岡 山 医 誌(1996) 108, 13∼29
腫 瘍 内浸潤 リンパ 球 のrIL-2添
加培 養 と
細 胞 傷 害 活 性の 研 究
岡 山大学 医学 部 第一 外科 学教 室(指 導:折 田薫三 教授)
松
本
三
明
(平成7年6月30日
受 稿)
Key words:腫 瘍 内 浸 潤 リ ン パ 球(tumor infiltrating lymphocytes; TIL), recombinant interleukin-2 (rIL-2),細 胞 傷 害 活 性,リ ン パ 球 表 面 抗 原,パ ー フ ォ リ ン
緒 言
悪 性 腫 瘍 に 対 す る養 子 免 疫 療 法 に は,末 梢 血 単 核 細 胞 をrecombinant interleukin-2 (rIL-2)
と培 養 す る こ と に よ っ て 得 ら れ るlymphokine activated killer (LAK)細 胞 を担 癌 生 体 に 移 入
し,抗 腫 瘍 活 性 を期 待 す るLAK療 法 が あ り臨 床 応 用 さ れ て久 し い1-5).し か しLAK療 法 の効 果 は 有 効 例 の 報 告 が 散 見 さ れ る もの の4,5),一 定 して お らず 満 足 され る もの で は な い.そ の 要 因 と し て は, LAK細 胞 を体 内 に 移 入 し た時 そ の ほ とん どが 肺,肝,脾 に 分 布 し腫 瘍 局 所 に は あ ま り集 積 しな い た め と,そ の 抗 腫 瘍 活 性 が 広 範 で 非 特 異 的 で あ る ため と考 え られ る6).一 方 従 来 よ り舌 癌,乳 癌,胃 癌 な ど の 腫 瘍 内 に 浸 潤 して い る リ ンパ 球 の 程 度 と予 後 に は 相 関 が あ る こ とが 知 られ て お り7,8),腫瘍 に 対 す る免 疫 学 的 応 答 と 考 え られ て き た.こ れ らの リン パ 球 は腫 瘍 内 浸 潤 リ ンパ 球(tumor infiltrating lymphocytes; TIL)と 呼 ば れ,近 年 そ の 特 性 に つ い て の 研 究 が 進 ん で い る. Rosenbergら は 腫 瘍 組 織 よ り分 離 したTILをrlL-2と 共 に 培 養 し抗 腫 瘍 活 性 を 調 べ た と こ ろ, LAK細 胞 よ り50∼100倍 の 抗 腫 瘍 活 性 を示 した と報 告 して い る9).ま た悪 性 黒 色 腫 よ り分 離 培 養 さ れ た 活 性 化TILが, in vitro で 自 己 の 新 鮮 分 離 癌 細 胞 に 対 して 特 異 的 な 抗 腫 瘍 活 性 を示 した こ とも報 告 され て い る10).以 上 の よ うにTILに は 強 力 で 特 異 的 な抗 腫 瘍 活 性 が 想 定 さ れ,第 二 の 養 子 免 疫 療 法 と し て 期 待 さ れ て い る. 今 回TILの 性 状 を明 らか に す る ため に 各 種 癌 よ りTILを 分 離 しrlL-2存 在 下 に 培 養 し活 性 化TILを 誘 導 し た.培 養 は2種 類 の培 養 液 に て 行 な い培 養 条 件 に よる増 殖 率 の 差 異 を検 討 した. ま たTILの 細 胞 傷 害 活 性 の 時 間 的 推 移 と phenotypeの 変 動 を それ ぞれ51Cr release assay 法 とflow cytometry法 に よ っ て 検 討 し,さ ら に リ ンパ 球 キ ラー 細 胞 の 細 胞 傷 害 因 子 と考 え ら れ て い る パ ー フ ォ リ ン の 発 現 を 酵 素 抗 体 法 に よ る 免 疫 染 色 法 に て検 討 し た. 材 料 と 方 法 当 科 で 切 除 され た 悪 性 腫 瘍 ま た は癌 性 胸 膜 炎 を 対 象 と した.す な わ ち 胃癌 肝 転 移 巣1例,乳 癌 術 後 癌 性 胸 膜 炎1例,胆 嚢 癌1例 をA群 と し, 肺 癌1例,大 腸 癌 肝 転 移 巣1例,非 切 除 乳 癌 癌 性 胸 膜 炎1例 をB群 と し た.両 群 よ りTILを 分 離 し 異 な っ た 培 養 液 に て そ れ ぞ れ 培 養 し増 殖 率 の差 を検 討 した.次 にB群 のTILに つ い て細 胞 傷 害 活 性 の 時 間 的 推 移 を,そ して 非 切 除 乳 癌 癌 性 胸 膜 炎 症 例 よ り分 離 したTILに つ い て は リン パ 球phenotypeの 変 動 とパ ー フ ォ リン の 発 現 に つ い て 検 討 し た. 1. 細 胞 の 分 離 と培 養 手 術 室 に て 切 除 直 後 の 標 本 よ り無 菌 的 に 癌 組 織 を採 取 した.生 理 食 塩 水500ml streptomycin 1g, kanamycin 1gを 加 え た 溶 液 に て 洗 浄 し た 後,メ ス 及 び ハ サ ミに て 約1mm角 に 細 切 しcolla genase type Ⅳ 0.1%, DNase type Ⅰ 0.002%, hyaluronidase type Ⅴ 0.01% (Sigma社)を 含 13
むRPMI-1640(日 水 製 薬)に 浮 遊 させ,ス ター ラ ー で 室 温 下4∼12時 間 攪 拌 す る.そ し て 得 られ た 細 胞 浮 遊 液 を滅 菌 した ス チ ー ル メ ッ シ ュ で 濾 過 して 遠 沈 し た 後, PBSで2回 洗 浄 しFicoll-Conray溶 液 に よ る比 重 遠 沈 法 に てTILに 富 む 分 画 と腫 瘍 細 胞 に 富 む 分 画 とに 分 離 し た.ま た 癌 性 胸 水 は 無 菌 的 に 採 取 した 後,遠 沈 しFicoll-Conray溶 液 に てTILを 分 離 し た.ト リパ ン ブ ル ー 染 色 法 に よ るTILのviabilityは 全 て95% 以 上 で あ っ た.得 られ たTILをcomplete medium (CM)に 浮 遊 させ5×105/ml (B群 乳 癌 癌 性 胸 水 症 例 の み10×105/ml)と し培 養 に 供 し た. CMはRPMI-1640に25mM Hepes (Sigma 社), 10%ヒ トAB serum, 100u/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 2mM L-glutamine
(日 水 製 薬)を 加 え て使 用 し た. A群 は こ の 細 胞 浮 遊 液 にrIL-2(シ オ ノギ 製 薬)を1000u/mlの 濃 度 で 添 加 して 培 養 した. B群 はrIL-21000u/ml と さ らにconditioned medium (CoM) 20%を 添 加 して 培 養 し た. CoMは 当 科 に お け るLAK療 法 の 際 に11),担 癌 患 者 よ り分 離 した末 梢 血 単 核 細 胞 をrIL-2 1000u/mlと と も に3日 間 培 養 し た 溶 液 の上 清 液 で あ る.ま た こ の 群 は,増 殖 率 が 低 下 した と きにphytohemagglutinine P (PHA) (Difco社)を 添 加 し培 養 を 継 続 した.培 養 は5 % CO2下, 37℃ で行 な っ た. 1週 間 毎 に 培 養 液 を 交 換 し細 胞 数 を算 定 した 後,も との 濃 度 に 調 整 し再 び培 養 を 行 な っ た.培 養 は 増 殖 不 能 と な る ま で 続 け,増 殖 率 は 培 養 期 間 中 の 細 胞 の全 増 殖 倍 数 をexpansion index (EI)と して 表 示 した.
2. 細 胞 傷 害 活 性 の 測 定
TILの 細 胞 傷 害 活 性 の 測 定 は4時 間51Cr release assayに て行 な っ た. NK (natural kill er)活 性 の 標 的 細 胞 と し てK562(ヒ ト慢 性 骨 髄 性 白 血 病 由 来 株)とLAK活 性 の 標 的 細 胞 として Daudi細 胞(ヒ トlymphoma由 来 株)を 用 い た. 標 的 細 胞 を100μCiのNa251CrO4 (New England Nuclear社)で37℃, 1時 間 標 識 しPBSに て3 回 洗 浄 後RPMI-1640で5×104/mlに 調 整 し, さ らに96穴 マ イ クロ プ レー ト(Corning社)に100 μlず つ 分 注 し た. effector/target ratioが20, 10, 5の3段 階 に な る よ うにTIL浮 遊 液 を100μl ず つ 加 え, 5% CO2下, 37℃ で4時 間 培 養 し た 後,上 清 を100μl回 収 し ガ ン マ シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に て 測 定 し た.測 定 は 全 てtriplicate で 行 い% cytotoxicityを 以 下 の 式 に て 算 出 し た. %cytotoxicity ×100 spontaneous cpmは 標 的 細 胞 の み 培 養 し た 上 清 の 放 射 線 活 性 で あ り, total cpmは 標 的 細 胞 の 全 放 射 線 活 性 で あ る.細 胞 傷 害 活 性 は1週 間 毎 に 測 定 し た.な お 細 胞 傷 害 活 性 はProssら の 式 に よ り12), 30% lytic unit (LU)/106cellに 換 算 し 表 示 し た. 1LUは5×104個 の 標 的 細 胞 の30 %を 溶 解 す る た め に 必 要 なeffector細 胞 数 と し て 決 定 さ れ, 106個 のeffector細 胞 数 あ た りのLU を 計 算 し た. 3. リ ン パ 球 表 面 抗 原 の 解 析 B群 の 非 切 除 乳 癌 癌 性 胸 膜 炎 症 例 に つ い て TILの 表 面 抗 原 の 解 析 をflow cytometry法 で 行 な っ た.モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 は 抗OKT3 (CD3),抗OKT8 (CD8),抗OKT4 (CD4)(以 上
Ortho-mune;オ ル ソ ダ イ ア グ ノ ス テ ィ ク シ ス テ ム 社),お よ び 抗Leu7 (CD57),抗Leu11 (CD16), 抗Leu15 (CD11),抗Leu19 (CD56),抗HLA-DR,抗IL-2R (CD25) (以 上Beckton-Dikinson 社)を 用 いsingleお よ びtwo colour解 析 を 行 な っ た.
図1 腫 瘍 内 浸 潤 リ ン パ 球(TIL)の 増 殖 率(A群) rIL-21000u/ml単 独 培 養 に よ るTILの 増 殖 率 で あ る. 3症 例 共 に3wか ら7wで 死 滅 し expansion index (EI)は1を 越 え な か っ た.
腫 瘍 内浸 潤 リンパ球 の培養 と細 胞傷 害活性
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4. 抗 パ ー フ ォ リ ン抗 体 に よ る免 疫 染 色
図2 腫 瘍 内 浸 潤 リ ン パ 球(TIL)の 増 殖 率 と 細 胞 傷 害 活 性(肺 癌)
rIL-21000u/mlとconditioned medium (CoM) 20%を 添 加 して 培 養 し た 肺 癌 由 来TILの 増 殖 率(上 段)と 細 胞 傷 害 活 性(下 段)の 時 間 的 推 移 で あ る. TILは 培 養 開 始 よ り良 好 な 増 殖 を 示 し た. 9wで 増 殖 率 が 低 下 し た た めPHA 10μg/mlを 添 加 し た と こ ろ,再 び 立 ち 上 が り14wま で 増 殖 しEIも23912に 達 し た.細 胞 傷 害 活 性 は 分 離 直 後 のTILは 示 さ な か っ た が, 1w目 よ り認 め ら れ た.活 性 のpeakはK562 に 対 し て は2wで152LU, Daudiに 対 し て は3wで19LUで あ っ た.そ の 後 そ れ ぞ れ7wと4wで 活 性 は 消 失 し た が, PHAを 添 加 し た 後 にK562に 対 し て の み 活 性 を 示 し た. B群 の 非 切 除 乳 癌 癌 性 胸 膜 炎 症 例 に つ い て, TILの 抗 パ ー フ ォ リ ン抗 体(順 天 堂 大 学,奥 村 教 授 よ り供 与)に よ る免 疫 染 色 をABC法 に て 行 な っ た. 1×106/mlに 調 整 し たTIL浮 遊 液 よ り 1プ レパ ラー トあ た り100μlを,サ イ トス ピ ンに て ス ラ イ ドグ ラ ス 上 に 遠 沈 し標 本 を 作 成 し た. 冷 ア セ トン に3分 間, 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドに1分 間 浸 し 固 定 し た 後, 50mMト リス 塩 酸 緩 衝 液(pH 7.6)で 洗 浄 し, 0.5%過 ヨ ウ 素 酸 溶 液 に て10分 間 処 理 し た.洗 浄 の 後 ウ サ ギ 血 清(ブ ロ ッ キ ン グ 抗 体)で 処 理 し, anti-mouse perforin rat monoclonal antibodyを 室 温 で1時 間 反 応 さ せ た.洗 浄 後biotinylated rabbit anti-rat IgG (Vector Laboratories社)と30分 間 反 応 さ せ 洗 浄 し,さ ら にavidin-biotinylated peroxidase
complex (Vector Laboraories社)と1時 間 反 応 させ た.洗 浄 後, diaminobenzidine (DAB)に て 発 色 さ せ,核 染 色 をMeyer-Hematoxilinに て 行 な っ た.染 色 は1週 間 毎 に 行 な っ た. 結 果 1. TILの 増 殖 率 の 検 討 1) A群TILの 増 殖 率(図1) 図3 腫 瘍 内 浸 潤 リ ン パ 球(TIL)の 増 殖 率 と細 胞 傷 害 活 性(大 腸 癌 肝 転 移)
rIL-21000u/mlとconditioned medium (CoM) 20%を 添 加 し て 培 養 し た 大 腸 癌 肝 転 移 巣 由 来TILの 増 殖 率(上 段)と 細 胞 傷 害 活 性(下 段)の 時 間 的 推 移 で あ る. TILは 培 養 開 始 よ り良 好 な 増 殖 を 示 し た. 5 w, 7w, 13wにPHAを 添 加 し た と こ ろ13wま で 増 殖 を 続 けEIも11129に 達 し た.細 胞 傷 害 活 性 は分 離
直 後 のTILは 示 さ な か っ た が, 1w目 よ り認 め ら れ た.活 性 のpeakはK562に 対 し て は3wで185LU, Daudiに 対 し て は2wで11LUで あ っ た.そ の 後 そ れ ぞ れ5wと4wで 活 性 は 消 失 し た が, PHAを 添 加
した 後 にK562に 対 して の み 活 性 を 示 し た.
CMにrIL-2を1000u/ml添 加 し培 養 し た. 胆 嚢 癌,乳 癌 症 例 と も に ほ ぼ 同 様 の 経 過 を た ど
り,細 胞 数 は1 week (w)で 約50%, 3wで 約75 %に な り5お よび7wで 死 滅 した.胃 癌 肝 転 移 症
腫 瘍 内浸 潤 リンパ 球 の培養 と細胞傷 害 活性
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例 で は1wで 約1.5倍, 2wで 約0.5倍 と な り3w で 死 滅 し た.以 上 の よ うに どの 症 例 もexpansion index (EI)は1を 越 え な か っ た. 2) B群TILの 増 殖 率(図2, 3, 4上 段) 図4 腫 瘍 内 浸 潤 リ ン パ 球(TIL)の 増 殖 率 と 細 胞 傷 害 活 性(乳 癌 癌 性 胸 膜 炎)rIL-21000u/mlとconditioned medium (CoM) 20%を 添 加 し て 培 養 した 乳 癌 癌 性 胸 水 由 来TILの 増 殖 率(上 段)と 細 胞 傷 害 活 性(下 段)の 時 間 的 推 移 で あ る. TILは 培 養 初 期 の 増 殖 率 が 低 か っ た た め に, 3 wでPHAを 添 加 し た と こ ろ14wま で 増 殖 を 続 け た. EIは53で あ っ た.細 胞 傷 害 活 性 は 分 離 直 後 のTIL は 示 さ な か っ た が, 1w目 よ り認 め ら れ た.活 性 のpeakはK562に 対 し て は3wで13LU, Daudiに 対
し て は2wで3.5LUで あ っ た.そ の 後 そ れ ぞ れ5wと4wで 活 性 は 消 失 し た. CMにrIL-21000u/mlとCoMを20%添 加 し培 養 し た.こ の 群 のTILは 著 明 な 増 殖 を示 し た.肺 癌 症 例 で は 培 養 開 始 よ り著 明 な 増 殖 を示 し1wで6倍,そ の 後 も2か ら3倍 の 増 殖 率 を維 持 し た. 9wで 増 殖 率 が 落 ち た た め にPHAを 10μg/ml添 加 し た と こ ろ再 び 立 ち 上 が り14wま で 培 養 可 能 で あ っ た. 14wま で のEIは23912で あ っ た(図2上).大 腸 癌 肝 転 移 症 例 で は 培 養 開 始 よ り2か ら3倍 の 増 殖 率 を示 した. 5wで 増 殖 率 が 落 ち た た めPHAを6wで1μg/ml, 7wで 10μg/ml添 加 し た と こ ろ, 3か ら4倍 の 増 殖 率 を示 し た.し か し,再 度 増 殖 率 の低 下 した13wで PHAを 添 加 して も増 殖 は 認 め られ なか っ た. 13 wま で のEIは11129で あ っ た(図3上).乳 癌 症
例 で は 培 養 初 期 の 増 殖 率 が1.1か ら2倍 と低 か っ た た め に, 3wでPHAを10μg/ml添 加 し た と こ ろ, 9wま で は 増 殖 率 も立 ち上 が っ たが そ の 後 は低 下 し14wで 増 殖 不 能 とな っ た. 14wま でのEI は53で あ っ た(図4上).以 上 の よ うにA群 よ り もB群 の ほ うが は るか に 増 殖 率 が 高 くEIも53 か ら23912が 得 ら れ た. 2. TILの 細 胞 傷 害 活 性 の 検 討(図2, 3, 4下 段) B群 のTILに つ い て細 胞 傷 害 活 性 の 時 間 的 推 移 を4時 間51Cr release assayを 用 い て 検 討 し た.全 て の 症 例 でTIL分 離 直 後 の細 胞 傷 害 活 性 は 認 め られ ず,培 養1w目 よ り活 性 が 認 め られ 始 め た.肺 癌 症 例 で は 活 性 のpeakがK562に 対 し て は2wで152LU, Daudiに 対 して は3wで 19LUで あ りそ れ ぞ れ7wと4wで 活 性 は消 失 し た.そ の 後PHAを 加 え た1w後 の10wにK562 に対 す る活 性 のみ 示 し10LUで あ っ た(図2下). 大 腸 癌 肝 転 移 症 例 で は 活 性 のpeakがK562に 対 し て は3wで185LU, Daudiに 対 し て は2w で11LUで あ りそれ ぞ れ5wと4wで 活 性 は 消 失 し た.そ してPHAを 加 え た 後 の8wと13wに K562に 対 す る活 性 の み 示 し そ れ ぞ れ10LUと4 LUで あ っ た(図3下).乳 癌 症 例 で は 活 性 の
peakはK562に 対 し て は3wで13LU, Daudi に 対 して は2wで3.5LUで あ りそ れ ぞれ5wと4 wで 活 性 は 消 失 した(図4下).つ ま りTILの 細 胞 傷 害 活 性 は2∼3wに か け てpeakと な り4 ∼7wで 消 失 し た .そ してPHAの 刺 激 に よ り TILはK562に 対 して の み 再 び 細 胞 傷 害 活 性 を 示 し た. 3. リン パ 球 表 面 抗 原 の 解 析 B群 の 乳 癌 症 例 に つ い て, 1週 間 毎 にflow cytometry法 に よ り リン パ 球 表 面 抗 原 の 解 析 を 行 な っ た. 1) CD3, CD4, CD8 (図5) 分 離 直 後 のTILはCD3+T細 胞 が 主 体 で あ り (91.9%),培 養 期 間 を通 して 漸 増 し14wに は98.9 %に 達 し た.そ し てCD4/CD8細 胞 比 は,培 養 開 始 時 は そ れ ぞ れ75.4%, 13.9%とCD4細 胞優 位 で あ った が,培 養 す るに 従 いCD4は 漸 減 しCD8 細 胞 は 漸 増 し た.そ の 後7wで 逆 転 し14wで は CD4細 胞25.5%, CD8細 胞68.1%とCD8細 胞 優 位 と な っ た. 2) CD8+CD11-, CD8+CD11+ (図6) 図5 CD3+, CD8+, CD4+細 胞 の 経 時 的 変 化 分 離 直 後 のTILはCD4優 位 のCD3+T細 胞 主 体 で あ っ た が,培 養 の 経 過 と と も に7wで 逆 転 しそ の 後 はCD8優 位 と な っ た. い わ ゆ るcytotoxic T cellで あ るCD8+CD11-とsuppressor T cellで あ るCD8+CD11+に つ
腫 瘍 内浸潤 リンパ球 の培 養 と細 胞傷 害 活性
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いて み た. CD8+CD11-は 分 離 直 後12.1%で あ っ た が 培 養 と と もに 増 加 し9wでpeakの87.3% と な り,そ の 後 漸 減 し14wで66.7%と な っ た. CD8+CD11+は 分 離 直 後1.8%で あ り漸 増 し8w でpeakに 達 し16.3%と な っ た が, 9w以 降 ほ と ん ど 認 め られ な く な っ た. 3) HLA-DR(図7) 活 性 化 の 指 標 で あ るDR+細 胞 につ い て 経 過 を み た.分 離 直 後TILのDR+細 胞 は21.5%で あ り, TIL内 に 活 性化 さ れ た細 胞 群 が 存 在 す る こ とが 認 め られ た.そ の後1wで40.8%と な っ たが 3wで21.3%と 減 少 し た. 3wで 培 養 液 にPHA を10μg/ml加 え た後 は 漸 増 し7wでpeakの78.1 %に 達 した.そ れ 以 降 漸 減 し14wで10.4%と な っ た. 4) CD3+DR+, CD8+DR+, CD4+DR+(図8) 活 性 化 細 胞 の 指 標 で あ るDR+細 胞 をCD3, CD8とCD4に つ い て み た.分 離 直 後 のDR+細 胞21.5%の う ちCD3+は17.7%で あ り,活 性 化 細 胞 の82.3%はCD3+T細 胞 で あ っ た. CD3+ DR+は1wで36.5%と な りそ の 後 漸 減 し3wで 18.0%と な った. 3wで 培 養 液 にPHAを10μg/ ml加 え た後 は 漸 増 し7wでpeakの78.0%に 達 した.そ れ 以 降 漸 減 し14wで10.4%と なっ た.つ ま り培 養 経 過 中DR+細 胞 は ほ とん どCD3+と な っ た. 次 に 分 離 直 後 のCD8+DR+細 胞 は7.2%, CD4+ DR+細 胞 は8.3%で あ り そ れ ぞ れ 漸 増 しpeakは 7wの51.6%, 5wの33.1%で あ っ た.そ の 後 は 漸 減 し14wに は そ れ ぞ れ1.1%, 3.0%と な っ た. 5) Leu7 (CD57), Leu11 (CD16), Leu19 (CD56)(図9)
NK細 胞 の マ ー カ ー で あ るLeu7, Leu11, Leu19 に つ い て み る と 分 離 直 後 は そ れ ぞ れ4.9%, 3.2 %, 6.7%で あ っ た. Leu7, Leu11は 培 養 期 間 を 通 し て 増 加 せ ず 横 ば い で 経 過 し た. Leu19は 6w以 降 急 増 し 始 め9wでpeakの74.8%と な り, そ の 後 は 漸 減 し14wで60.1%と な っ た. 6) Leu11-Leu19+, Leu11+Leu19+(図10) Leu11-Leu19+, Leu11+Leu19+は 分 離 直 後 は そ れ ぞ れ5.6%, 1.1%で あ っ た. Leu11-Leu19+ は6wま で 横 ば い で 増 加 せ ず,そ の 後 急 増 し9w でpeakの71.9%と な り14wで58.8%と な っ た. Leu11+Leu19+は 増 加 せ ず 横 ば い で14wま で 経 過 し た. 7) IL2-R (図11) 図6 CD8+CD11-, CD8+CD11+細 胞 の 経 時 的 変 化 分 離 直 後 のCD8+CD11-細 胞 は12.1%で あ っ た が 培 養 と と も に 漸 増 し9wでpeakに 達 し,そ の 後 漸 減 した. CD8+CD11+は 分 離 直 後1.8%と 非 常 に 少 な く,培 養 中 もほ ぼ 横 ば い の 経 過 を 示 し た. IL-2の レ セ プ ター に つ い て み る と,分 離 直 後 は1.2%で あ り培 養 に 伴 い 増 加 し2wで17.1%, 3wで8.9%と な っ た. 3wでPHAを 加 え て か ら は82.0%と 急 増 し そ の 後 漸 減 し14wで3.3%と
な っ た.
図7 DR+細 胞 の 経 時 的変 化
活 性化 の 指標 で あ るDR+細 胞 はTIL分 離 直後21.5%認 め られ た. PHA添 加 後 漸 増 し7wでpeakに 達 した後 漸 減 した. 図8 CD3+DR+, CD8+DR+, CD4+DR+細 胞 の 経 時 的 変 化 DR+細 胞 をCD3, CD8とCD4に つ い て み た.分 離 直 後 のDR+細 胞 の 比 率 はCD8, CD4共 に ほ ぼ 同 じ で あ っ た.培 養 と と も にCD8は 漸 増 し, 7wでpeakに 達 し て 漸 減 し た が, CD4は 二 相 性 の 増 加 を 示 し そ のpeakは3wと5wに あ っ た. 4. 抗 パ ー フ ォ リン抗 体 に よ る免 疫 染 色(図12) B群 の 乳 癌 症 例 に つ い て,分 離 培 養 し たTIL を1w毎 にサ イ トス ピ ン を 用 い て プ レパ ラー トを 作 成 し た後,抗 パ ー フ ォ リン 抗 体 に て 免 疫 染 色 を行 な っ た.検 鏡 は200倍 で 行 な っ た.分 離 直 後 のTILで は パ ー フ ォ リン は ほ とん ど染 色 さ れ な か っ た.そ の 後 培 養 の 経 過 と と も に パ ー フ ォ リ ン陽 性 細 胞 の 比 率 の 増 加 と,個 々 の 細 胞 の 染 色 され るパ ー フ ォ リン の 量 の 増 加 が 認 め られ3wで peakに 達 し た.こ れ は 細 胞 傷 害 活 性 のpeakが 3wで あ っ た こ と と相 関 す る(図4下).そ の 後
腫瘍 内浸 潤 リンパ球 の培 養 と細 胞傷 害活 性
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徐 々 に パ ー フ ォ リン 陽 性 細 胞 の 減 少 と,個 々 の 細 胞 の パ ー フ ォ リン量 の 減 少 が 認 め られ, 10wに は パ ー フ ォ リン は 染 色 され な くな っ た.図12に は そ れ ぞ れ 分 離 直 後, 2w, 3w, 7w, 10wの 免 疫 染 色 を 示 す.図9 Leu7+, Leu11+, Leu19+細 胞 の 経 時 的 変 化
NK細 胞 の マ ー カ ー で あ るLeu7, Leu11, Leu19に つ い て み た. Leu7, Leu11は 培 養 期 間 を 通 し て 増 加 せ ず ほ ぼ 横 ば い を 示 し た. Leu19は 二 相 性 の 増 加 を 示 し た. 2wに ま ず 最 初 のpeakに 達 し,そ の 後
6wよ り急 増 し9wで 再 びpeakに 達 し た 後 漸 減 し た.
図10 Leu11-Leu19+, Leu11+Leu19+細 胞 の 経 時 的 変 化
Leu11-Leu19+は 二 相 性 の 増 加 を 示 し,そ のpeakは2wと9wで あ っ た. Leu11+Leu19+は 培 養 期 間 を 通 して 全 く増 加 し な か っ た.
考 察
従 来 よ り,腫 瘍 の 間 質 に 浸 潤 して い る リン パ 球 の 程 度 と予 後 に は 相 関 が あ る こ と が 知 ら れ て お り,腫 瘍 に 対 す る 宿 主 の 免 疫 学 的 応 答 と考 え
ら れ て き た7,8).こ れ ら 腫 瘍 内 浸 潤 リ ン パ 球 (tumor infiltrating lymphocytes; TIL)を 分 離 し, rIL-2で 培 養 活 性 化 し た 後 に体 内 に 戻 し て 抗 腫 瘍 活 性 を期 待 す るTIL療 法 の 基 礎 的,臨 床 的 研 究 が 盛 ん に 行 な わ れ て い る.こ れ は 末 梢 血 単 核 細 胞 由 来 のLAK細 胞 と違 い, TILが 免 疫 学 的 応 答 を示 して い る選 ば れ た細 胞 集 団 で あ り, 方 法 に よ っ て は優 れ た抗 腫 瘍 活 性 を期 待 で き る の で は な い か と考 え られ て い る か ら で あ る.す で にRosenbergら は 腫 瘍 組 織 よ り分 離 しrIL-2と 共 に 培 養 したTILがLAK細 胞 の50∼100 倍 の 抗 腫 瘍 活 性 を 示 した と し9), Itohら は 悪 性 黒 色 腫 に お い て,新 鮮 分 離 癌 細 胞 に 対 す る特 異 的 な 抗 腫 瘍 活 性 を認 め た と報 告 して い る10).そ して こ れ らTILの 基 礎 的 研 究 が 進 む に つ れ て,臨 床 応 用 つ ま り活 性 化TILの 体 内移 入 療 法 の報 告 も 散 見 され る よ う に な っ た13-15). 図11 IL-2R+細 胞 の 経 時 的 変 化 IL-2Rは 分 離 直 後 ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た が,培 養 と と も に2wま で 漸 増 し た. 3wでPHAを 添 加 し た と こ ろ 急 増 し4wでpeakの82.0%に 達 し,そ の 後 急 減 し9wで ほ とん ど 認 め ら れ な く な っ た. 図12(a) 分 離 直 後 抗 パ ー フ ォ リン 抗 体 に よ るTILの 免 疫 染 色(×100) 分 離 直 後 のTILで は パ ー フ ォ リ ン は ほ とん ど染 色 さ れ て い な い. 図12(b) 培 養2w後 抗 パ ー フ ォ リ ン 抗 体 に よ るTIL の 免 疫 染 色(×100) パ ー フ ォ リ ン 陽 性 細 胞 の 出 現 が 認 め られ る. 今 回TILの 性 状 を 明 ら か に す る た め に,各 種 癌 よ りTILを 分 離 しrIL-2存 在 下 に 培 養 した. そ して 培 養 条 件,増 殖 率,細 胞 傷 害 活 性,リ ン パ 球 表 面 マ ー カー,パ ー フ ォ リン に つ い て 検 討 し た.
腫 瘍 内浸 潤 リンパ 球 の培養 と細胞傷 害 活性
23
図12(c) 培 養3w後 抗 パ ー フ ォ リ ン 抗 体 に よ るTIL の 免 疫 染 色(×100) パ ー フ ォ リン 陽 性 細 胞 の 比 率 の 増 加 と,個 々 の 細 胞 の 染 色 さ れ る パ ー フ ォ リ ン の 量 の 増 加 がpeakに 達 す る. 図12(d) 培 養7w後 抗 パ ー フ ォ リン 抗 体 に よ るTIL の 免 疫 染 色(×100) パ ー フ ォ リン 陽 性 細 胞 の 比 率 の 減 少 と,個 々 の 細 胞 の 染 色 さ れ る パ ー フ ォ リ ン の 量 の 減 少 が 認 め られ る. 図12(e) 培 養10w後 抗 パ ー フ ォ リ ン 抗 体 に よ るTIL の 免 疫 染 色(×100) パ ー フ ォ リ ン 陽 性 細 胞 は 認 め ら れ な くな っ た.は じめ にTILの 培 養 に 関 し て, rIL-2 1000u/ ml単 独(A群)とrIL-2 1000u/mlにLAK細 胞 培 養 液 の 上 清 で あ るCoMを20%添 加 した も の (B群)と の 増 殖 率 を 比 較 した. A群 で は す べ て 7w以 内 にTILは 死 滅 しEIも1を 越 え な か っ た が, B群 で は 良 好 な増 殖 を示 し14wま で 増 殖 し EIも53か ら23912が 得 られ た.そ して 培 養 初 期 に お い て も 良好 な 立 ち上 が り を 示 した.こ の よ う にCoMを 添 加 し た培 養 液 の 方 が 高 い 増 殖 率 が 得 られ た 理 由 は, CoMに 含 ま れ て い るIL-2 以 外 のcytokineの 関 与 が 考 え られ る.実 際IL-2とIL-4を 併 用 し たTILの 培 養 に お い て, IL-2単 独 の 場 合 と比 べ て 移 入 細 胞 数 が6.5倍 に 増 加 した との 報 告 が あ り16),その 他interferon (IFN)
の 関 与 も考 え られ る.分 離 直 後 のTILは 反 応 性 が 低 下 し て お り, Miescherら は 限 界 希 釈 法 に て TILのsingle cellレ ベ ル で のPHAに 対 す る 反 応 性 を調 べ た 結 果,末 梢 血 単 核 球 と比 べ て1/ 10か ら1/100の 増 殖 性 しか 示 さ な か っ た と し て い る.ま た しば しばIL-2に 対 し て も増 殖 を 示 さ な か っ た と し,こ の 低 反 応 性 は 腫 瘍 の 産 生 す る抑 制 物 質 に よ る 可 能 性 を 示 唆 して い る17). 今 回 の 実 験 よ り反 応 性 の 低 下 したTILは, IL-2を 含 め た 各 種 のcytokineに よ る 刺 激 に よ って, IL-2単 独 の 場 合 よ りも よ り高 い増 殖 性 を示 した と考 え ら れ る.し か しBelldegrunら は35例 の 腎 癌 の 患 者 よ り分 離 したTILの うち 最 初 の5例 を,正 常 な ドナ ー の 末 梢 血 単 核 球 をrIL-2 1000 u/mlで3日 間 培 養 して得 られ た 溶 液 を20%添 加 し た 溶 液 で 培 養 した が, rIL-2単 独 の 場 合 と差 は な か っ た と して い る.そ し て こ の 実 験 でTIL は,全 く増 殖 を示 さ な か っ た もの か ら500000倍 以 上 の 増 殖 率 を示 し た も の ま で 様 々 で あ っ た と 報 告 して い る18).こ の よ うなTILの 増 殖 率 の 幅 は,腫 瘍 の 種 類 や,腫 瘍 か ら の 抑 制 因子,そ し てTILの も と も との 量 や 性 質,培 養 液 の 種 類 な ど に 依 っ て い る と考 え ら れ る. 今 回CoMを 添 加 して 培 養 し た群 に お い て, 増 殖 率 が 低 下 した 時 期 にPHAを 添 加 し た と こ ろ増 殖 率 の 再 上 昇 を み た.分 離 直 後 のTILは PHAに 対 す る反 応 性 が 低 下 し て い るが,一 度 増 殖 を 始 め た 後 はPHAに 反 応 す る た め,増 殖 率
が 低 下 し た と き にPHAを 添 加 し高 い 増 殖 率 を 得 るの は 有 効 な 方 法 で あ る と思 わ れ る. Schoof ら はTILが,高 濃 度 のrIL-2で 培 養 経 過 中 に rIL-2に 対 し て 反 応 し な くな る理 由 と して, IL-2に 対 す る 高 親 和 性 レ セプ ター で あ るp55 chain (CD25)の 表 出 の 低 下 を指 摘 し,固 相 化 抗CD3抗 体 に よ る刺 激 を 行 な いCD25の 表 出 を促 し た 結 果,増 殖 も抗 腫 瘍 活 性 も再 活 性 され た と報 告 し て い る19).ま たTILをrIL-2と 抗CD3抗 体 と で 培 養 す る と,抗CD3抗 体 の 刺 激 に よ りT細 胞 表 面 のIL-2Rの 発 現 が 増 強 さ れ, rIL-2単 独 培 養 の 時 と 比 べ て 増 殖 率 が 約16倍 増 加 し た と の 報 告 も あ る20).今 回B群 の 乳 癌 症 例 に お い て, 3w に 抗CD3抗 体 で は な くPHAを10μg/ml添 加 した と こ ろ, CD25陽 性 細 胞 が8.9%か ら4wに は82.0%に 増 加 し,そ の 後 増 殖 率 が 上 昇 し た の も同 様 の 機 序 と考 え ら れ る(図11, 4上 段). 以 上 の よ うにTILを 培 養 す る場 合 にrIL-2単 独 の み な らず, IL-4な ど のcytokine,そ して 抗CD3抗 体 やPHAな ど と共 に 培 養 し た方 が 高 い 増 殖 率 を期 待 で き る と思 わ れ る.し か しrIL-2単 独 培 養 と は 異 な つ たcell populationの 増 殖 を促 進 す る 可 能 性 は あ る が,そ れ が 抗 腫 瘍 活 性 を も っ た 集 団 で あ れ ば 許 容 で き る もの と考 え られ る.ま た そ うで な くて も生 体 内 で はTILの 抗 腫 瘍 活 性 能 よ り も,増 殖 能 やlymphokineの 産 生 能 の 方 が 重 要 との 意 見 も あ る18). TILの 細 胞 傷 害 活 性 をK562とDaudiで 調 べ た .分 離 直 後 のTILは 全 ての 症 例 で細 胞 傷 害 活 性 は 認 め られ ず,培 養1wよ り活 性 が 認 め られ 始 め た.そ して活 性 は2wか ら3wに か けてpeak に 達 し, 4wか ら7wに か け て 消 失 し た.そ れ 以 降 は 全 く活 性 を認 め ず, PHAの 刺 激 に よ りK562 に 対 して の み 再 び 活 性 を示 した(図2, 3下 段). 以 上 の 事 よ りTILの 養 子 免 疫 療 法(adoptive immunotherapy)に お い て は,分 離 し たTILを 効 率 よ く培 養 し,よ り多 くの 細 胞 を2wか ら3w の 間 に 生 体 内 に 移 入 す る こ とが 大 切 で あ る と思 わ れ る.そ して 必 要 な 細 胞 数 が 得 ら れ な い 場 合 や,細 胞 傷 害 活 性 が低 い場 合 に はPHAや 抗CD3 抗 体 で 刺 激 して 培 養 す る方 法 が 有 効 で あ る と考 え られ る.今 回 検 討 した 細 胞 傷 害 活 性 はNK活 性(K562)とLAK活 性(Daudi)で あ り,非 特 異 的 な 抗 腫 瘍 活 性 で あ る が,あ ら ゆ る 研 究 者 の 関 心 事 は 自 己腫 瘍 組 織 か ら分 離 したTILか ら 自 己 腫 瘍 に 特 異 的 な 抗 腫 瘍 活 性 を 示 すcytotoxic T lymphocyte (CTL)を 誘 導 で き る か ど うか で あ ろ う.人 の 悪 性 腫 瘍 で は 悪 性 黒 色 腫 由 来 のTIL か らCTLが 得 られ た との 報 告 が 多 い10,21,22). Itohら は 悪 性 黒 色 腫 由 来 のTILをrIL-2 1000 u/mlで 培 養 し細 胞 傷 害 活 性 を解 析 した 結 果,自 己 の 癌 細 胞 に 対 し て 強 い 選 択 性 を示 すeffector 細 胞 が 得 ら れ た と して い る.そ して こ の 細 胞 の phenotypeはCD3+CD8+CD4-で あ り,こ の 活 性 はTCRα β ヘ テ ロ ダ イ マ ー に 対 す る抗 体 と HLA-ABC抗 原 に 対 す る抗 体 に よ っ て 抑 制 され る た め, T細 胞 の αβ レ セ プ タ ー を 介 し たMHC class Ⅰ拘 束 性 の 細 胞 傷 害 活 性 を 示 すCTLで あ る可 能 性 を示 唆 してい る21). Muulら は6例 の転 移 性 悪 性 黒 色 腫 の 患 者 よ り得 られ た 活 性 化TIL の うち3例 にTILに 自己 癌 に 特 異 的 な細 胞 傷 害 活 性 を 認 め,こ れ ら の 細 胞 は す べ てCD4+T細 胞 で あ った と して い る22).こ の よ うに 悪 性 黒 色 腫 か らCTLが 誘 導 され る理 由 と し てItohら21)は 免 疫 原 性 の 高 さ を推 測 して い る が,一 般 的 に そ の 他 の 腫 瘍 で はCTLは ほ とん ど誘 導 さ れ て い な い. Belldegrun18)は35例 の 腎 癌 患 者 よ り,ま た石 井 ら22)は腎癌,消 化 器 癌 な どの 各 種 固 形 癌46 例 よ り得 られ たTILに つ い て細 胞 傷 害 活 性 を調 べ た が,す べ て 非 特 異 的 活 性 で あ っ た と報 告 し て い る. TILはheterogeneousな 細 胞 集 団 で あ り,高 濃 度 のrIL-2で 培 養 す る とあ ら ゆ る 細 胞 が 活 性 化 され るた め, Balchら は低 濃 度 のrIL-2で 培 養 を試 み た が 必 ず し もCTLを 誘 導 で き な か っ た24). heterogeneousな 細 胞 集 団 で あ るTILの な か に は 自 己癌 細 胞 に 特 異 的 な 細 胞 傷 害 活 性 を示 すCTLや,非 特 異 的 な 活 性 を 示 す 細 胞 が 存 在 す る と考 え られ,そ れ ら を個 別 に 誘 導 す る 方 法 の 研 究 が 今 後 の 課 題 で あ る と考 え られ る. 乳 癌 癌 性 胸 膜 炎 の 症 例 に つ い て, TILの phenotypeの 時 間 的 推 移 を 検 討 し た.分 離 直 後 のTILは ほ とん どCD3+T細 胞 で, CD4細 胞 がCD8細 胞 の 約6倍 あ りCD4細 胞 優 位 で あ っ た. IL-2R (CD25)は ほ と ん ど発 現 さ れ て い ない が(1.2%), DR+細 胞 が21.5%で あ り,あ る程 度
腫瘍 内浸潤 リンパ球 の培養 と細 胞傷 害 活性
25
活 性 化 さ れ て お り,そ の82.3%ま で がCD3で あ っ た.次 にcytotoxic T cellと さ れ るCD8+ CD11-とsuppressor T cellと さ れ るCD8+ CD11+は,そ れ ぞ れ12.1%と1.8%で あ っ た.そ し てNK細 胞 の マ ー カ ー で あ るLeu7, Leu11, Leu19は そ れ ぞ れ4.9%, 3.2%, 6.7%で あ っ た. そ の 後 培 養 の 経 過 と と も に, CD3は 漸 増 し プ ラ トー に 達 し, CD4は 減 少 しCD8は 増 加 し7w で 逆 転 し た.そ の 後 はCD8細 胞 優 位 に な り, 14 wに はCD8細 胞 がCD4細 胞 の 約3倍 と な っ た. IL-2Rは 培 養 と と も に 漸 増 し た が3wで8.9%に な り, PHAを 添 加 し た 後 は4wで82.0%の 発 現 率 を 示 し,そ の 後 急 減 し14wに は ほ と ん ど 発 現 さ れ な く な っ た(3.3%). DRも 培 養 と と も に 漸 増 し た が3wで21.3%と な り, PHAを 添 加 し た 後 は7wま で 漸 増 し78.1%に 達 し た 後 に 漸 減 し14w に は10.4%と な っ た.つ ま りPHAを 添 加 し た 後 の 変 化 は, IL-2Rは 発 現 率 が 急 激 に 上 昇 し, そ の 後 急 激 に 低 下 し た が, DRは 緩 徐 に 上 昇 し 緩 徐 に 低 下 し た.そ し てIL-2RとDRの 発 現 率 の 上 昇 し て い る 時 期 と,増 殖 率 の 上 昇 し て い る 時 期 は ほ ぼ 一 致 し て い た.次 にLeu7, Leu11, Leu19は2wで そ れ ぞ れ13.7%, 14.3%, 19.8 %と 最 初 のpeakに 達 し た が5wで す べ て3% 以 下 に な り, Leu19の み6w以 降 立 ち 上 が り9w で74.8%のpeakに 達 し14wで60.1%に な っ た. 分 離 直 後 のTILのphenotypeはCD3+T細 胞 主 体 で あ る こ と は 自 験 例 を 含 め 諸 家 の 報 告 と 一 致 す る10,18,19,21-23,25-28) .し か しCD3+T細 胞 の subsetに つ い て はCD8優 位 と す る 報 告10,19,25-27) や, CD4優 位 と す る 報 告18,22)が あ る.次 に 長 期 培 養 時 のTILのsubsetはCD8優 位10,19,26,27), ま た はCD4優 位18,22)で あ る と す る 報 告 や,症 例 ま た は 腫 瘍 に よ っ て 一 定 し て い な い と の 報 告 が あ る21,23,24,28).つ ま りTILのT細 胞subsetは, 生 体 内 で の 腫 瘍 に 対 す る 免 疫 応 答 性 や 培 養 条 件 に よ っ て 影 響 を 受 け て い る も の と 考 え ら れ る. TILの 抗 腫 瘍 活 性 を 担 当 す る 細 胞 のpheno typeに つ い て, CTLが 誘 導 さ れ た と さ れ る 悪 性 黒 色 腫 の 系 で, Itohら はCD8+T細 胞21)と, Muulら はCD4+T細 胞22)で あ っ た と 報 告 し て い る.次 に 非 特 異 的 な 抗 腫 瘍 活 性 を 示 し た 系 に お い て, Heoら は16例 のsquamous cell carcinoma(SCC)と4例 のnon-SCC由 来 のTILよ り,最 も高 い 増 殖 率 を 示 す 細 胞 群 はCD3+Leul9-で あ る が 抗 腫 瘍 活 性 は ほ とん ど 示 さ ず, sortingに よ る 解 析 で はCD3-Leu19+ and/or CD3+Leu19+ が 抗 腫 瘍 活 性 を 示 し形 態 学 的 に はIarge granu lar lymphocytes (LGL)で あ っ た と報 告 して い る29).ま たTakagiら は 原 発 性 肝 癌 由 来 のTIL に お い て,抗 腫 瘍 活 性 を示 し た の はCD3抗 原 に 関 係 な くLeu19抗 原 陽 性 細 胞 で あ っ た と して い る.そ し て 培 養 に お け るCD3+Leu19+細 胞 群 の 頻 度 は 二 相 性 で 最 初 のpeakは30か ら60日 の 間 に あ り,こ れ は 抗 腫 瘍 活 性 の 増 強 した 時 期 と一 致 し,二 度 目 のpeakは60日 以 降 に あ り,こ れ は 抗 腫 瘍 活 性 と は 関 係 な か っ た と報 告 し て い る30).こ の 所 見 は 自 験 例 と一 致 して い る. Balchら は120例 の 悪 性 腫 瘍 由 来 のTILに つ い て 分 析 し た結 果, 3種 類 のeffector細 胞 を確 認 し て い る.つ ま り悪 性 黒 色 腫 由 来 のeffector 細 胞 はCD3+CD16-(Leu11-)でMHC拘 束 性 の 抗 腫 瘍 活 性 を 示 し,腎 癌 由 来 の そ れ はCD3-CD16+のNK細 胞 でMHC非 拘 束 性 の 高 い 抗 腫 瘍 活 性 を示 し た.そ して 悪 性 黒 色 腫 以 外 の 癌 由 来 の そ れ はCD3+CD16-でMHC非 拘 束 性 の 中 等 度 の 抗 腫 瘍 活 性 を示 した と報 告 して い る24). 今 回 の 長 期 培 養 にお い て最 も多 くな ったsubset はCD3+Leu11-Leu19+で あ り,こ れ はLanier ら31)の云 う標 的 細 胞 を認 識 しNK感 受 性 のLGL で あ るが,こ の 時 期 に は 細 胞 傷 害 活 性 を 示 さ な か っ た. キ ラー 細 胞 の 細 胞 傷 害 因 子 と し て パ ー フ ォ リ ン, lymphotoxin, tumor necrosis factor (TNF)等 が 知 られ て い る が32,33),今回 の 実 験 で は パ ー フ ォ リン に着 目 し,培 養TILを 経 時 的 に 免 疫 染 色 し た.パ ー フ ォ リンはNK細 胞 や 細 胞 傷 害 性T細 胞 の 細 胞 質 顆 粒 内 に 存 在 し,キ ラー 細 胞 が 標 的 細 胞 に 結 合 し た際 に 脱 顆 粒 が 起 こ り, 放 出 され た パ ー フ ォ リ ンが 標 的 細 胞 の 膜 表 面 に ドー ナ ツ状 の 穴 を形 成 し,細 胞 を傷 害 す る と考 え られ て い る34,35).奥 村 ら に よ り抗 マ ウ スパー フ ォ リ ン抗 体 が 作 成 さ れ,こ れ が ヒ トパ ー フ ォ リ ン と交 差 反 応 す る た め36),免疫 染 色 が 可 能 とな っ た.今 回 酵 素 抗 体 法 を用 い て培 養TILに 免 疫 染 色 を行 な っ た.分 離 直 後 のTILで は パ ー フ ォ リ
ン は ほ と ん ど染 色 さ れ な か っ た.そ の 後 培 養 の 経 過 と と もに パ ー フ ォ リ ン 陽 性 細 胞 の 比 率 の 増 加 と,個 々 の 細 胞 の 染 色 さ れ る パ ー フ ォ リン の 量 の 増 加 が 認 め ら れ3wでpeakに 達 した.こ れ は 細 胞 傷 害 活 性 のpeakが3wで あ っ た こ と と相 関 す る.そ の 後 徐 々 に パ ー フ ォ リン 陽 性 細 胞 の 減 少 と,個 々 の 細 胞 の パ ー フ ォ リン 量 の 減 少 が 認 め ら れ, 10wに はパ ー フ ォ リン は 染 色 され な く な っ た.こ の 時 期 に は 細 胞 傷 害 活 性 は 認 め ら れ ず,培 養 の 経 過 を通 して 染 色 さ れ るパ ー フ ォ リンの 量 と細 胞 傷 害 活 性 は ほぼ 相 関 して い た. つ ま りTILの 細 胞 傷 害 機 序 に パ ー フ ォ リ ンが 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 結 論 各 種 癌 のTILをrIL-2に て 培 養 し た.培 養 液 にCoMを20%添 加 す る こ と に よ っ て 高 い増 殖 率 を得 る こ とが で き た.ま た 増 殖 率 が 低 下 し た 時 に, PHAを 添 加 す る こ とに よっ て 増 殖 率 を 維 持 す る こ とが で き た.細 胞 傷 害 活 性 は2wか ら 3wに か け てpeakに 達 し, 4wか ら7wに か け て 消 失 した. TILのphenotypeは ほ とん どが CD3+T細 胞 で,分 離 直 後 はCD4優 位 で あ っ た が,培 養 と と も にCD8優 位 と な っ た.ま たIL-2RとDRの 陽 性 率 と増 殖 率 の 高 い 時 期 は ほ ぼ 一 致 し て い た .そ してTILの 細 胞 傷 害 機 序 に パ ー フ ォ リン が 関 与 して い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た . TILの 養 子 免 疫 療 法 に お い て は, rIL-2の み な らずCoMやPHAに て 高 い 増 殖 率 を得 て, 2wか ら3wの 時 期 に 生 体 内 に移 入 す るの が 望 ま しい. TILはrIL-2で 培 養 す る と広 範 囲 の 非 特 異 的 な 細 胞 傷 害 活 性 を 獲 得 す る よ う に な る が, そ の 中 に はMHC拘 束 性 の 特 異 的 な 細 胞 傷 害 活 性 を示 すeffector細 胞 が 存 在 す る 可 能 性 が あ り, そ の 点 で 期 待 で き る療 法 で あ る が,今 後 さ ら な る研 究 が 必 要 で あ る と考 え ら れ る. 稿 を終 え る に あた り,御 指 導,御 校 閲 を賜 りま し た折 田薫 三教 授 に深 甚 な る謝 意 を捧 げ ま す.ま た直 接 御 指 導 い た だ き ま した 田 中紀 章 博 士,日 伝 晶夫博 士,猶 本 良夫 博 士,な らび に 第一 外 科 学教 室 の各位 に心 か ら謝 意 を表 し ます.ま た抗 パ ー フ ォ リン抗体 を供 与 して い た だ いた 奥村 康 順 天 堂 大 学教 授 に心 よ り謝 意 を表 し ます. な お,本 論 文 の 一部 は,第49回 日本 癌 学会 総 会 お よび 第91回 日本外 科 学 会総 会 にお いて 発表 した. 文 献
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