骨 肉 腫由 来 培 養 細 胞 (

7 2 金 沢 大学 十全医学 会雑 誌 第8 5巻 帯1号 7 2 ^‑9 2 (1 9 76)

ヒ ト骨 肉 腫由 来 培 養 細 胞 (^{O S T} 細 胞) ^の

ク ^{ロ ー ン} 系 ^にお け る細 胞動 態 学 的研 究

金沢大 学 医 学 部 整 形 外 科 学 講 座 (主任 : 高 瀬 武 平教 授)

山 口

1 9 5 2年 G^ey^{5 )} が初めて ヒ ト の子 宮 頸 部 癌 ^より HeLa細 胞^の分 離^に成 功して以来^{. ヒ ト}組 織由来^の細 胞 株が多 数 確 立さ れ, 更に1 9 5 5年 Pu ck ら^{1 8)} に よる 単 離 細胞 培 養 法の開発は単 ^一細 胞 由 来^の細 胞 集団 即 ち ク^{ロ ー ン}系 細 胞^の分離を可 能な ら し め た^{. そ の}後 培 養 細 胞 株か らの ク ^{ロ ー} ン系 細 胞^の分 離は∴細 胞 株^の性 状 決 定に定 量 的なシ ス テ ムを導 入せ し め, 更^に変異株^の 分 離は病理学 的 遺 伝学 的 研 究^に寄 与す る よ うにな^っ

た^.

1 9 6 4年 高 瀬ら^{2 3)封)}に よ^って抹 化^に成 功し た^{ヒ ト}骨肉 腫 由 来培 養 細 胞 (O S T 細 胞) は現 在も継 代培養が続 け ら れてお り. 現 在まで本 細 胞に対する制 癌 剤^{= ), ホ}

ル モン剤⁸⁾²⁶⁾, 非 制癌 性 抗 生 物 質^{8) 川).} x線照射^狛2)等の

影 響に関す る検 討が な さ れ, 更に又本 細胞^の異種 移 植

に関す る研 究^Z5)等が報 告さ れてき た. 著 者は 更^に O S T 細 胞の特 性を追 求す^べく, コ ロ ニ ー 性ク ^{ロ ー} ン分 離 法によ^って得ら れ た O S T 細 胞の ク ^{ロ ー ン}系 細 胞

につ い て , 形 態 学 的観 察^. 細 胞 動 態 学 的 観 察^, 更^に染 色 休 構 成^の面か ら検討し^, いさ さ かの知 見 を 得 たの で

報 告す る.

実 験 材 料

Ⅰ. 使用細 胞

1 963年10 月^に金 沢大 学 医 学 部 整 形 外 科で. 1 5才女 子 の左 大腿骨^々肉 腫か ら分 離 培 養さ れ た 骨肉 腫 細 胞は ,

1 9 6 4年6月^に抹 化 細胞と な り^t Oste oge nic Sa r c o^‑ m a Taka s e Str ain (O S T 細 胞) と名づ け ら れ た^. 現 在な お継 代 培 養 続行 中^で1 9 7 5年9月現在5 4 6代に達 し た^. こ の継 代 培 養45 6代か ら4 7 7代ま^{で の} O S T 細 胞を本 実験^に使 周し た^.

ⅠⅠ. 培 養条 件

培 養 液は D ifc o 製^の T C M ed i^{u m} 1 9 9^に仔牛血清 (5 6⁰cで3 0分 間加 温 不活 化) 1 0 % を 加 え た も^のを 用 いた. 継代 培養 法は1 96 4年 高 瀬ら^Z3) が報 告し た方法に

Cytok in etic stud ie s on clo ne s of O S T ^{c e}lls

畠 夫

準じ, 培 養細 胞^{を E D T A} 処理後^, 10 0 0rpm で遠^JL^､沈 漉し た後, 培 養 液で1 ^〜 2 ×1 0⁵/mlの濃 度になる様 細 胞 浮 遊液を作りt そ^の1 0^ml を角型大 培 養 瓶に注 入 し て37⁰C に て静 置 培 養し た.

実 験 方 法

Ⅰ^. ク^{ロ ー ニ} ン グ法

コ ^{ロ ニ ー}性ク^{ロ ー} ン分 離 法に従^った³²⁾. 継 代培 養 後 4 8時 間^の培 養 瓶か ら培 養 液^のみ を除 去し ^. 0^.2 % T ry p^sin 溶 液と E D T A の等量 混 合 液5 mlで O S T

細胞^の定 着 増 殖して いる培 養面を洗 浄し た後, あ らた に同液5 ml を注 入^{して3 70cで7}分 間 放置 し た ^. 細胞

の剥離を確 認してか ら P ipet ting で細 胞を 分散させ た乱 更に1 0 % 仔 牛血 清加 培養 液5 ml を加え, Try^‑ psin の作 用を阻 止し た^.以上^の処理^{に よっ} て9 5 ^〜1 00

% の単 離 細 胞 率を もつ細 胞 浮 遊 液を得ること ができ,

細 胞 数の算 定を行った. 次に こ の細 胞 浮 遊 液を 培養液 で稀 釈し た後, 2 0 又 は4 0個^の単 離 細 胞を 予 め 5 mlの 1 0 %仔 牛 血 清 加 培 養液を入れ た径6 0^{m m の} Petri Di^‑ Sh に植え 込 み , 3 7^Oc . 5 % C O²‑^{in c ubato r で}培 養し た^. 1 4 日後^に形成さ れ た^{コ ロ ニ ー} の中か ら分 離す

べき^{コ ロ ニ ー} を 選 び, D ish の裏 面^{より こ の コ ロ}

ニ ー

を ガ^{ラ ス}鉛 筆で囲み印を^っ け た^. 次に培 養 液 を 除 去し た後ス テ^{ン レ}ス製^{シ リ ン}ダ ^ー ( 外径 1 0^{m m} , 高さ 1 0m m , 壁 厚^{1 m m}) ^{の 一} 端^に シリ^コ ングリ ^ー ス を 塗 りt これ を D ish の底面に固 着させ て ガ ラス鉛筆 に て印を^つ け た目 的^{の コ ロ ニ ー} を 囲 み, そ の中^に数 滴^の Tryp^sin 溶 液を入れて細 胞を 剥 離分 散した ( 図 1). か く して得 ら れ た細 胞 浮遊 液 を再び Petri D ish に植え 込 み同様^に培 養し た^{. こ の}操作 を 図 2 ^の 如く 3 回線 返して ク^{ロ ー} ン1 , 2 , 3 ,

… …1 4の計1 4

の ク^{ロ ー} ン系細 胞を得た^. こ のう ちク^{ロ ー} ン1 ^, 3 ^, 1 0 は分 離後長 時 間を経過 して いた た め,今回^の 実験 か

ら省き, 残_{り1 1}種^{の ク ロ ー} ン系 細胞を 実 験^に供 し た^. derived fr o m hu m a n osteog enic sa rco m a in tis s u e culture M a s a o Ya m ag^uch i Dep^{a r}tm e nt of Ort hop^ed ic Su rg ery (D ir e cto r

: Pr of. B. Taka s e) S^cho ol of M ed icine, K an a z aw a U nive r si ty^.

O S T 細 胞 りク ^{ロ ー ン}系^にお け る細 胞 動 態学的研 究

以下^{, こ}れ らの ク ^{ロ ー} ン系細 胞を略し^て C L 2^, C L 4 .

… …C L 1 4 と記す. 又 O S T 細 胞 母 集団 を非^{クロ ー ン} 系O S T 細 胞と記す^.

ⅠⅠ. 形 態 学 的 観察

非^{クロ ー ン}系 O S T 細 胞及 び各ク^{ロ ー} ン 系 細胞 ^の 形 態 学 的 観 察^{に は}小型培 養 瓶^の C O V e r Sli p 又 は Lab^‑Tek T is s u e Cultu r e C ha mb e r S li de ( M ile s

Labo r ato rie s 図3 ) を用^いた. 細 胞 定 着 面を燐 酸 緩

金力

ス

▼

｣ _細胞｡ ｡ ニ ^̲

シリ^{コ ン}グ リー

属^シリ^ンダ ^ー

コ ^{ロ ニ ー} 性 ク^{ロ ー ン}分 離法 ( 山田)

図 1

O S T c e‖ S u SP^{e n}Sio n

￠OIoⁿy fo r m atio n

(^l)

Singl^{e c o}lo ny isolatio n

COIony for matio n

(之)

Si 噌】^{e c o}lo ny iso】atio n

CO嘉ony for matio n

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ゐゐ

あ

Clo n ed ^{c e}" c L I C ｣ 2 C L 3

図2 Pr ∝ ed ∬ e S Of O S T c ell clo ning

73

衝 液^で数秒 間洗^{い, メ}タ^{ノ ー ル}で5分 間 固定し た後乾 醸し, 1 5 ^〜20 分間ギ^ム ザ染 色を施し た.

Ill. オ ^ー ト ラ ジオ グ^ラフ ィ ^一 によ る検 討

非ク^{ロ ー ン}系 O S T 細胞と各^{クロ ー ン}系 細胞 に対 して,

3H^Jr hymi din e ( 以 下 ³H l ^､d R と略す ) を 用 い, Cu mulativ e labeling m ethod と Puls e

labeling m ethode を施 行して細 胞 動 態^の分 析を行^っ た. 即ち上 記 各細 胞 系^の細 胞を細 胞 数1 0×1 0 ソml と な る よ うに1 0 % 仔年 血 清 加 培 養液^に再 浮 遊さ せ. その1

ml を T is s u e Cultu r e C ha mbe r S lid^e ( 図 3 ) の各 C ha mbe r に分 注して, 3 7^Oc. 5 % C O2^‑in c^･ ubat_{o r} で培 養し た^. 培 養 後6 0時 間 目^{の こ}れ らの細 胞

に. Cu m ulativ e labeling m ethod に従い , 3H ^‑ T d R を0^.1〟C i/ mlの濃 度^にな る■_{様 培 養 液に添加し持} 続 的に作 用さ せ. 48時 間ま^で6 時 間 毎^に標 本を取り出 し た^. Puls e labeling m ethod では同濃 度^{の 3}H

‑T d R を3 0分 間作用 さ せ た後 更^に培 養を続け , 4 8時 間又は6 0時 間まで3時 間毎に標 本を取り出し た^{. こ}れ ら 里‑T d R で ラ^ベ ルさ れ た模 本を燐 酸 緩衝液^で数 秒 間洗 浄し^, メタノ ^ー ル固定^, 乾燥 後^, D ip ping 法に よ る オ ^ー ト ラジ オ グラ フィ ^ー操作を行^っ た^. 即 ち 4 0 ⁰ Cに加 温し た感 光 乳剤 (さ く ら N R ^‑M2) ^に標本を浸 し, 室 温 乾燥 後 防 湿剤 塙 入^の暗 箱^に密 封し, 4 ⁰c 2 週 間^の露 出後2 0⁰c の レン ド^ー ル で4分 間現 像, フ ジ フ_ィクス で1 0分間 定着^, 3 0分 間 水洗し. ギ^ム ザ染色 を施し た. オ^ー ト ラ ジ オグ^{ラムで の}細 胞^の算 定に当^っ

ては, 細 胞 核1 個につき 5 個以上^の感 光 粒子を有す る 細胞を Labeled Cell (L^.C^. と略す) と し^, 同 様^に 分 裂細 胞を Labeled mito sis (L M と略す ) と し た^.

Ⅳ^. 染 色 体 染色

非^{クロ ー ン}系 O S T 細胞 及び ク^{ロ ー ン}系 細胞 を 型

図3 Lab^‑Tek, T is s u e Cultu r e C h^{a m}t麗 r

S lide. 2 C ha m be r S li de ( 各C h a m be r の

底 面 積は 2 0^{1n mX}2 0^{m m}である｡)

7 4

通 り^{にコル ヒ チ ン}処理後^, 水又 は低調 液で処理 し た後 カル ノ ア液で固定し. 2 ^〜 3 回新 鮮なカルノ ア固定液 にか えて後 細胞 浮 遊 液を作り, 空 気 乾燥 法に より 染色 体 染 色を行^った^. ク^{ロ ー} ン系 細 胞^では C L 2 の 5 代 ^, 1 0代^. 1 6代^, C L 13 の4 代^, C L 1 4 の2代の細 胞 に対

して染色 体^の観 察を行っ た^.

実 験 結 果

1 . コ ロ ^{ニ ー} 形成^{につ い て}

単 離細 胞^の櫨え 込 み後5 日冒^には, 10数個の細胞を もつ コ ロ ニ ^ーが倒立 顕 微 鏡 下^で容 易^に観察できる よう にな り ( 写 真1) , 1 1 日冒には 辺縁は や ^ゝ不整であ る が ほゞ円形^のコ^{ロ ニ ー} が見ら れ^{. こ の コ ロ ニ ー} 内^{で は} 細 胞は相互^に連 結して敷 石状^の配列を示し た (写真 2)^. か か る^{コ ロ ニ ー} は肉眼的にも観 察 可能と な^っ た.

単 離 細 胞^の植え込み後 約1 4 日目^では, ギ^{ム ザ}染色 を施 して観 察 する と, 全^{て の コ ロ ニ ー} ほ上 述の如く細 胞が 敷 石 状^の配列を示し, 上 皮 細 胞 性 細 胞 株^{のコ ロ ニ ー} に

類 似し た形態を示し た( 写 真3)^. 従^っ て こ れ ら^{コ ロ}

ニ ^ー は線維 芽 細 胞株^でみ ら れ る^{コ ロ ニ ー} と は 全 く 異^っ て いた. 植え 込 み後1 4 日 以上 経^{過 す る と, コ ロ ニ ー は} 大 きく な る と ともにその中心部で細 胞が密と な り数層 に盛り上が^っ てきて , 肉眼的にも中心部^の濃^い部 分と 周辺 部^の淡^い部 分が判別さ れ る よ う^になっ た. 即 ち^コ

ロ ニ ^ー の状態^でもO S T 細 胞は Co nta ct inh i b itio n

を起さ ない こと が観察^{さ れ た}( 写 真4 )^.

単 離 細 胞40個を植え込ん だ場 合, 平 均2 4偶^の コ ロ ニ ^ーが形 成さ れ, コ ロ ニ ^ー 形 成 率は約6 0 % で あ^っ た ( 写真5 )^.

一 方 同じ敷 石 状^の細 胞配列を有す る^{コ ロ ニ ー} の 申

に, 約1 0 % の割 合で辺嫁が明 瞭で小さ^{い コロ ニ ー} が散 見さ れ, 成長が遅^い割^に中心部に細 胞^の盛り 上 が り が 早く か ら観察さ れ た^. か か る^{コ ロ ニ ー} は肉眼的にも鮮 明で濃く^/トさいコ ロ ^{ニ ー} と して観 察さ れ, ギ^ム ザ染色 を施して観察 する と細 胞 密 度が高く, コ ^{ロ ニ ー} 周 辺^へ の細胞^の伸展が少くて運動 性が低^い傾 向を示し た(写 真 6 ) ^. か か る^{コ ロ ニ ー} か ら分 離さ れ た ク^{ロ ー ン}系 細 胞は C L 1 4 であ^っ た^.

又多 核 巨細 胞を多く含む^{コ ロ ニ ー} も観 察さ れ た が ^. か か るコ ^{ロ ニ ー} は ^一般^に発 育が悪く^{, クロ ー ニ ン} グの

操 作^の途 中^で消 遺し分 離す ること ができ な か^った(写 真7) ^.

ⅠⅠ^. 形 態 学 的観 察

1 . 非ク^{ロ ー ン}系 O S T 細 胞

継代 培 養 後4 8時 間までは線 推 芽 細 胞 様^の形 態を 示 す 細 胞が散 見さ れ た が( 写真8a), 継 代 培 養 後4 日凱こ

は殆^んど上 皮 細 胞 様^の形 態を示し た(写真8 b ) ^. 核 は類 円 形又 は碑円形を呈し, や ^ゝ大 小不 同 を 認 め た .

多 核 巨細 胞は算 定 細胞 数1 0 0 0個 申1 個 を数える程度^で あ^っ た.

2 .各^{クロ ー ン}系細 胞

C L 2 の分 離 後5代目^の細 胞におい て,継 代培 養 後 4 8 時 間以 内では線 維 芽細 胞 様^の細 胞が締に観察さ れ^た が (写真 9 a)∴継 代培 養 後4 8時 間を 過 ぎ^ると 上皮 細胞 様^の形 態を示す細 胞^で占め ら れ る よ う^にな^っ た. 核 は 類 円 形又は楕_円形を呈し軽 度の大 小不 同性を 示 し^, 細 胞 質に軽 度の空 胞 形 成を 認 め た(写真9 b) . こ の所 見は C L 4^, C L 5. C L 7, C L 8,C L 9, C L l l ^, C L 1 2, C L 13 ^の各ク^{ロ ー ン}系 細 胞^におい ても同 様^に観 察さ れ^, 多 核 巨細 胞 ( 写 真1 0) ^の出 現 頻度^の違^いを除け ば,非

ク ^{ロ ー} ン^･系O S T 細 胞^の形 態 学 的特 徴と規似 し^{て い} た^. C L6, C L 1 4 ^{につ い て} は興 味あ る所見 を 呈 し た^の で後^に別 記す る. 2核 以 上^の多 核 巨 細胞は各ク^{ロ ー} ン

系^の細 胞に多く観 察さ れ, 非ク^{ロ ー} ン系 O S T 細 胞 よ り高^い頻 度で出現し た( 表1)^. 特^に非^{クロ ー ン}系 O S T 細 胞^の培 養^の場 合 多 核 巨細 胞が算定 細胞致1 0 0 0 個 中1 個^であ^っ たの に対し, C L 6 で は2 8 9 個^. C L 8 で は2 4個^. C L9 では3 4個. C L l l で は2 9個と多核 巨細 胞 が高 頻 度に出 現して いた^.

C L 6 に関しては, ク^{ロ ー ン}分 離 後2 ^〜 3 代 目 か ら 多 核 巨細 胞^の増 加が目 立ち. 5 代 目^では算 定細胞 数 1000個 申2 89 個を数え. 著し く高^い頻度を示し た ( 写真 1 1)^.C L 6 の多 核 巨細胞の核 数によ る分 布 状 態^は哀2

の如くで, 算 定 多 核 巨 細胞 数2 0 0個 中2核 細胞 は 8 8 個 (4 4 %)^, 3 核 細 胞は43個 (2 1^.5 %)^, 4 核細胞は27 個 (13 .5 %)^, 5 核 細胞は1 8個 ( 9 %) と 核数が 多 く な るに従^って出現 率は減 少す る傾 向を示し た. 9核以 上 の多核 巨細 胞 も存 在し た が ^一般に核 数が多く なると ^一 個 ^一個^の核の確認 が国 難と な る場合が多く^. 正 確^に核 数を算 定す る^こと が^でき な か^っ た (写真1 2 ) ^. 核数の

表1 多核巨細 胞^の出現 頻 度

( 算 定 細 胞 数1 ,0 0 0個 中^の多 核巨細 胞 数)

O S T c ell 口 ^{CL 8 2 4}

C L 2 ロ ^{C ｣ 9 3 4}

CL 4 4 C L l l 四

CL 5 ロ ^{C L 1 2} ロ

C L 6 2 8 g l ^{C L 1 3} 田

C L 7 = C L 1 4 ヰ