見ら れ^,多 核 細胞 も

^こ

れ ら

^の

細 胞

の

1

^/

7 ^〜 1

^/

8

に

み ら れ る^. 有 糸核 分 裂は 認 め ら れ な

い

.

写 真2 は上記

の

培 養 細胞

に

0.1

F L g / m

L

v

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i

s t

i

n e

を 2 4 時 間作 用さ せ たも

の で

あ る^.全

て の

細 胞

に

お

い て

萎 縮 変 性が見ら れ る^. 細胞

^の

突起や角_は消 失し^, 全 体 に丸

い

. 細 胞は大小 不 同

^で

あ り^, 大 き

^い

も

^の

で 長径

^が

4 0

〃 で

あ り^. 小さ

^い

も

の で

長径

が

1 2

/ 上 で

あ る^. 萎縮

^の

程 度は様

^々

で あ り, 萎 縮

^の

強

^い

細胞は, わ ず か

^に

核

^の

周 囲

^に

細 胞 質が見ら れ る

の

み で^.金 米糠 様

^の

形を示す.

核に は光 源 所見

^に

関 する限り^t 対 照群と差 異を認め得 な か^っ た. 又細 胞

の

他

に

, 死 滅 細 胞^を疑わ し め る紫 色

に

濃染 する無様 造 物が散 在 する^. 有 糸分 裂 像は見ら れ な

い

.

写真 3 は対 照群

^の

電顕 像^を示 す^. 細胞^は紡錘形を示

す も

^の

が多く^. 約70 %

^の

細 胞

^に

は, 辺 綾

^に

0^.1

/ ノ

か ら 4

〟 の ^コ

プ状

の

突 出が見ら れ^, 多

^い

も

の で

は 8 個み ら れ る. 又細 胞

の

辺 縁は多 数

の

浅

^い

陥凹

^の

た め不規 則

^に

見 え る^. 細 胞 質 中

に

は

ミ ト コ ン ド

リ

ア

及び遊 離リ

ポ ゾ

ー

ム

が多

^い

^.細 胞質中

^に

は少数な が ら空 胞も見ら れ る.

細 胞

の

約1

/

3 が多 核

^の

所 見を示し. 形は 三角形あ る

い

は楕 円 形

で

^一定せ ず, 核

^の

辺 縁

^に

は浅

^い

核膜

^の

湾 入が 多く見ら れ る^{. ‑} 核

^の

細 胞

^の

う ち

^の

約1

^/

3 は深

^い

核肢

の

湾 入を有す る不 姐 則な形を し た核を有す る^, 約 半数

の

核

^の

核 膜 周囲

^{に ク}

^ロ

^{マ チ ン}

が少 量 見ら れ る^. 核 小体

の

多く は類円形

^で

あ り 辺縁

^に

浅

^い

陥凹 を多 数 有し, 約 1 5 0 0 Å

^の

太さ

^の

核 小 体 糸

に

よ る粗な網 目 状 構 造を示 し, 核^′ト体 糸 上

^に

は径約2 0 0 Å

^の

顆粒が散 在す る.

写 真4 は 0 ^.1

F L g / m

L

v

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n e

を 2 4 時 間 作 用さ せ た も

の で

あ る^. 細 胞 質 内

^に

お

い て

多 数

^の

0^.2

〟

^〜 0 .8

〃 の

空胞が 見 ら れ る.

ミ ト コ ン ド

リ

ア の

形

に

は変 化は 見 ら れ な

^い

^. 遊 離リ ポ ゾ^ー

^{ム の}

減 少は核 小 体

^の

変 化が後 述

の

第3 及 び第5 型

^に

属 する細 胞に お

い て

明ら か

で

あ^った. 核

に

関し

て

は そ

の

輪 廓及 び

ク

^ロ

マ チ ン の

配置

^に つ い て

は特

^に

変 化は見ら れ な

^い

^.

^こ

れ

^に

対し,

核 小 体

^に

は, 網 目 状 構 造及 び顆粒 成 分と細 線 維成 分

^の

構 成 比

に

著 明な変 化が認め ら れ,

こ

れ を 5

つ の

型に分

け た( 蓑1) .

核 小 休

^の

変 化

^の

第1 型は写 真4

^の

上 方

^の

細 胞

^の

核小 体

^に

見ら れ る如く, 核

^′

ト体 糸が か ら み合^っ

^て

緻密^な網 目 状 構 造を有す るも

の で

あ る^.

こ の

核 小 体 内

^に

は径約 2 0 0 Å

^の

顆 粒が普通

に

見ら れ る, 第2型は写 真4

^の

下 方

^の

細 胞

^の

核 小 体

^に

見 ら れ る如く^, 核小 体 糸

^に

よ る網 目状 構 造を失

^い

^, 1i

g

h

t a r e a

は消 失し

て

全体が均質

^に

見え るも

の で

あ る.

こ の

型

の

核

^/

ト 体

^に

は前 述

^の

径 約 20 0 Å

^の

顆 粒

が

核小 体 全 体

に

存在 す る も

^{の か}

ら わ ず か

^に

散 在す る も

^の

ま

で

種

^々

あ る^. 第3 型 は写真5

^に

見 ら れ る如く, 核 小 体 糸

^に

よ る網 目 状 構 造が失わ れ.

均 質

^に

見 え る も

^の

で あ る^.

こ の

型

^の

核 小 体

に

は径20 0 Å

の

顆 粒は消 失し

て

見 ら れ ず, す

^べ て

径40 Å^〜 5 0 Å

の

細 線 経

^で

構 成^{さ れ}

^{て い}

^る. 第4 型は 写真6

に

見ら れ る如く^. 核 小 体 内

に C e n t r a

l l

a c u n a e

を 1 個な

い

し. 2 個 有す る リ

^ン

グ状 核 小 体

^で

あ る.

こ の

種

^の

核^′ト 体

^の

皮 質 部 分が緻密^な網 目 状 構 造を呈す る も

^の

と, 均 質

^に

見 え^.径 約20 0 Å

^の

鴨 粒と 50 Å

の

細 線 経

^で

構 成さ れ

て い

るも

^の

が あ る.第5 型は写 真7 , 及 び 8

に

見ら れ る 様

^に

電子 密 度

^の

高

^い

部 分と低

^い

部 分

に

明確

に

分 離し

て

見 え る も

^{の で}

あ る^.

こ の

電子 密 度

^の

高

^い

部分も低

^い

那 分も共

に

径約 5 0 Å前後

^の

細 線 絶

の

み

で

構 成さ れ,輯拉

は見ら れ な

^い

^.

写真9 は髄 膜 腫 細 胞 培 養1 8 日目

^の

光 顕 像

^で

あ る^.核

脳 腫 瘍 培餐 細 胞に対 する V i

n c r

i

s t

i

n e の

影 響

表1 V i

n c r

i

s t

i

n e に

よ る核 小 体

^の

変 化 核 小 体 糸に よ

る網目状構 造

0

2 0 0 A

の

顆 粒

0 0

4 n A ^〜 5 0 A

の

細 線 維 備 考

第1 型 緻 密 普 通 普 通

第2 型 な し 少な

^い

多

^い

第3 型 な し な し 多

^い

第4 型

緻 密

O r

消 失

少な

^い

多

^い

リ

^ン

グ状核小体

第5 型 な し な し 多

^{い S e}

g

^{r e}

g

^{a t}

i

o n

を示す

6 2 1

分裂像は見ら れ な

^い

. 細 胞

^の

多く は台 形な

^い

し細 長

^い

三角形^, あ る

い

は紡錘 形を な し^, 核は大 体径12

〟 の

円 形な

い

し類 円形

^で

あ り. ほ ぼ ^一定

^で

あ る^. 三角 形

^の

細 胞

^で

は胞体が乏し

^い

た め辺 縁は湾 入^{し て お り.} 細 長

^い

直線状

^の

突起を有 する. 台形

^の

細胞

^で

は突起 を除 く細 胞

の

大さ さ は長径 約50

〟

^〜 2 0

〟 で

あ り^.殆ん ど突起を有 さず, 有し

て

も短か

^い

. 核

の

辺 縁

^に

は陥凹 な ど

^の

不 規 則さ は殆ん ど見ら れ な

^い

^. 又 多 核細 胞は少な

^い

^.

写 真 10 は 髄 膜 腫 培 養 細 胞 に 0 ^.1

〃g

/

m

L

v

i

n c r

i

s t

i

n e

を24 時 間作 用さ せ たも

^{の で}

あ る^. 核 分裂 像は 認 め ら れ な

い

. 全

^{て の}

細 胞に細 胞 質

^の

萎縮変 性が見ら れ る. 半 数

の

細 胞

で

は細 胞質^が比 較 的 多く,

形は全体

^に

丸く な^っ

て

細 胞

^の

突 起や角が消 退し

て い

る^. 細胞 質

^の

少な

い

細 胞

^で

は核

^の

周囲に わずか

に

細胞 質が見ら れ る

の

み

で

あ り. 小さ な 三角 形な

い

し, 星状 を呈す る^.核

^の

形

に

は対 照 群

に

比し

^て

差を認め得な

^い

^. 細胞 間

^に

は紫 色

^に

染ま る無 構造 物が散 在 する^.

写真1 1 は対 照 群

^の

電 敢 像

^で

^{あ る.}細 胞は卵 円形な

い

し紡錘 形を な し. 小さ な細 胞 質

^の

突 出が所

々 に

見ら れ る^. 多く

の

細 胞

^に

お

い て

そ

の

辺 緑

^の

所

^{々 に}

少数

^の

陥凹 が 認 め ら れ る. 多く

の

細胞

^の

細胞 質 内に は約0.餌

^の

空胞が散 在し^. 又 0.1

〟

^〜 0^,2

〟 の

小さ な空 胞が多 数 存 在す る細 胞 もあ る^. 細 胞質 中

^に

は

ミ ト ^{コ ン} ド

リ

^ア

や遊 離リ

ポ

ゾ^ー

^ム

が比 較 的 多^く見ら れ る^. 全 体

^の

約3

^/

4

の

核は規 則 正し

い

辺 縁を有 する か^t あ る

い

は辺 縁

^に

浅

^い

核膜

^の

湾 入が 1 個な

^い

し 2 個み ら れ る. 約 半数

^の

核

に

お

い て

少量

^の

核 膜 周 囲ク^ロ

^マ チ ン

が見ら れ る^. 多 核 細 胞は稀

で

あ る^. 核 小 体は煩円 形な

い

し,多 角 形で あ り.

径約1 5 0 0 Å

^の

太さ

の

核 小体 糸に よ る粗な縞 目 状 構 造 を有し,核小 体 糸 上

に

は径約2 00 Å

の

鯖 粒が見ら れ る^. 写真1 2 は 0^.1

/ ∠ g / m

L

v

i

n c r

i

s t

i

n e

を24時 間作 用さ

せ

た髄 膜睦 培 養 細 胞

^の

電 宗則象

^で

^{あ る.} 細 胞質

^に

は 著 明

な 空 胞

^の

増加

が

見 ら れ, 胞体

^の

変 化は核小体

^の

変化^と 関連し, 核小体

^の

変化

^の

型は前述

^の

膠 芽睦

に

お け る場 合

^の

分類と ほ

ぼ

同 様で あ る^. 核

^の

形t ク

^{ロ マ}

チ

^{ン の}

分 布

^{に つ い て}

は 対 照例と比

^べ

特

^に

変化は な

^い が

, 核小体

に

著明 な変 化

^が

見 ら れ る^.

細 胞 質

^の

空胞

^の

増 加 及び遊 離リ ポ ゾ^ー

^{ム の}

減少

^の

程 度は第1型

^の

核 小 体を有^する細胞

^で

は顕著で な

^い

が.

写 真1 2

に

見ら れ る如く^.第3 型な

い

し第5型

の

核 小 体 を有する細 胞

に

お

^い

て顕 著

で

あ る.

写真1 3 は第1 型

^の

核小 体を示し. 径 約2000 Å

の

核 小 体糸が豊 富で, 非 常

^に

密な網眉 状 構 造を呈し, 径 約 200 Å

の

額 粒 も 見ら れ る. 細 胞 質 中

^に

ミ ト

^コ ン ド

リ

ア

も多

^い

.

写真1 4 は第 2 型

^の

核 小 休を示 す^.核 小 休

^の

網 目 状 構 造は全く失な わ れ, は ぼ均 質に見え る.

こ の

核 小 体 中

に

は径 約200 Å

の

顆 粒と径 約50 Å

の

細 線 経と が見ら れ る^.そ

の

顆 粒 も径 約50 Å

の

細 線 維

^の

集 合

^で

あ る

の

が 見ら れ る.

写 真1 5

に

見ら れ る核小体は第3 型

に

属し.騎 粒 成 分 が全く見ら れ ず.全

て

径 約50 Å

^の

細 線維 成 分

^の

み で構 成さ れ

て い

る.

写真1 6

に

見ら れ る核小 体は第4型

^に

属し^,リ

^ン

グ状 核小 体

で

あ り, そ

^の

皮 質部 分^は第2型

の

核小 体^と同 様

に

,径約200 Å

^の

顆 粒と豊富な細 線維よ り成^っ

て い

る.

第5 型

^の

核 小 体は髄 膜 踵

^の

検 索

^で

は認め得な か^っ た^.

考 察

本 実 験

^に

お

い て

は培 養 脳 腫 瘍 細 胞

に

対 す る

V

i

n c r

i

s t

i

n e の

作 用

^に つ い て

. 最 も悪性

^に

属す る多 形 膠 芽 歴と^.

こ

れ

に

対し良 性 腫 瘍に属 する髄 膜 腫と

の

間

に

有 意

^の

差を 認 め な か^っ た. 研 究

^の

経過

に

お

い て

t 星 状 膠 細 胞 腫及び神 経 鞘腫

^の

培 養は困難で あ り, 研 究

^の