培養 軟 骨 肉腫 細 胞HCS
2/8に お け る
テ ス トス テ ロ ンの作 用
岡 山 大 学 医 学 部 小 児 科 学 講 座(指
導:清
野 佳 紀 教 授)
佐
藤
正
義
(平 成9年6月30日
受 理)
Key
words:
testosterone,
cartilage,
IGFs,
IGFBPs
緒
言
androgenは
胎 児 発 育 中 にす でに 存 在 してお り,
男性 へ の 性 分 化 に 重 要 な役 割 を果 た して い る1).
また,骨 端 線 の 閉 鎖 を は じめ,動
物 の 成 長 過 程
に お け る 骨 格 形 成 や,骨
へ の カ ル シ ウ ム 沈 着 お
よび 石 灰 化 に とっ て も重 要 だ と考 え られ て い る.
臨 床 的 に は,性
腺 機 能 不 全 男 性 で 骨 粗 鬆 症 が 高
頻 度 に認 め ら れ2,3),去勢 男 性 に お け るtestoster
one欠
乏 状 態 で は,骨
吸 収 が 亢 進 し骨 量 減 少 が
促 進 さ れ る とい う4).さ ら に,若 年 男 性 の 骨 量 は
年 齢 に 比 例 した 性 腺 機 能 と密 接 に 関 係 し5),性腺
機 能 不 全 患 者 や 去 勢 男 性 に お け る 骨 粗 鬆 症 は 性
腺 補 充療 法 に よ り改 善 が 認 め られ る こ とか ら も6)
androgenが
骨,軟 骨 形 成 に 重 要 な役 割 を 果 た し
て い る こ とが うか が え る.
しか し,一 方 で,各
性 ホ ル モ ンが 軟 骨 の 成 長
に どの よ うな 影 響 を与 え て い る か に つ い て の 詳
細 な メ カニ ズ ム に つ い て は 今 だ に 不 明 な 点 が 多
い.お そ ら く,各 性 ホ ル モ ン の 骨 格 組 織 に 対 す
る 直接 的 な 作 用 と,他 の 成 長 因 子 を 介 し た 間 接
的 な作 用 が 密 接 に 絡 み 合 っ て い るの で は な い か
と考 え ら れ る.そ の 間 接 的 作 用 の 一 部 に は 成 長
ホ ル モ ン に よ る調 節 を受 け て い る作 用 が あ る の
か も しれ な い7-9).ま た 反 対 に, androgenが
骨
格 の 成 長 に 成 長 ホ ル モ ンやIGFsを
介 さ な い 直
接 的 な作 用 も あ る の で は な い か とい う こ とが 色 々
な研 究 か ら 明 か に な っ て きて い る10).
標 的 組 織 中 でtestosteroneは5-αreductase
に よ りdihydrotestosteroneあ
る い はandoros
tenedioneに
代 謝 さ れ る11).この 代 謝 は 骨 端 部 か
ら の 軟 骨 細 胞 で 認 め られ12),
13),
androgen受
容 体
は 骨 と軟 骨 の 両 方 で 確 認 さ れ て い る14-16).
androgenが
骨 形 成 を促 進 す る こ とは明 か であ
る.す
な わ ち,骨
に お い てandrogenは,カ
ル
シ ウ ム,リ
ン 及 び ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ ター ゼ 活
性 を高 め,石 灰 化 を促 進 して い る17,18).さら に,
androgenは
骨 芽 細 胞 の 増 殖 を刺 激 し,分 化 を誘
導 して お り10),軟骨 の 分 化 を促 進 す る と同 時 に,
一 方 でandrogenは
軟 骨 細 胞 の 増 殖 を促 進 し
,
プ ロ テ オ グ リ ガ ン の 産 生,ク
レ ア チ ニ ン キ ナ ー
ゼ 活 性 を高 め て い る と の報 告 が あ る19-22).
ま たandrogen受
容 体 遺 伝 子 異 常 症 患 者23)や
ア ロマ ター ゼ 欠 損 症 患 者 で は, estrogen不
応 症
を 引 き 起 こ し,骨 端 線 の 閉 鎖 を認 め ず 身 長 増 加
を続 け,著 明 な 骨 粗 鬆 症 を きたす.一 方,androgen
不 応 症 の 患 者 の 思 春 期 の 成 長 経 過 は,正
常 女 性
の そ の 時 期 と成 長 経 過 に 非 常 に 良 く類 似 して い
る と い う報 告 が あ る25-27).
こ れ ら の 報 告 を合 わ せ て 考 え る と, androgen
単 独 で は 骨 端 線 の 融 合 と骨 粗 鬆 症 を予 防 す る 作
用 は 殆 ど 存 在 し な い と考 え られ る.そ して, an
drogen単
独 で は 軟 骨 細 胞 の 増 殖 を促 進 させ るの
で は な い か と推 察 され る.さ ら に, androgenは
軟 骨 細 胞 の 分 化 を促 し石 灰 化 を促 進 し て い る と
い う報 告 も あ り10,17-22,28),
androgenの
軟 骨 細 胞
に 及 ぼ す 影 響 に つ い て は 今 だ 不 明 な 点 が 数 多 く
あ る.
そ こ で, androgenが
軟 骨 細 胞 に 及 ぼす 影 響 と,
思 春 期 に お い て 身 長 の 急 激 な増 加 にandrogenが
141
142
佐
藤
正
義
どの よ う に 作 用 し て い る か を明 らか に す る ため,
ヒ ト軟 骨 肉 腫 由 来 の 株 化 軟 骨 肉 腫 細 胞HCS
2/829,30)を用 い て 実 験 を行 い,そ の 詳 細 な メ カ ニ
ズ ム に つ い て 検 討 した.
表. プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 とPCRの
設 定27)-31)
材
料
と 方
法
1. 軟 骨 細 胞 の 培 養
ヒ ト軟 骨 細 胞 と し て 男 性 軟 骨 肉 腫 患 者 の 腫 瘍
組 織 由 来 の 株 化 軟 骨 肉 腫 細 胞HCS
2/8を
用 い
た29,30).株 化 軟 骨 肉 腫 細 胞HCS
2/8は, 10cm dish
に1×106個
ず つ 播 き,10%牛
胎 児 血 清 添 加,
phenl-red無
添 加 のDulbecco's
modified
Eagle's
medium(DMEM)と
と も に, 5%
CO2,
95%空
気 下, 37℃
で 培 養 し た.ま
た,培
養 液 は
週2回
毎 の 交 換 を 行 っ た.
testosterone,
estradiolと
の 反 応
testosterone(和
光),
estradiol(Sigma)は
ethanolに
溶 解 し,各
々1.8×10-5mol/mlと
し
た.さ
ら にDMEMと
混 合 し,培 養 液 中 のtestos
terone,
estradiolの
濃 度 は 各 々,1×10-7Mと
な る よ う に 調 節 し た.ま
た.controlと
し て 同 濃
度 のethanolの
み をDMEMに
溶 解 し た も の を
用 い た.
2. DNA合
成 能 の 評 価
3H-thymidine取
り込 み 試 験 に よ りDNA合
成 能 の 評 価 を 行 っ た.株
化 軟 骨 肉 腫 細 胞HCS
2/8を6
wel dishに1×105個
ず つ 播 き,細
胞 が
subconfluentの
状 態 で,培 養 液 を 取 り 除 き,各 々
1×10-7Mのtestosteroneま
た は, estradiol及
び1%牛
胎 児 血 清 添 加 のDMEMと
交 換 し た.
さ ら に こ の 状 態 か ら24時
間 培 養 し た 後,
3H-thymidine(1μCi/ml)を
加 え,6時
間 培 養 し た.
細 胞 をPBSで1回,
5%
torichloro
acetate
(TCA)で3回
洗 浄 し た 後,放
射 活 性 を 液 体 シ
ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー で 測 定 し た.
3.
RNAの
抽 出
細 胞 がsubconfluentの
状 態 か ら,1%牛
胎 児
血 清 添 加, phenolred無
添 加 のDMEMに1×
10-7Mのtestosteroneま
た はestradiolを
添 加
し た 培 地 に 変 え,48時
間 培 養 し た 後,RNAの
抽
出 を 行 っ た.
RNAの
抽 出 はChomcynskyら
の 方 法 に 基 づ
い て 行 っ た.す
な わ ち,細
胞 をsolution
D(4M
guanidine
thiocyanate,
25mM
sodium
citrate
pH 7.0, 0.5%
sarcosyl,
0.1M2-mercaptoeth
nol)に
て 溶 解 し た 後,
2M
sodium
acetateで
酸 性 化 し,水
飽 和phenolとchloroform:
isoamyl
alcohol
(24:1)を
添 加 し,遠
心 し た
水 層 か らRNAを
抽 出 し た31).
4. Reverse
Transcription-Polymerase
chain
reaction
(RT-PCR)
RNAはRT-PCR
Kit
(Stratagene)を
使 用
して 逆 転 写 を 行 い,cDNAの
増 幅 に はGene
amp
DNA
amplification
reagent
kit
(Perkin
Elmer)を
使 用 し た.
glyceraldehyde-3-phosphate
dehy
drogenase
(GAPDH),
androgen
receptor
(AR),
estrogen
receptor
(ER),
insulin-like
growth
factor (IGF)-I,
-II及
びinsulin-like
growth
factor binding
protein
(IGFBP)
-2,
-3
,-4,-5の
プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 例 及 びPCRの
設 定 は 表 に 示 し た 通 り に 行 っ た.
電 気 泳 動 に は,
3%
NuSieve
GTG
agarose
gelを
使 用 し,エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドで 染 色 し た
後 解 析 し た.
5.
S1 nuclease
protection
assay
IGF-I,
II,
IGFBP-2,-3,-4びIGFBP-5 mRNA発
現 量 の 差 を 検 出 す る た め, S1 nu
clease protection
assayを
使 用 し た.ま
た 各 々
のprobe作
成 の た め,そ
のtemplateをPCR
法 に よ り作 成 し た.
S1 nuclease
protection
assayは,32Pでlabel
し たDNA
probeを
用 い, S1 nuclease
protec
tion assay
kit (Ambion)を
使 用 し て 行 っ た.
IGF-I,
-II,
IGFBP-2,-3,-4,-5の
遺 伝 子
各 々324,292,204,184,167,189bpのfragment
をgenomic
DNAをtemplateと
し てPCR法
に よ っ て 作 成 し た.
こ のPCR
productをtemplateと
し,asym
metrical
PCR法
に よ り32P-dCTPに
よ っ て 標
識 し たantisense及
びsenseの
一 本 鎖DNAを
作 成 しprobeと
し て 用 い た.1×103cpmの
probeとHCS
2/8細
胞 に よ り 得 ら れ たtotal
RNAを42℃
で16時
間hypridization反
応 を お
こ な っ た 後,150UのS1
nucleaseを
加 え,37℃
で30分
間 反 応 さ せ た.8Mの
尿 素 を 含 む,
5%
acrylamidegelで
電 気 泳 動 を 行 い, Hyrerfilm
MP
(Amercham)に
暴 露 し 解 析 し た.
6.
統 計 解 析
3H-thymidineの
取 り込 み 実 験 は 少 な く と も4
回 は 行 い,各
々 の 結 果 は 平 均 ± 標 準 偏 差(SD)
で 示 し た.ま
た 有 意 性 の 検 定 に はStudentのt
検 定 を 使 用 し,P<0.05を
有 意 と 判 定 し た.
結
果
1. DNA合
成 能 の 評 価
3H-thymidine取
り込 み 試 験 に よ り
,株 化 軟 骨
肉 腫 細 胞HCS
2/8に
お い て1×10-7Mのtestos
terone添
加 で 有 意 にDNA合
成 能 は 増 加 した が,
同 濃 度 のestradiol添
加 で は 変 化 は 認 め ら れ な
か っ た(図1).
2.
RT-PCR
図1 3H-thymidine incorporation:testosterone 添 加 に よ りHCS 2/8細 胞 のDNA合 成 能 は 有 意 に 増 加 し た が, estradiolの 添 加 に よ り DNA合 成 能 に 変 化 は な か っ た.(C:control, T:testosterone, E:estradiol)estrogen
receptor及
びandrogen
receptor
の 有 無 をRT-PCR法
に よ り検 討 し た.そ
の 結
144
佐
藤
正
義
て い る こ と が 明 ら か と な っ た.し
か し, estrogen
receptorは
検 出 さ れ な か っ た(図2).
図2 RT-PCR:HCS 2/8細 胞 にandrogen rece ptorは 検 出 さ れ た が, etrogen receptorは 検 出 さ れ な か っ た.
図3 S1 nuclease protection assay:testosterone 添 加 に よ りIGF-I, -II mRNAは 増 加 し, estradiol添 加 に よ りIGF-II mRNAは 減 少
し た. (C:control, T:testosterone, E: estradiol)
3.
S1 nuclease
protection
assay
GAPDHを
内 部 標 識 に 用 い て 各 遺 伝 子 の 発 現
量 をS1
nuclease
protection
assayで
検 討 し た.
こ の 解 析 の 結 果, testosteroneの
添 加 に よ りIGF
-I
, -II,
IGFBP-3
mRNAは
有 意 に 増 加 し て
い る こ と が 明 ら か と な っ た .し
か し, IGFBP-4
mRNAに
つ い て は, testosteroneの
添 加 に よ り
若 干 の 減 少 を 認 め た も の の 一 定 の 結 果 は 得 ら れ
ら れ ず,殆
ど 変 化 は 認 め ら れ な か っ た.ま たIGFBP
-2
,-5に
つ い て は そ の 発 現 量 に 変 化 は 全 く認 め
ら れ な か っ た.一
方estradiolの
影 響 に つ い て
は, IGF-II
mRNAに
お い て 発 現 量 に 減 少 が 認
め ら れ る も の の, IGFBP-2,-3,-4,-5に
つ い
て は, estradiol添
化 に よ り 各 々 のmRNAの
発
現 量 に 全 く 変 化 は 認 め ら れ な か っ た(図3A,B,
4).
図4 S1 nuclease protection assay:testosterone 添 加 に よ りIGFBP-3 mRNAは 増 加 し, IGFBP-2,-4,-5 mRNAは 変 化 し な か っ た. estradiol添 加 に よ りIGFBP-2,-3,-4,-5 mRNAは 変 化 し な か っ た. (C:control, T: testosterone, E:estradiol)
考
察
今 回,株 化 軟 骨 肉腫 細 胞HCS
2/8を 用 い た 実
験 に お い て, testosteroneに
よ り軟 骨 細 胞 の
DNA合
成 態 が 促 進 さ れ る こ とが 明 らか とな り,
そ の 機 序 の 一 つ に 少 な く と もIGFs, IGFBPsが
関 与 して い る こ とが 推 察 さ れ た.
一 方testosteroneが
軟 骨 の 細 胞 増 殖 を抑 制
し,細 胞 分 化 を促 進 す る と い う報 告 も あ り23),
testosteroneの
軟 骨 細 胞 に 対 す る 効 果 は 軟 骨 細
胞 の 分 化,成
熟 度 に も強 く影 響 さ れ て い る の で
は な い か と推 察 され る37-39).ま た,軟 骨 細 胞 の
増 殖 は,各
性 に よ っ て 異 な っ て お り,男 性 の 軟
骨 細 胞 に はtestosteroneが,女
性 の 軟 骨 細 胞 に
はestrogenが
作 用 し て い る と い っ た 報 告 も あ
る23).つ ま り,各 々 の 軟 骨 細 胞 に は 各 性 ホ ル モ ン
に対 す る感 受 性 が 異 な っ て い る の で は な い か と
考 え られ る.実 際,株
化 軟 骨 肉 腫 細 胞HCS
2/
8は 男性 由 来 で あ り,今 回 の 実 験 か ら も この 細 胞
に はestrogen受
容 体 が 存 在 し て い な い か,あ る
い は 非 常 に 少 な い こ とが 推 察 さ れ,こ
の 細 胞 を
使 用 し た こ と に よ り本 来 のtestosterone単
独 の
作 用 が よ り一 層 明 確 と な っ た の で は な い か と考
え られ る.
完 全 型androgen不
応 症 の 患 者 で は,思
春 期
の成 長 スパ ー トは 正 常 女 性 の そ の 時 期 と成 長 量
に 非 常 に 良 く類 似 し て い る と い う 報 告 が あ
る26-28).さ ら に,完
全 型androgen不
応 症 の 女
性 患 者 は,正
常 女 性 の 平 均 身長 よ り も 高 く,一
般 的 に 最 終 身 長 は 正 常 男性 と正 常 女 性 との 間 に
く る26,28,40,41).Smithら が 報 告 し たestrogen受
容体 遺 伝 子 異 常 症 患 者 で は,完 全 型 のestrogen
不 応 症 を 引 き起 こ し,29歳 で,身 長204cm,骨
端
線 の 閉 鎖 を認 め ず 身 長 増 加 を 続 け,著
明 な 骨 粗
鬆 症 を認 め て い る24).完 全 型androgen不
応 症
の 患 者 と このSmithら
の 報 告 を合 わせ て 考 え る
と, androgen単
独 で は 骨 端 線 の 融 合 と骨 粗 鬆 症
を予 防す る作 用 は 殆 ど 存 在 し な い こ とが 明 らか
で あ る.さ
らに, estrogen受
容 体 遺 伝 子 異 常 症
患 者 で は 最 終 身 長 は 高 身 長 で あ る こ とか ら,骨
端 線 の融 合 に は, estrogenが
必 要 で, androgen
単 独 で は 軟 骨 細 胞 を 増 殖 させ る の で は な い か と
い うこ とが 推 測 さ れ る .
ま た,IGFsが
骨,軟 骨 形 成 に 深 く関 与 して い
る こ とは,下 垂 体 摘 出 ラ ッ トに 対 す るIGF-I投
与 に よ り骨 及 び 軟 骨 の 形 成 が 促 進 さ れ る こ と,
あ る い はBakerら
のIGF-I,-II及
びI型IGF
受 容 体 ノ ッ クア ウ トマ ウ ス に お い て 胎 児期 か ら
乳 児期 に お け る骨 発 育 が 著 明 に 抑 制 され た こ と
よ り明 らか で あ る42).さ ら にIGFsは
骨 芽 細 胞,
軟 骨 細 胞 の 増 殖 に加 え,骨
芽 細 胞 か らのI型
コ
ラー ゲ ン 産 生,軟
骨 細 胞 か らの プ ロ テ オ グ リカ
ンの 産 生 な ど,骨
基 質 の 産 生 を 増 加 させ る こ と
に よ り骨 形 成 を促 進 して い る.
一 方
,軟 骨 細 胞 と性 ホ ル モ ン との 関 係 に つ い
て は 種 々 の 報 告 が あ り,性 ホ ル モ ン が 増 加 す る
思 春 期 に お い て 身 長 が 急 激 に 増 加 す る こ とや,
変 形 性 関 節 症 患 者 に 対 す る 性 ホ ル モ ン投 与 に お
け る研 究 な ど か ら も軟 骨 組 織 が 性 ホ ル モ ン に お
け る標 的 組 織 で あ る と考 え られ る43).さ ら に,マ
ウ ス に お け る実 験 に お い て は, testosteroneの
投 与 に よ り骨 形 成 が 著 明 に促 進 さ れ,身
長,体
重 と も に 増 加 し,同 時 にtestosterone投
与 に よ
り成 長 板 に お け る 軟 骨 も著 明 に 増 加 し て お り,
testosteroneが
軟 骨 細 胞 の 増 殖 を促 進 して い る
こ とが わ か る44).し か し,反 対 に, testosterone
が 軟 骨 の細 胞 増 殖 を 抑 制 し,細 胞 分 化 を促 進 す
る とい う報 告 も あ り23), testosteroneの
軟 骨 細
胞 に 対 す る効 果 は 軟 骨 細 胞 の 分 化,成
熟 度 に も
強 く影 響 され て い る と 推 察 され る37-39).ま た,
ウサ ギ に お け る実 験 で はtestosteroneの
投 与 に
よ り,肝 お よ び,軟
骨 の 成 長 ホ ル モ ン受 容 体 遺
伝 子 の 発 現 量 が 増 加 し,哺 乳 動 物 に お け る性 成
熟 過 程 に お け る 骨,軟
骨 形 成 に 性 ホ ル モ ン に よ
る成 長 ホ ル モ ン を 介 し た 機 構 が 存 在 す る こ と も
推 察 され る45).さ ら に, IGF, IGFBPは
成 長 ホ
ル モ ン投 与 や,年 齢 に よ り変 化 す る こ とか ら も,
testosteroneとIGF系
は 密 接 に 関 係 して い るの
で は な い か と考 え られ る.
今 回 の 実 験 に お い て, testosteroneの
添 加 に
よ りIGF-I
mRNAの
発 現 量 は 増 加 し て お り,
anerogenはJGF-Iのantocrineお
よびpara
crineメ カニ ズ ム を 介 して 軟 骨 細 胞 の 増 殖 を促 進
して い る こ とが 推 察 さ れ る.ま た,IGF-IIに
関
して もtestosteroneの
添 加 に よ りIGF-II
mRNAの
発 現 量 は 増 加 し て お りIGF-Iと
同 様
の メ カ ニ ズ ム が 存 在 す る こ と が 推 察 さ れ る.一
方, estradiol添
加 に よ り, IGF-II
mRNAの
発 現 量 が 減 少 し て い た こ と に 関 して は,高
濃 度
のestradiolを 使 用 し た こ とに よ りわ ず か な が ら
もestrogen受
容 体 を介 した 作 用 が働 い た とい う
こ とが 否 定 で き な い.ま
た, estradiolそ の も の
に よ る 細 胞 毒 性 も考 え ら れ,細
胞 の 増 殖 に 抑 制
的 に 働 い た と思 わ れ る.
ま た,体
液 中 のIGFsの
大 部 分 は そ の 結 合 蛋
白 で あ るIGFBPsと
結 合 して 存 在 し て お り,現
在6種
類 のIGFBPsが
同 定 さ れ,こ
れ ら の
IGFBPsはIGFsの
作 用 を促 進 的 あ る い は 抑 制
的 に 調 節 し て い る.現
在,骨
に お け
るIGFBP-146
佐
藤
正
義
3,-5はIGFsの
作 用 を促 進 的 に,ま
たIGFBP
-4はIGFs作
用 を抑 制 的 に 調 節 して い る考 え ら
れ て い るが,軟 骨 細 胞 に お け る これ ら のIGFBP
の 作 用 は 不 明 な 点 も 多 い.今
回 の 実 験 か ら は,
androgenに
よる 軟 骨 細 胞 へ の 影 響 は 骨 細 胞 と同
様 に, IGFBP-3
mRNAの
明 らか な 増 加 が み ら
れ た 一 方, IGFBP-2,-4,-5
mRNAに
つ い て
は 明 らか な 変 化 は 認 め られ な か っ た.
本 実 験 の 結 果 か らandrogenは,
HCS
2/8細
胞 のandrogen受
容 体 と結 合 し た 後, HCS
2/8
細 胞 を刺 激 し,DNA合
成 能 を上 昇 させ た.ま た,
HCS
2/8細 胞 のIGF-I,
-II mRNA及
び
IGFBP-3
mRNAの
発 現 量 も上 昇 し て い た.こ
れ らの こ と か らandrogenは,軟
骨 細 胞 を刺 激
して 細 胞 内IGFs,
IGFBPsを
変 化 させ,こ
れ ら
がantocrineに
働 き細 胞 の 増 殖 に 促 進 的 に 作 用
して い る こ とが 推 察 され る.
結
論
本 実 験 に お い て, estrogen受
容 体 が 存 在 し な
いHCS
2/8細 胞 を使 用 した こ とに よ り, testoster
one単
独 の 作 用 が よ り一 層 明 白 に な っ た と考 え
られ る.ま た 今 回 の 実 験 の 結 果 か ら, testosterone
の 添 加 に よ りHCS
2/8細 胞 のDNA合
成 能 が
促 進 さ れ る こ と か ら,軟
骨 細 胞 はtestosterone
に よ り増 殖 が 促 進 さ れ る と考 え ら れ る.ま
た そ
の 機 序 に 関 して は, testosteroneの
添 加 に よ り
HCS 2/8細 胞 のIGF-I,
-II, IGFBP-3
mRNA
発 現 量 が 増 加 し て い た こ と よ り,軟 骨 細 胞 の 増
殖 機 構 の 一 部 に 少 な く と もIGF系
のantocrine
な 作 用 を 介 した 機 序 が 存 在 し軟 骨 細 胞 の 増 殖 を
促 進 し て い る の で は な い か と推 察 さ れ る.
稿 を終 え るに 臨み,終 始 懇切 な る御 指 導,御 校 閲
を賜 わ りま した.岡 山大 学 小 児科学 教 室 清 野 佳 紀教
授 に深 謝 致 し ます.ま た,本 研 究 に お い て御 指 導,
御 助 言 を いた だ きま した同教 室 田 中弘 之先 生 に感謝
致 す る ともに,教 室 の皆 様 に お 礼 申 し上 げ ます.
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150
佐
藤
正
義
The
effect
of testosterone
on the
growth
of the
human
chondrosarcoma-derived
chondrocytic
cell
line
HCS2/8
Masayoshi SATO
Department of Pediatrics,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. Y. Seino)
Sex steroids have a great influence on bone maturation in childhood, especially in adoles cence. However, the precise mechanisms are not fully understood. Human chondrosarcoma derived chondrocytic cell line HCS2/8 cells were cultured in DMEM culture medium sup plemented with 1% fetal calf serum, 1×10-7M testosterone or estradiol for 24 hours in a subconfuluent state. Then the cells were pulse labeled with 3H-thymidine to measure DNA synthesis. In addition, S1 nuclease protection assay of insulin-like growth factor (IGF)-I, -II
and IGF-binding protein (IGFBP)-2, -3, -4 and IGFBP-5 mRNA was carried out. DNA synthesis of HCS2/8 cell was enhanced in the presence of testosterone but not in the presence
of estradiol. Using S1 nuclease protection assay, testosterone increased expressions of IGF-I, -II, and IGFBP-3mRNA. However, estradiol decreased the expression of IGF-II mRNA but did not change expressions of IGF-I, IGFBP-2, -3, -4 or IGFBP-5 mRNA. In conclusion, the present results indicate that testosterone stimulates the growth of chondrocytes, probably via
