胚細胞性腫 瘍

4 8

金 沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第

^{1 0 9}

巻 第

¹

号

^{4 8}

^‑

^{5 9}

(

2 0 0 0

)

頭 蓋 内胚細胞性腫 瘍^におけ^る細胞周期制御因子 ^の発 現^と そ ^の遺伝子 異常の解析

金 沢大 学 医 学 部 脳神経 外 科 学 諦 座(^{主 任: 山}

^下

純 宏 教 授)

岩 戸 雅 之

頭 蓋 内胚 細 胞 性 膿 瘍

は

, 組 織 学 的

に は

, 精 巣 胚 細 胞 性 腫 瘍

と

極

め て

類 似

し て

^い

る

. 精 巣 胚 細 胞 性腫 揚

^{に お}

け

^る

分 子 生 物 学 的背景

と し て

p

5 3 お よ

び

m d m 2

(

^{m u r i n e d o u bl e m i n u}

^t

^{e 2}

) ^の異 骨

^が

報 告 さ れ

^て

^い

る が

, 頭 蓋 内胚 細 胞 性 腫 瘍

^{に お}

け

る

, p

5 3

,

m d m 2 に

関

し て は

未 だ解 明

さ れ て

^いな^い･ 本 研 究

^{で は}

, 頭 蓋 内 胚 細 胞 性 腫 瘍

の

膿 瘍 化^の

メ カ ニ ズ ム を

明

^{ら か に}

す

る た め に

,

p

53

遺 伝 子 変 異,

m d m 2

遺伝 子 増 幅,

I N K 4 a

/

A R F

(

^{i n hibit o r o f c} y ^c l i n d e

p

e n d e n t k i n a s e 4 a

/

^{a l}

t

e r a t i v e r e a di n

g

f r a m e

) 遺 伝 子 異 常 を 蛍 光

¹

本 鎖

D N A

高 次 構 造多型

P C R

法, 弁 別 的

P C R

法

お よ び

直接

シ

^ー

ク ^エ

ン ス法 を 用^い

て

検討

し た

.

さ ら に

, P

5 3

蛋 白

^{お よ} び m d m 2

蛋 白^の発 現 を 免疫 組 織 化 学 的

に

検討 し

^た

^. 手 術 標 本

^よ

り得

^{ら れ た}

頸 蓋 内胚 細 胞 性 腫 瘍

2 1

例(^{胚 細 胞 鹿}

^{1 0}

^例, 奇 形 濫

7

例, 卵 黄 嚢 腫 瘍

²

例, 絨 毛癌

²

例) を対象

^と

し

た

^.

2 1

例 中

1

例

に

お^い

て p 5 3

遺 伝 子

^{エ ク}

^{ソ ン}

^{5 に}

点 突 然 変 異 を認

め た

.

m d 皿 2

遺 伝子 増 幅

は

,

2 1

例 中

3

例

に

認

め た

^. _p

53

黄 白

は

,

P a b 1 8 0 1

(抗

p 53

抗 体)

^{で 2 0}

例 中

²

例

^に

,

D O 7

(抗

p 5 3

抗体)

^{で 2 0}

例 中

1 5

例

に

陽 性 反 応 を 示

^し

,

m d m 2

蛋 白

^は

,

I F 2

(抗

^{m d m 2}

抗 体)

^{で 2 0}

例 中

1 6

例

に

陽 性 反応 を 示 し

^た

^.

^{I N K 4 a}

/

A R F

遺 伝 子 異 常

は

,

2 1

例 中

1 4

例

に

相 同 的 欠 失

が

認

め ら れ

,

1

例

に

点 突 然 変 異 を 認

め た

^.

I N E 4 a

/

A R F

遺 伝 子 異 常

^は

, 胚 細 胞 腫 群 (

^{1 0}

例 中

⁹

例)

^の

方

が

, 非 胚 細 胞腫 群 (

^{1 1}

例 中

6

例)

^よ

り高頻 度

^に

存在す

^る

傾 向

^に

あ

^{っ た}

b⁼

0

^.

0 9

)^.

p 5 3

遺 伝 子,

m d m 2

遺 伝 子

お よ び I N K 4 a

/

A R F

遺 伝 子^の遺 伝子 群^の中

^で

, 少 な く

と

も

ひ と ^つ

以

上 の

遺 伝 子

に

異 常 を 認

め た

も^の

は 2 1

例 中

1 7

例

で

あ

っ た

. 以 上

よ

り, 頭 蓋 内 胚 細 胞 性 腫 瘍

に お

け

る

_p

5 3 お よ び m d m 2

の発 現

^{お よ び}

遺伝 子 異 常^{の パ}

^タ

^{ー ン}

^は

精 巣 胚細 胞性 腫 瘍 と 類 似

し て お

り, 両 者

^は

, 組 織 由来

が

同^一

で

あ

^{る こ と が}

推 察 さ れ, p

14 ^{A R F}

b

^{14 a lt e r n a}

^t

^{i v e r e a di n} g 血

^･

^{a m}

)^‑

m d m 2

^‑_p

53

腫 瘍抑 制経 路

に

関

わ る

遺 伝 子 異 常 を 高 頻 度

^に

認

^{め る}

^こ

と か ら

, こ

の

腫 瘍抑制経 路^の崩壊

が

頭 蓋 内胚 細 胞 性 腫 瘍

^の

腫 瘍 化

^に

関 与

^{し て}

^い

る こ と が

示 唆

さ れ た

^.

瓦

_野

W O rds in

t

r a c r a nial

_g

e rm C ell

t

u m o r s_,

p

5 3_, mdm2_,I N I 包a/^{A R F lo c u s, C ellc}

y

^cle r e

g

^ula

t

o r

頭 蓋 内胚 細 胞 性 腫 瘍 (

^{i n}

^t

r a c r a n i a l

g

e r m c e ll

t

u m o r s

,

I C G T

)

は

, 比 較 的 稀 な頭 蓋 内原 発^の脳腫 瘍

^で

あ

る

^. 仝 脳 腫 瘍 中

^{に お}

け

る そ

の発 生 頻 度

は

, 欧米

で は 0

.

3 % か ら 3

.

4 %

, 本 邦

^{で は 2}

^.

^{1 %} か ら 1 2

.

7 % と

報 告

^{さ れ}

, 本邦

^で

発 生 頻 度

が

高^{い の}

が

^一

^つ

の特 徴

と

な

っ て

^い

る ¹⁾

^､

⁸⁾

^. 組 織 学 的

に 生

殖 器 原 発^の腫 瘍 群

と

極

め て

類 似

の

像 を呈

し

,

そ の

時 微

^{か ら 5}

型[胚 細 胞 腫鹿

^{e r m i n o m}

a), 奇 形 臆 (^t

^{e r a}

^t

^{o m a}

), 卵 貴 重 膿 瘍 (y

^o l k s a c

t

u m o r

)^, 胎 児 性 癌 (

^{e m b r}

y

^{o n} a l c ar C i n o m a

), 絨 毛 癌 (

^{c h o r i o c a r C i n o m} a

)]

に

分 類

さ

れ て

い

る ^{7)9 )}

.

こ れ ら

の腫 瘍 群

に

対

し て は

手 術, 化 学 療 法, 放

射 線療 法 を 含 む集 学 的治療

が

行

わ れ て

^い

る が

,

そ

の治 療 反 応 性

お よ び

臨床的予後

は

,

そ

^の組 織 型

に

依 存

^{し て}

異

な っ て

い

る ³⁾

¹

⁰⁾

す な

わ

ち, 胚 細 胞 腫^の大 部 分

は

_, 化 学 療 法

^{お よ び}

放 射 線 療 法

^に て

完全 寛解

^{と な る が}

,

一方

^で

胚 削 包腫 以 外^の胚 細 胞 性 膿 瘍 (奇 形 鹿, 卵 黄 葵 腫 瘍, 胎 児 性 病, 絨 毛 癌)

^は

, 化 学 療 法

お よ び

放 射 線 療 法

に

抵 抗 性 を 示 す

⁸⁾

^.

し か し

,

I C G T

^の細 胞 増乱 ^{発 生 原} 因^の分 子 生 物 学 的背 景

^に

関

して は

, 不 明

な

部 分

が

多く, その分 子 生 物 学 的 背 景^の相 違

が

, 胚 細胞 腫

^と

胚細 胞 腫 以外^の胚 細 胞 性

腫 瘍 間^の治療 反 応 性

に

関 与

し

て い

る と

考 え

ら れ る

^.

近 年, 悪 性 腫 瘍^の分 子

生

物 学 的 研 究^の進 歩

^{に よ}

り, 様^々

^な

腫 瘍 化^の機 構

^が

解 明

さ れ ^{つ つ}

あ

る

^. 特

に

,

p 5 3 と p 1 6 サ

イ

ク リ

ン

依 存性

キ ナ

^ー

ゼ 4 a

阻 害 因 子 (p

1 6 i n hib i

t

o r o f c

y

c li n d e

p

e n d e n

t

ki n a s e 4 a

,p

1 6 ^I

ⁿ

^k

^{4 a}) を 中心

と し た

細 胞 周 期 制 御 因 子^の異 常

が

腫 瘍 化, す な

わ

ち 増 殖 能 お

^{よ び}

不

死

化^の獲 得

に

深 く 関与

し て

^い

る

こ

と が

明

ら か に

なっ

て

き

た

^{1 1}

^卜

^{1 6}

⁾

. 細 胞 周 期

に お

け

る G l

期

か ら S

期^へ の移 行

^は

, 網 膜 芽 細 胞 腫 蛋 白 質 (

^{r e}

^t

^{i n o bl a s}

^t

^{o m a}

p

r o

t

e i n

,

p

R B

) ^の

^リ

^ン酸 化

^に

伴^い, p

R B か ら

転 写 因 子

E 2 F が

解 離 す

^る

^こ

と に よ

^っ

て

進 行 す

^る

^{1 7}

ⁿ

⁸

⁾

^. p

53

, p

1 6

^{h k 4a}な

ど は

, p

R B

の

リ

^ン酸 化 を 制御 す

る こ と で

細 胞 周 期 を 制 御 す

^{る と}

考 え

^{ら れ て}

^い

^る

^{1 9}

^卜

^{2 1}

⁾ さ ら に

, p

5 3 は

多 機 能性^の蛋 白 質

^で

あ り,

そ

の過 剰 発 現

^{に よ}

り

ア ポ ト

^ー

シ

スを 誘 発 す

る

^こ

と が

知

ら れ て

^い

る

^{1 1}

^卜

¹

³⁾

. 最 近

^{に な}

りp

1 6 ^I

ⁿ

^k

^{4 a}

を コ

^ー

ド

す

るI N K 4 a

遺 伝 子^の遺 伝 子 座[

⁹

番 染 色 体 短 腕 (

_{9 p}

)

2 1

]

^{に は}

, こ の遺 伝 子^の

エ ク

ソ ン

2 と エ ク

ソ ン

3

を 共 有 す

る

他^の遺 伝 子,

A R F

(

^{a l}

^t

^{e r n} a

t

i v e r e a di n g f r a m e

) 遺 伝 子 も存在 す

る

^こ

と が

明

ら か に

な

っ た ^{2 2)2 3}

⁾( 図

¹

)^{. ヒ}

^{ト に お}

^い

^て

,

p 1 6

^{Ink 4a}

平 成1 1年11月2 5日受付, 平成^{1 2}年1 月1 4 日受理

Abbr e via

t

io n s

:

A P R T･ ade nin e

p

ho s

p

h o ribo s

y

l

t

r a n sfe r a s e

;

A R F, al

t

e r n a

t

iv e r e ad in

g

fr a m e

;

D R_, d o

p

^{a m}in e r e c e

p t

^{o r}

;

I C G T,in

t

r a c r a nial

_g

e rm C ell

t

u m o r s

;

I N K 4^a,inhib i

t

o r of c

y

^clin de

p

^{e n}de n

t

kin a s e 4a

;

^md ^m 2_, m u rin e do ub le min u

t

e2

;

N G G C T_･ n O n^‑g^{e r m}in o m a

t

o u s

g

^{e rm C e}ll

t

u m o r s

;

P G_,^̀

_p

u r e

g

^{e m} i_{n o m a s}

_{; p}

R B, r e

t

in obla s

t

o m ap^{r o}

^t

^ein

; P

1 4

^{A R F}

_,

頭 蓋 内胚 細 胞 性 腫 瘍

^{に お}

け

る

細 胞 周期 制御 因子^の解 析

は 1 5 6

^の

ア ミ

^ノ酸

^{か ら}

な

る

蛋 白

^で

あ り,

A R F

遺 伝 子

が コ

^ー ドす

る

p

1 4 ^{A RF}

b

^{1 4 a l}

^t

^{e r n a}

^t

^{i v e r e a di n}

^g

^{f r a m e}

)

^{は 1 3 2}

^の

ア ミ

^ノ酸

か ら な る

蛋 白

^で

あ

る

.

そ

の遺 伝 子 座

は

,

I N K 4 a

/

A R F

遺 伝 子 座

と

呼 ば

れ て お

り, 多 く^の種 類^の腫 瘍

に お

^い

て

,

そ

^の遺 伝 子 座^の異 常

が

高 頻 度

^で

あ

る

^こ

と が

報告

さ れ て

^い

る ^{1 5)1}

⁶

⁾

^. 最 初

_{p 1 4} ^{A 肝} は

マ

ウ

ス p

1 9 ^A

^肝 b

^{1 9 a lt e r n a}

^t

^{i v e r e a d i n}

g

& a m e

) ^{の ヒ}

^ト

相 同体

^{と し て}

発 見

^{さ れ た}

^{. こ の}蛋 白

は

p

1 6 ^{1 N K4}

^aと

は

異

な る プ ^ロ

モ ^ー

タ

^ー 領 域

を

有

し

,

そ

の機 能

は

,

m d ^m 2

蛋 白 (

^{m u r i n e d o u b l e m i n u t e 2}

)

が p 5 3

を

エ ビ キ チ

^ン化

し

, p

5 3 の

分 解

を

進

め る

作 用 を 抑 制 す

る

^こ

と に ょ

り

p 5 3

^の活 性^{レ ベ ル}を

上

げ

^{る こ と で}

あ

る

^{2 4}

^{ト 2}

⁸

⁾

.

こ

^{の 一} 連^の 相互 関 係 を 示 す 経 路b

^{1 4 A I( F}

^‑

^{m d m 2}

^{‑ p}

^{5 3}

^p

^{a t h w a}

^{y) の異 常}

^が

^膿 瘍 化

に

関与

^{し て}

^い

^る

考 え

^{ら れ て}

^い

^{る 29 )}

^.

本研 究

で は

,

I C G T

を 対 象

^{と し て}

p

5 3

蛋 白

お よ び m d m 2

黄 白

の発 現 を 免 疫 組 織 化 学法^{を 用い}

^て

^{検 討}

^し

,

さ ら に

p

5 3

遺 伝 子,

m d m 2

遺 伝 子

お よ びI N K 4 a

/

A R F

遺伝子^の異 常 を 弁別 的

P C R

法,

1

本 鎖

^{D N A}

高 次 構 造多塑 (

^{s i n}

g

l e s

t

r a n d c o n f o r m a

t

i o n

p

^o l ym ^{O r}

^p

h i s m

,

S S C P

)

P C R

法

お よ

か直 接

^シ

^ー

^{ク エ}

^{ン ス}法 を 用^い

て

検 討

^{し た}

^.

対 象

お よ

び 方 法

Ⅰ

^. 対 象

1 9 8 8

年

か ら 1 9 9 8

年 ま

で に

金 沢 大 学 脳 神 経 外 科 学教 室

^で

外 科 的 切 除

さ れ た I C G T 2 1

例 を 村象

^{と し た}

^{. その}病 理 組 織 学 的 分 類

に

^{つ い}

て は

, 世 界保 健 機 構 (

W H O

) 脳 腫 瘍 分腰

に

従^っ

た

^{3 0}

⁾

^. 内 訳

^は

胚 細 胞 腫

^{1 0}

例, 奇 形 腫

7

イ軌 ^{卵 黄 嚢 腫 瘍}

²

^{例, 絨 毛 癌}

²

^例

で

あっ

た

^. 免 疫 組 織 化 学 用

に は

,

4 %

^パ

ラ ホ

^{ル ム}

ア

ル

デ

ヒド

に て

標 本 を 固 定 後^パ

^ラ

^{フ ィ ン}

^{に て}

包埋

し た

.

Ⅱ

^. 免 疫 組 織 化 学

1

. 各 種 蛋 白 質

^に

対 す

る

抗 体

抗p

5 3

抗 体, 抗

m d m 2

抗 体

^{に は}

, 以 下^のもの

を

用^い

^た

^. 抗^ヒ

ト P 5 3

^{モ ノ}

ク

^{ロ ー}

ナ

^ル抗体

²

種 (

^マ ウ

ス

I

g

G l

,

ク ^ロ

^{ー ン}

P a b 1 8 0 1

,

O n c o

g

^{e n e} R e s e a r c h P r o d u c

t

s

,

C a m b r id

g

e

,

U S A お よ び

マ

ウ

ス

I g G 2b

^,

ク

ロ ^ー ン

D O

^t

7

,

ダ ^コ

^･

ジ

ャ パ ン_, 京 都)

^;

抗^ヒ

ト ^m d m 2

モ ノ

ク ロ

^ー

ナ

ル抗 体 (^マ

^ウ

^ス

^I

g

G 2 b

,

ク

^{ロ ー ン}

I F 2

,

O n c o

g

^{e n e} R e s e a r c h P r o d u c

t

s

,

C a m b r id

g

e

,

U S A

)^. 抗p

5 3

抗 体

は

, いず

^れ

も 野 生 型p

5 3 お よ び

変 異 型p

5 3

^の両 者 を認 識 す

る

抗 体

で

あ

る

^.

E

x o n s:1β ^{1 α Z 3}

Fi

_g.

1

.

Ⅵ l e I N K 4 a

/

A R F l o c u s

^.

G e n o m i c s e

q

u e n c e s e n c o d i n

g p

1 6 ^{T N K}

^{4 a}

a r e d e fi n e d b

_y

c o m

p

l e

t

e l

y

fill e d r e

gi

o n s w i

t

hi n

t

h e

b o x e s d e s i

_g

n a

t

i n

g

^{e x o n s} l

,

2 a n d 3

,

W h e r e a s

t

h e s e

g

m e n

t

s o f

e x o p ^s l

β

^{a n d 2 t h a}

^t

^{e n c o d e A R F a r e d e 血 I e d b}

^y

^{s h a d e d a r e a s}

^･

U n 五 11 e d

_p

o r

t

i o n s o f t h e e x o n s c o r r e s p o n d

t

o

J

^{n O n C O di n g 5}

'

a n d 3

^,

r e

gi

^{o n s}

^.

^S

p

li c i n

g

b e

t

w e e n

t

h e e x o n s i s i n di c a

t

e d b

y t

h e c o n n e c

t

i n

g

li n e s

,

a n d e x o n l a n d

■

₁

_β

_{a r e i n d i c a}

t

_e d

^t

^o h a v e S e

p

a r a

t

e

p

r O m O

t

e r S

^.

4 9

2

. 免疫 組 織 染 色

4 %

^パ

ラ ホ

ル ム

ア

ル

デ

ヒ

ド で

固 定 後, パ

ラ

フ ィ ン

に

包 捜

^{し て}

厚

さ 4

〃

^m

の切 片 を 作 製

し

,

ポ リ

^ー

L

^‑

リ ジ

ン( 和 光 純 薬, 大 阪) 処

^理

^ス

^{ラ イ}

ド

グ ラ

ス

上 に

貼 り付け乾 燥

^{さ せ た}

^.

^{キ シ}

^レ

^ン

(和 光 純 薬) を 用^い

て

脱^パ

ラ

フ ィ ン

し

,

0

^.

1 M P B S

(p

H 7

^.

4

)

で

洗 浄 篠,

0

.

0 1 M ク エ

ン酸 緩衝 液 (p

H 6

.

0

) 中

^{で 5 00 W}

,

3

分 間

の

^マイ

ク

^ロ

ウ ^エ

^ー

ブ

処 理 を

7

回 繰 り 返

^し

, 抗 原 性^の賦 備 化 を 行^っ

^た

^.

0

.

3 %

過酸^{化 水 素 加メ}

^{タ ノ}

^{ー ル}

^で

^{内 因性ペ ル}

^{オ キ シ ダ}

^ー

^ゼ

^{を 失} 晒 さ

せ

,

P B S で

洗 浄 後, 非特異 的 反 応抑制^の

^{た め}

,

ブ

^ロ

ッ キ

ン

グ

抗 体 (

^正

常

ウ サ ギ

血 清) を室 温

^{で 2 0}

分作用

さ せ た

^. 次

に

, 抗 体 希釈 用 緩 衝 液 (

^{D A K O}

)

^で

抗^ヒ

^{トP 5 3}

^{モ ノ}

^ク

^{ロ ー}

^ナ

^ル抗 体 (

^ク

ロ^ー ン

P a b 1 8 0 1

)

^{は 1 0 0}

倍

に

希釈, 抗^ヒト

P 5 3

モ

ノ ク

^{ロ ー}

ナ

ル抗 体 (

^ク

^{ロー ン}

^{D O}

^‑

⁷

)

^{は 1 0 0}

倍

^に

希 釈, 抗^ヒ

^{ト m d m 2}

^{モ ノ}

^ク

^ロー

ナ

ル抗体(

ク

^{ロ ー ン}

I F 2

)

は 2 0

倍

に

希 釈 し, こ

れ ら

^一次 抗 体 を 室 温

^{で 2}

時 間 反 応

^{さ せ た}

^. さ

ら に

,

二

次 抗 体^の

^{ビ オ ナ}

^ン化

ウ サ ギ

抗^マ

ウ

ス

I

g

G

抗体 Ⅳ

^{e c}

^t

^{o r L a v o r a}

^t

^{o r i e s I n c}

^.,

B u r li n g a m e

,

U S A

) を 室 温

で 1 0

分 反 応

さ せ た

.

ア ピ ジ

^{ン ー}

ビ オ チ

^{ン ー} ペ ル

オ キ シ ダ

^ー

ゼ

複 合 体 (

^{a v i di n e}

^‑

^{bit i n}

^‑P

^{e r O X} id _{a s e} c o m pl ^{e x}

) 法

^{と 0}

^.

^{0 0 5 %}

過 酸 化 水 素 加

⁰

^.

^{0 2 % ジ}

^ア

^ミ

^{ノ ベ ン}

^{チ ジ}

^ン(

^Si

g

^{m a}

,

S

t.

L o u i s

,

U S

A) 処 理

に よ

り 発 色

さ せ

, ヘ

マ ト キ シ リ

ン

で

核 染色 を 行^っ

^た

^. 抗^ヒ ト

P 5 3

^モ

ノ ク

^{ロ ー}

ナ

ル抗 体^の陽性

^コ

^ント^{ロ ー ル}

と し て は

, 肺 癌

の頭 蓋 内転 移^の標 本 を 用^い, 抗^ヒ

^{ト m d m 2}

^{モ ノ}

^ク

^{ロ ー}

^ナ

^ル抗 体

の陽性

^コ

^ン

ト ^ロ

^ー ル

と し て は

, 軟 部 組 織 肉腫^の標 本 を用^い

た

^. ま

た

陰 性^{コ ン}

^{ト ロ}

^{ー ル}

^は

,

一次 抗 体 を 抜^い

^た

も^の

と し た

.

3

^. 免 疫 組 織 染色^の評 価

各抗 体^の免 疫組 織 標 本

^{に つ}

^い

^て

腫 瘍 細 胞 巣 を 含

む 2 0 0

倍^の鏡 検 視 野

3

箇 所

に お

^い

て そ れ ぞ れ 1 0 0

個^の細 胞 中^の陽 性 細 胞 数 を 計 測

し

, そ^の平 均 を 百 分 率

で

評 価

し た

^. 陽性率

が 1 0 % 以 上

,

1 0 %

未 満^の標 本 を そ

れ ぞ れ

陽性, 陰性

^と

定 義

^{し た}

^.

Ⅱ

. 弁 別 的

P C R

法

お よ

び

1

本 鎖

D N A S S C P

^‑

P C R

法

お よ

び 直接

^シ

^ー

^ク

^エ

^ン

^ス法

^{に よ る}

遺 伝 子 異 常

^の

解析

1

.

D N A

の摘 出

腫 瘍標 本

^{か ら}

^の

^{D N A}

^の抽 出

^は

,

N e u b a u e r ら

^{3 1}

⁾

,

H r u Z a ら

^{3 2}

⁾

の

方 法

に

従^っ

た

^.

4 %

^パ

ラ ホ

^{ル ム}

ア

^ル

デ

^ヒ

ド で

固 定 後,

パ

ラ

フ ィ ン

に

包埋

^{し た}

厚

^{さ 4}

〃

^m

の切 片 を

H E

染 色

し

, 腫 瘍 細 胞 巣

が

含 ま

れ て

い

る

^こ

と を

確 認

し た

^.

1

標 本 あ

^た

り 未 染^の連 続 切 片

³

枚 を 月ヨ^い, ス

ラ イ ド グ ラ

^ス

上 よ

り 切 片

を

剥

が し

,

キ シ

レ ン

に て

脱^パ

ラ

フ ィ ン

を し た

^.

上

清 を捨

^{て た}

後

⁹⁹

^.

^{5 % エ タ}

^{ノ ー ル}( 和 光 純 薬)

で

再 拝 速

さ せ

洗 浄 後, 微量 高 速 冷 却 遠 心 器 (

ト ミ

^ー精

工

, 東 京)

に て 1 0 0 0 0 r

p

m

,

5

分 間,

4

℃の遠 心 分 離

^{を 2}

回 行^っ

^た

^.

^上

清 を 捨

て た

後1

9 9

^.

8 %

ア

セ ト

^ン( 和 光 純薬) を 加 え,

1 0 0 00 r

p

m

,

2

分 間,

4 ℃ で

遠 心 分 離

^{し た}

^.

^上

宿 を

^可

及 的

に

除 去 衡

⁵⁰

℃

で 1 0

分 間 振 盟 乾 燥

さ せ た

^.

プ ^ロ

テ

ナ

^p

ゼ K

(Q

I A G E N

,

H il d e n

,

G e r m a n

y) を 加

^え

,

5 5 ℃ で 3

時 間振 漁後,

9 8

℃

で 1 0

分 振 盤

さ せ

プ ^ロ テ ナ

^ー

ゼ E を

失 宿

^{さ せ た}

^{. 一} 部

を

取 り

2 6 0 n m

の吸 光 度 を 測 定

^{し て D N A}

濃 度 を 計 算

し た

.

対 照

と し て

健 常 人^の

D N A を

用^い

た

^.

D N A

の抽 出

^は

, 末梢

^血 5 m l を

採 取

し

, 室 温

で 4 00 0 r

p

m

,

1 0

分 間遠 心 分 推

し た

^. 中 間層 (

リ

^{ン パ}球層) を 採 取

し

, Q

仏 ^{a m}

p

T i s s u e K i

t(Q

^{I A G E N}

) を用^い

て D N A

を 抽 出

し た

.

一 部 を 取 り

2 6 0 n m

の吸 光 度 を 測 定

し て D N A

濃 度 を 計 算

し た

^.

p

14 al

t

e rn ativ e r e adin

g

fra m e

; p

1 6

^I

ⁿ

^{k 4}

^a,

p

1 6 inh ibi

t

o r of c

y

^clin dep^{e n}de n

t

kin a s e 4a

;

S S C P, Sin

g

le s

t

r an d c o nfo rm a

t

io n

p

^ol

_y

m o rp hi^{s m}

;

T G T,

t

e S

t

icul a rg ^{e r m c e}ll

t

u m o r s