骨 肉 腫由 来 培 養細 胞 (

金 沢大 学 十 全医学 会 雑誌 帯8 5 巻 第1 号 9 3‑ ^{1 14} (1 9 7 6)

ヒ ト骨 肉 腫由 来 培 養細 胞 ( ^{O S T} 細胞) ^の g^柁 び′汗0 ,

摘 乙油 川 に お け る走 査 電顕 的観察

金沢大学医学 部 整形 外科 学 講座_{( 主}任: 高 瀬武 平教 授)

富 田

今日 まで ^一般^に. 病理形 態 学 的研究には, 試料を薄 切し, そ^の透 過 像よ り情 報を得る^, と^いう手段 を 用い てき た^. そ^の際に立体 的な情 報が 必要^であ れ ば, 連続 切 片 標本を観 察^{しつ つ}推 測^を働か せねば な ら ず^, 或い は, r eplic a によ^っ て鋳 型を造り^, 間接 的に観察す る 以外に方 法は な か^った^. そ れ故, 必要と する立体 構築 像は模式図 と し^て描か れてお り. 対 象を客 観 的^に正 確 に理解す るには 困難であ^った^. し か し 近年, 走査 型電 子 顕 微鏡 (以下, 走 査電 顕と略す.) が 発 明 さ れた こ と^{に よ}り^, 対 象 物を光顕レ ベ ル以下^におい て も立 体 的

に観 察す ること が可能と な り^, か か る問題点^は解決さ れ た. 先^づ, 工学_関係^{で の}活 用^に成功 し た 走査電 顛 は^,1 9 6 2年 頃^,歯 組織^の観 察^】) に応用 さ れ^,次い で1 9 6 6 年 H^aye s¹2) が赤 血 球を観察し. その後, 走 査 電 顕 の持っ分解 能^の良さ, 解 読^の容 易さ, 超薄 切片 作成が 不必要^であ ること^. な どの利 点と相 侯^{っ て, こ}れ が次 第に悪性 細 胞^へ の研究に利用さ れ るよう に な^っ て き た^.

即ち ∫乃 ロ∫け0 で の研 究と して. マ ウスやラ ッ ト の

腫瘍 由 来細 胞^{4)13) 20), ハ ム ス タ ー 卵}巣由 来 の C H O

c ells21 )24)

, 更にマ ウ ス 色br ob la st と^{そ の}悪性 変 化 (^{tr a n s}fo r m atio n) ^{につい て の}報 告⁴⁾ が な さ れて お り. 特^にそ れ らの細 胞の C ell cycle に関 係 して の

細 胞 表 面 変化, 細 胞 相 互 作用. vir al infe ct io n や

r e v e r s e tr a n sfo r m atio n age nt に よる形態変化 ^に

つ い て論じ ら れてき た. し か し^一 方^. ′乃 †ノブu o で の 悪性 細 胞につ い て の検 討では^. 子宮 頸 部 癌^{1 4 )} や^.膀 胱

劫^5)の組織 表面を観 察し た も^のな ど を散見 する に過 ぎ ない.

そこ で著 者は^, 長 期 継 代培 養^に成功 して い る人 骨肉 腫由来 培 養細 胞 (^{O S T} 細 胞) ^{を 用 い て . わ1 Uf汗0}

にお け る細胞 表 面 形 態を走査 電 顕^で観 察し. 更^{に こ の} 細 胞を^マ ウ ス に異種 移 植し^{て で}き た 腫瘍 組 織^の割断面

勝 郎

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を同様に観察して, ∫乃 Uf汗0 , 及 び 摘 乙両川 で の本細 胞^の表面 構 造^の特 殊 性^の相異 を検討し^, 以下^の 如き興 味あ る知 見を得たの で報 告す る^.

実験 材 料 並び に実験方 法

1 ^. 人 骨 肉 腫由 来 培 養細 胞 (O S T 細 胞) ^の由来 1 9 6 3年1 0月, 金 沢大学 医 学 部 整形外 科学 教室^に於

て , 女 子 高 校生( 1 5歳) ^の左 大腿骨々幹 部^に発生し た 骨肉 腫を^, 下肢 切 断 直後に別 出し. 細 胞を分 離して培 養を行^い, 1 9 6 4年6月に株 化^に成功し. Oste oge nic

Sa r c o ma Taka s e Str ain ( O S T 細胞) と 名付け た²⁶⁾ も^{の で}あ る^. 以後. 継 代 培 養を続け^て1 9 7 5年9 月 現 在^. e stab lished c e11 1in e と して5 4 6代を数えて いる^.

2 . O S T 細 胞^の異 種 移植 方 法 1) 免 疫 反 応 抑制 方 法

著 者は Kub ista et al^.( 1 9 6 7)^{1 7 )の}方法に 準L: て ,

Rab b it Anti^‑Mo u s e^･thym u s Se r u m ( 以 下 ^. R A M T S と略す) を作製してマ ウスに投与し. そ の免疫反 応^の抑制を図^っ た^. 即ち^. 生 後2 週^の雌d d N ^{マ ウ}

スよ り胸 腺組 織を 馴出し^, 細 切して胸腺 細 胞 を と り^. rIa nk^'s bala n c ed Salt Solutio n に浮遊 さ せ^. こ の胸 腺 細 胞5 ^〜1 0億個 を体 重2 ^〜 3 k g の家兎 の耳 静脈^へ注 射し. 2 週間後. 再 度同 量^の胸 腺 細 胞 を 静 注し た^. 2 回目^の胸 腺細 胞 静 注 後1 週間^{で , こ の}家 兎か ら採 血し. そ^の分 離し た血 清を5 6⁰c ^. 3 0 分間 加 温し^て不 徳 化し た後^. 使用時まで･¶^{2 00cで 凍 結 保 存}

し た^.

2 ) ^マ ウ ス^へ の移 植 方法

継 代培 養4 ^〜 5 日目^の培 養細 胞を pol ic e m a n を 用^{い て}培 養 瓶^のガラ ス面より 剥離し^. p i pett i_rlg し て単 離細 胞と し た後, 細胞 濃 度が2 0 ^〜4 0^×1 0⁶/ml とな る^よう培 養 液^に浮遊さ せ た ものを移 植^に用^{い た.} 即 ち Sca nniⁿg ele ctron micro s c op i^{c s}tud ie s o n c ul^tu red hu m a n o st eog enic s arc o m a cells in vi tr o and in viv o . Kats ur o Tomita , D epa rtment of Orthop a ed ic Su rg e r y (D ire ctor

: Pr of. B^. Taka s e)^, S^cho ol of Med icine_, Ka na za w a U niversity^.

9 4

生 後2過の d d N 堆マ ウ ス に R A M T S O^.0 5 ml を 7 日間, 毎日 1 回腹 腔 内に注 射し た後, 培 養 細 胞1 ^〜1 0

×1 0⁶個を そ^の大腿 骨 周 囲^に注 入 移 植し た. 移 植後も 同 様^に毎日 R A M T S 注 射を続け ることによ り^,2過 日

で移植 部に小豆大. 3過 日で小 指 頑 大^の腫癌形成が 見 ら れ, R A M T S ^の中 止^のない限り ^{r e}gr e s sio rl を 起す も^のは な く^. 平 均4 6 日 (3 3 日^〜5 8 日) ^{に てマ ウス} は腫 瘍死^{し た.} 移植 成 功 率は8 6 % ( 8 0匹 申6 9 匹) ^であ

っ た^. 走 査 電 鋳 試料 作 製^には, 移 植 後3 ^〜 4 週 目の腫 瘍を用^いた.

3 ^. 走 査 電 頗 用試 料^の作 製 方 法

1) 単 離 浮 遊細 胞^の場 合^‑∫乃 びi汗0 で の観 察 継代 培 養7 日目^のO S T培 養 細 胞^{を E D T A 処 理}後^, 培 養瓶^のガラ ス面よ り剥 離し^, Pipet ting に て単離 細 胞浮 遊 液と し た^{. こ}れ を3 0 0^rpm 3 分 間 遠沈 し. 上

清を棄^{て て}直ちに pH 7.4 の Dul be c c o 燐酸緩 衝

液 (P 息 S^.) を注い で振 濃 淡 浄し(以後^の液の交 換は 全て同様^の遠 沈 操作を行^っ て いる^.). 再 度 遠沈 して上 清を棄て, 2^.5 % gluta r al dehyde (2 5 % gluta r al^･ dehyde : P^.B^.S^.=1 : 9) を注い で2時 間,

l 前固 定

を行っ た. 再びP.B.S.で洗浄し,1 % OsO4(2 % O sO4 : P^.B^.S^.=1 : 1)で1 時 間,後 固 定し P^.B.S ^.で洗浄し た^. こ こま^{で の}操作は全^て4 ⁰c の条 件 下^で行 ^っ た^. 次^{い で こ の}試 料を 50 % ^, 7 0 % ^, 9 0 % ^. 9 5 % . 1 0 0 %

a c eto n に. 2 0分 毎^に1 ^〜3 回 浸して脱 水し ^, 9 9 %

is o a myl a c etate に3 0分 間 浸して a c eto n を置 換 し た^. 更にO S T細 胞^のis o a m yl a c etate 浮 遊 液を^ピ

ペ _ッ ト に てカ^{バ ー} グラ ス小 片面^に滴 下し. 直ちに日C P

‑1 型 臨 界点 乾 燥 装 置^に入れ, 液 体 ^{C O2} 噴 出^による 細 胞 流 出を防ぐ た めに, 田中^{2丁) の}考 案し た d^ry ic e によ る臨 界点 乾 燥を行^った^. 乾 燥を終え た試 料を^, 銀

ペ ^ー ス ト又はセ メダ イ^ンホワイト で試 料 台^に 固定し.

カ ^ー ボ^ンと金^パ ラ ジ ウムによ り回転 蒸 着, 或^い はI B‑

1 型イ オ^ンク リ ^ー ナ ^ー によ る金^{パ ラ ジ ウムの スノヾ}ッタ 未 着を行^っ た( 表1) ^.

観 察^には 日立 電 界 放射型走査 電子 顧 微鏡 (H F S ^‑2 ) を用い. 加速 電 圧1 5^〜2 0 K V^の条 件で50 ^〜5 ^×1 0⁴倍 に

拡 大し^. 試料 台傾 斜 角0 ^〜4 5⁰で観 察し た^. 2 ) 単 層培 養細 胞^の場 合^一f柁 〃f け0 で の観 察 滅 菌^シャ ^ー レの底 面^にあ ら か じ め カ^{バ ー} グラスの小 片を入れてお き, その上に単離 浮 遊 細 胞 液を 入 れて培 養 を行^い, カ^{バ ー} グ ラス面^に定 着培養 ^{さ れ た}細 胞を,

位 相 差 顕 微 鏡^で観察し^{つ つ}経時 的^に.採り出して試 料 作 製^に用^いた^･ 試料作^{製 方 法は･ 遠 沈 操 作を除い て は･}

単 離 浮 遊 細 胞^の場 合と同様 ( 表1 ) であ る が. 臨 界 点 乾 燥^に際しては液 体 C O2 を使用 し^, 4 5⁰cの臨界 状

= 享^く･･･

前 固 定

臨 界 点乾塊

観 察

表1 試 料 作 製 法

p B S(p B 7^.4′4⁰c) で洗 浄

2.5 ! g l^uta r al deh_{y d}e, 2^‑6 時 間, 4⁰c P B S で洗 浄

1 篭OsO 4. ト 2 時 間. 4⁰c p B S で洗 浄

5 0 亀, 7 0 篭. 90 亀′ 9 5 亀. 1 0 0 宅 a c eto n

(^×1) (^Xl) (^×2) (^×2) (^×3r 各^{2 0} 分 (樹脂 包 墟､ 凍 結 割 断､ pr Op yle n e o xide

9 9 篭i_{s o a m}y^{l a c e} 垣te 3 0牙

液体^{C O 2}

回 転蒸着(C, Au + p d) イ オンスパ_ッタリ^ング (AⅥ+ p d)

H F S^‑2形､1 5 ^‑ 2 0 k V

で溶解)

態^で行^っ た.

3) O S T 細 胞の異 種 移 植 腫 瘍^の場 合一^{拍 乙両川 で}

の観 察

O S T 細 胞を^{マ ウ ス}に異 種移 植し 3 ^〜 4過を経^て小 指 頚木^{に発 育し た腫 瘍を, 走 査 電 顕観 察試料と して用}

いた. 即ち, 生き た ま ま^{の マ} ウ ス の大腿部よ り 腫瘍を 切 除し, 速かに P.B.S. 内^で2×2 ×4m m の大き さ^に切 り出し, 蓑1 ^に示 す 如く 1)^, 2) ^の場 合と同 様^に 試 料 を作 製し た. た だ し固 定は gluta r al dehyde 6 時 間^, OsO■2 時 間 行^い, 目 的と す る 観察 面 を得るた めに操 作 途 中に次のよ う な観 察 面剖 出法を施 行した.

i) 固定 前 又は固 定 申^の組 織を,鋭 利なカ ミソリ^で切 る か. 或^いはピンセッ ト で ひき ち ぎ る^.

ii) ^{1 0 0 % a c eto n で}脱 水 中に, イ) ^{カ ミ} ソ リ で切 る, ロ) ^{ピンセッ ト で}折 振 割 断す る,

ハ) 凍 結割 断法

一試 料を a c eto n に浸し た ま まゼ ラ チ ンカ プ セ ル内

に封 入し, 液 体 窒 素^で凍 結しつ つ . ノ ミ で鈍 的に割断 する,

ニ) 樹 脂 包 埋 凍 結 割 断 法‑ ^{セ メ} ダイン1 5 0 0 中に

試 料を包 埋し^{て カ}プセル に入れ^, 液休窒 素^で‑ 8 0⁰c に て凍 結さ せつ つ ノ ミ で鋭 的に割断^, 次い で常温に戻 し た試 料を pr op yle n e o xi de で2 0分 間毎4 ^〜 5 回 洗^っ て セ メダイ ^ンを融か し. is o a m yl a c etate で置 換す る^.

iii) 臨 界 点 乾 塊 後^{に ピンセッ トで}折 損する.

以上の方 法^のう ち. 主 な観察^には良^い観察_{面 が}得ら れ た 立) ^ロ) ^ハ) ^ニ) ^の試 料を用^いた^. 更に観 察 面を

O S T 細 胞^の in vitr o ,in viv o にお け る走査電 麒的観察 9 5

イ^{オン エ ッチ ン}グ し た後 ^仁蒸 着し た ものを も 観察し た.

4) 宿 主 側^の結 合 組 織^の観 察

O S T 細 胞異種 移植 腫瘍^の組 織を宿 主 側^の結 合 組 織 と 比較 する た め,腫 瘍周 囲を囲んで いる線維組 織を 3 ) に準じて採 取し,1 0 0 % ^{a c eto n} 脱 水 中に ピ ン セ ッ ト で折 損して得た ものを観 察^に用^いた.

尚^一 意 査 電 顔試 料 作 製^に先 立ち, 棟 木を実 体 戴 微鏡 で観察して確認 す る と共に, 走 査電 顧 観 察後 ^に再 度,

光 顧レ ベル で確認 す る た め^に. 試 料を 試料 台よ り剥が し.表2 に示す如く d^{o u}b le e mbed d ing te chniqu e²) に て包 埋し, 5〃m の切 片をつく り R .E染 色を行った.

実 験 結 果

Ⅰ^. わ乙 肌徳和 に お け る O S T 細 胞の走査 喝 顕像 1 . 単 離 浮 遊 状態にあ る O S T 細胞

弱拡 大^で観 察す る と( 図1 ). O S T 細 胞は ほ ぼ球

形^に近^い形 態を成してお り^{. 一} 見^{. "}湖 底^{の マ}リ モ〝

様^であ^った. その大き さ は直 径8 ^〜1 5〟m にわ た り 大 小 不揃い で, 表 面には特色 あ る突起が見ら れ た^. 強拡 大^で観 察す る と( 図2), こ の細 胞 質 突 起^{に は mic r･}

0 Villi 及び b lebs の2 種 類^の形態 が あ り, 単独^に, 又は種々 の割 合に混 在し な が ら密生して い る のが 認 め

ら れ た^.

mic r o villi は直径 約0.2fL mの指 状^の突 起で , そ の

長さ は0 .5 ^〜 4 〟m にわ た^っ て最 短ま ち ま ちであ り^, 方 向性も細 胞 表 面か ら垂 直に立^っも^の , 斜 方 向に曲折し て いる も^のな ど が観 察さ れ た^. その 5 ^×1 0⁴倍拡大 率

で の観 察は^, 表 面平 滑^であ^った^. b lebs は mi c r o^･

villi の先端が蛇 頭 状, 泡 状又 は球 根 状に変 容して膨 ん だ形 態を な してお りl その直径は0.3^〜0.餌 m の範 囲にあ^った.

2 ^. 培 養後^の O S T 細 胞^の経 時的観察

浮 遊 状 態にあ る O S T 細 胞は. s ubc ultu r e を行

った後は時 間の経過 と と もに沈降し^, カ^{バ ー} グラ ス面

に定着し始め た^. 6時 間を経過 L た も^{の で}は 細 胞^の表 面像^に著 変^{は な かっ た が, ガラス}面^に接して い る部で

は. 細 胞の ア メ ^{ー バ}様運動の始ま り と して Rlopo ^‑

dia や 1a me11ipod ia (^{r u}田ed m e mbr a n e) な どの

偽 足 (ps e udopod ia) が 見 ら れ た(図 3 )^{. r u}用ed

m e mbr a n e は図3 に示す如く, 細 胞 周辺に拡 が^っ た

波 状^の細 胞 質 突起で^, その表 面に は ^mic r o villi を 伴^{って い}た. 色lopod ia は mic r o villi とほぼ 同 じ 太さであ^っ た が^, 培 養 後^の時 間が た^っ につ れて t より 伸 展し た も^のが観 察さ れ. そ^の先端は棟状^に尖鋭であ

っ た. ま た^, 近 隣^の細胞と^の問には相 互^の 鋸opo^‑

d ia の接 触^によ る i^{nte r c e}llula r bridge s が 見 ら れ る よ うになっ た(図 4) ^.

1 2時 間を経過 し た細 胞を僻 撤図で見る と ( 図 5 )^,カ バ ^ー グ^{ラ ス}面に沿^っ て全 周に放 射 状^に伸展 し^{て い} る 鋸opod ia や. その癒合し た 1a mellipodia が 観 さ れ た^.

1 日 を経 過 する と(図 6 ), O S T 細 胞^{の ア} メ ^{ー バ}

様 運 動は活 発と な り^, 細 胞は小 丘 状或^{い は}紡錘 形状の

形 態を整え^{つ つ} inte r c ellula r bri dge s に よ る細 胞 相 互接 触 作 用や細 胞 分 裂を示し た^. 図 7 は^, 培 養 2

日目^の試 料^で観 察さ れ た細胞 分 裂 直後^の細胞である.

細 胞は は ぼ等量に分裂し^, 核^の存 在する膨隆 部に ^一 致

T ab le 2^. Po st^‑S C a n n l ng ^ele ctr o n mic r o s c opy h istolog^{y p}r o c e s sing s chedule

S ta g^e

l . C hlo r ofo r m_, fo u r cba ng^{e s o}f 6 b

2. H y d^{r a}te t br o u9 b l O O. 8 0. 6 0 a nd 4 0 亀 e 也a n ol. 3 h p^{er c}ha ng^e 3. 0,9亀 S OdiⅦ n Cblo r土de_, 6 h

4. Fo r m 01^一日 alin e_′ 2 4 h

5 . Deh y^{dr ate t hr o u}g b 7 0′ 2 x 95 a nd 2 x l O O 宅et ba n ol. 2 h p^{e r} Cba n

g^e

6 .*=mpr eg^{n a}te wi_th 2 % c el loidin in e t he r ^‑alc ohol, t hr e e cha n g^{e s} O V e r 2 ^‑ 3 d^a_y^畠

7･ C lea r in be n z e n e _. tw o cha n9^{e S O} f 2 h

8 ･ 工mp^{r e}g^{n a}te with p^{a r a}f fi皿 W a X_′ tV O Cba n9^{e S O}f 3 h 9 ^. Embed in p^{a r a}ff ln v a x

★s tag^{e $} 6 ^‑ 9 c o mp^ris e pete rfi^ls do uble ^‑e血 bed ding te chni_qu e

(Cnl l土n9. 196 3 )^.

Cn m ulativ e 七ime(h)

2 4 3 6 4 2 6 6 7 6

1 4 8

1 5 2 1 5 8