Adenovirus 12型に関する研究第Ⅰ編
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(2) 850. 藤. mlを. 田. 加 え て 細 胞 を分 散 せ しめ,此 の 細 胞 をPBSで. 洗 つ た後,中. 型 試 験 管 に6×105細. し,培 養 液2mlを 養4〜5日. に 静 置 培 養 し,培. で 単 層 培 養 を 得 る.培 養 液 を捨 てvirus. 浮 遊 液 を0.2mlを. 加 え て2時. 維 持 培 養 液1.8mlを. に7日. 間静 置し. た.維 持 液 の 液 替 は総 べ て4〜5日. 毎 に 行 つ た.初. の 感 染Virus量. 10‑1,. 10‑2,. はTGID50の1/2,. 2×10‑3,. 10‑3を. 捨 て,新. 行 つ て 継 代 した.そ の 後 の 継 代 は7日 間 培 養 した後. 新 しい 斜 面 寒天 に 集 落 状 に 培 養 し,残 りの半 分 宛 は 持 液 に 混 和 し,凍 結 融 解 して軽 く遠 心 した. 感. 胞 の 単 層 培 養 に接 種 してvirus. 増 殖 の観 察 を 行 つ た.以 後 同様 の操 作 の下 に継 代 を の 続 け た.. 加 え て 凍 結 融 解 を15回 以 上. 験 管 に 培 養 した新 単 層培 養 細 胞 に入 れ,更. Ⅱ. に維持液. 毎 に 継 代 培 養 を続 け た.尚 各virus量. 毎 に3系 列 を. 感 染 細 胞 を 凍 結 融 解 し,軽 に 接 種 す る方 法 で7日. 前 実 験 と 同様 初代 感 染 細 胞 を7日. 培養法. そ の2本. を と りPBSで2回. EDTA液. で細 胞 を 分 散 した 後 混 和 遠 心 し,上 清 を 洗 い,次. い で4mlの. て 細 胞 を浮 遊 し,そ の1ml宛4本. く遠 心 した上 清 を次 代. 目毎 に 継 代 してvirusの. した. 表1. 感 染 細 胞 の 凍 結 融 解 に よ る継 代 成 績. 培養 液 を加へ. して 培 養 した.次 代 即 ち3代 継 代 に 当 つ て は此 の4 本 の 中 か ら任 意 に2本 選 び, 2代 継 代 と同 様 に処 理 して 以 後 の継 代 を続 けた.尚 各 継 代 に 於 け る残 りの 2本 は1週 間 以 上 の 観 察 に 供 した. 培養法. 前 実 験 と同 様 に初 代 感 染 細 胞 を7日 培 養 した 後, 4本 を と りPBSで2回. 洗 い ト リ プ シ ンEDTA液. で 細 胞 を分 散 し,一 本 の 沈 澱 管 に入 れ,遠 心 して上 清 を 捨 て,PBSで. 洗 い,沈. 渣の 細胞 を 白 金耳で. 2本 の斜 面 寒 天 に 出 来 るだ け 等 量 に な るよ う に0.3 〜0.4cm径. に 細 胞 を5ヶ 所 に 置 き培 養 した .培 養7. 日後,各 試 験 管 斜 面 上 に 増 殖 した細 胞 を 白 金 耳 で半 量 宛 を と り,次 代 の斜 面 寒 天 の2本 の半 量 宛 の 細 胞 は1mlの. に 培 養 し,残 り. 維 持 液 中 に 混 和 して凍 結. 融 解 して,上 清 を 用 い て 予 め 準 備 した 単 層 培 養 細 胞 に接 種 し感 染 像 の 出 現 を 観 察 す る こ と に よ りvirus の増 殖 を 検 べ た.同 様 の 方 法 で3代 以 後 の 継 代 を続 け た. (4) 各 種 細 胞 の 斜 面 寒天 培 養 に よ るVirusの. 増. 殖法 小 型 角瓶 を 用 い てHeLa,. 表 中 の+,〓,〓 HeLa. 増殖. リプ シ ン. の試 験 管 に分 注. (3) 斜 面 寒 天 培 養 に よ るVirusの. 増殖. を 感 染 細 胞 の 変 性 の 上 か ら検討 した 成 績 は 表1に 示. 間培 養 した 後,. 洗 い,ト. 代 とVirusの. 成績. 作 つ た. (2) 感 染 細 胞 の継 代 に よ るvirusの. 実 験 成 績. 1) 凍 結 融 解 に よ るVirus継. 加 え て 次 代 培 養 を 行 い,同 様 の 方 法 で7日. 捨 て,PBSで. で 培 養 した.培 養7. 々 を2本 宛 の 斜 面 寒 天 に細 胞 集 落 培 養 を. 行 つ た 後, 1000r. p. m 1分 間 遠 心 上 清 の 全 量 を 中 試. 1mlを. 加 え て37℃. 上 清 をHeLa‑S3細. 7日 間 培 養 した もの を と り出 し維 持 液 を. しい 液1mlを. で 洗 い,各. 1ml維. 継代法. 上 記 中 型 試 験 管 に単 層 培 養 し た細 胞 にvirusを 染 せ しあ,. 後,維 持 液4mlを. 洗 つ た後. 種 接 して2時 間. 各 細 胞 別2本 宛 の斜 面 寒 天 上 の 細 胞 集 落 の半 分 宛 を. 2×10‑2,. 用 い た.. (1) 凍 結 融 解 に よ るVirusの. 10‑3×TCID50のAdenovirus12を. 日後 に トリプ シ ン液 で 細 胞 を 分 散 し 遠 心 しPBS. 間 感 染 せ しめ た 後,. 加 え,37℃. 三. 各 細 胞 の 単 層 培 養 を 行 い, PBSで2回 胞 数 宛 を 分注. 加 え て37℃. 耕. S3, F1, CS, PSの. は 変 性 細 胞 の 数 を 示 し.+,. 20〜40%,〓,50〜70%,〓,80%〜100%.
(3) Adenovirus. 実 験 成 績 を 見 る と, TCID50の1/2, 10‑2のVirus量. 12型. 10‑1,. に. 関. す. る 研. virns量. 2×. め た, 10‑1,. 3代 で は総 べて 感 染 に よ る細 胞 変 性 像 を 認 め50〜. 察 で は20〜30%細. 2×10‑3で. いが, 4代 で は総 べて 感染 に よ る細 胞 変 性 を 認 め, 細 胞 が変 性 を来 した. 10‑3で. は3代. ち感 染Virus量. 10‑3 virus. 5代 で前2者. は細胞. 細 胞 に変. と明 らか に細 胞 変 性. を 認 め る に至 る継 代 数 との 間 の 関 連 性 が 現 れ て い る. (表2). 細 胞 に変 性 を. 来 した.. 3) 斜 面 寒 天 培 養 に よ るVirus継. (表1). 2) 感染 細 胞 の 継 代 に よ るVirus継. 胞 に変 性 を認 め4代 で は50%以 上. 上 に変 性 を認 め,後 者50〜80%の. 性 を 認 め た.即. ま. で細 胞変 性 は 全 く見 られ な か つ た が4代 で 凡 そ60% 細胞 に変 性 を 認 め5代 で80〜100%の. 2×10‑2 virus量 で は3代 の2週 間 目観. 量 で は4代 で 感 染 細 胞 を認 め, の80%以. 3代 で. 細 胞 に 感染 像 を 認. の 細胞 に 変 性 を認 め た. 10‑2, 2×10‑3,. は. 3代 で極 め て少 数 の細 胞 に変 性 像 を認 め た に 過 ぎな. 80〜100%の. は2代 で 凡 そ20%,. 4代 で は80〜100%の. と見 られ る細 胞 を 極 め て 少 数 に認 め た に過 ぎ な い が,. 100%の 細胞 に変 性 を 来 した. 10‑2,. 851. が1/2 TCID50で. 50〜70%,. で は2代 で 感 染 に よ る細 胞 変性 像. 究. 代 とVirus増. 殖成 績. 代 とVirus. 単 層 培 養 細 胞 にvirusを. 増 殖成 績. 感 染 せ しめ, 7日 後 に 此. 感 染細 胞 を7日 目毎 に継 代 してvirusの 増 殖 を感 染. の細 胞 を 斜 面 寒 天 培 養 し,以 後7日. 目毎 に 継 代 して. 細 胞の 変性 出現 の上 か ら検 べ た成 績 は 表2に 示 した.. virusの 増殖 を 検 べ た成 績 は表3に. 示 した.各 継 代. 表2. 各Virus量. 感. 染 細. 胞. 毎 の3, 4号 の 試 験 管 は7日,. の. 継. 代. 成. 績. 14日 観 察 し た も の.. *観. 察 日.
(4) 852. 藤. 毎 のvirusの. 田. 増 殖 は凍 結 融 解 して,単 層 培 養 細 胞 に. 接 種 して 検 べ た.継 代 は 当 初 の単 層 培 養 細 胞 に於 け るvirus増 殖 を1代 代 の2代. と し,斜 面 寒 天 培 養 の 初 代 を 継. と して 表 示 した.. virus量1/2, 変 性 を 認 あ,. 10‑1で. 5代 で 畧 本virusの. 最高 感染価を示す 10‑2, 2×10‑3,. 5代 で 本virusの. 価 を示 す ま で に増 殖 した.. HeLa,. HeLa‑S3,. Adenovirus. 12型. 凡 そ最高感染. 績. 1.. 表 中1代 は 単 層 培 養.. 2.. 表 中10×,. 面 寒 天 に 細 胞集 落. 示 した.. 7代 継 代 で凡 そ 本virusの 示 し, CS, PS,で そ7代. HeLa‑S3,. Fl等 の細 胞. 最 高 感 染 価 に 近 い増 殖 を. は4代 で 感 染 細 胞 変 性 を認 め,凡. で最 高 感 染 価 に近 い値 を示 した. HeLa‑S3,. Fl,等 の細 胞 継 代 に よ る本. virusの 増 殖 は殆 ん ど差 を 見 な い, CS, PS細 るvirus増. 表3. 各 細 胞 を 用 いて. 継 代 に よ る もの は3代 で 感 染 細 胞 変 性 を認 め, 5〜. 即 ちHeLa, 殖成. を 感 染 させ,斜. 実 験 成 績 を見 る と, HeLa,. (表3). 4) 各 種 細 胞 の 斜 面 寒 天 培 養 に よ るVirus増. F1, CS, PSの. 、状 に継 代 培 養 を 行 つ て, virusの 増 殖 状 態 を 検べ た. 細胞 に. は 何 れ も4代 で 感 染 に よ る細 胞 変 性 を50%. 以 上 の細 胞 に 認 め,. 三. 成 績 は表4に. は3代 で80〜100%の. ま で に増 殖 し た, virus量2×10‑2, 10‑3で. 耕. 殖 は 上 記3者. 胞によ. に比 較 して稍 劣 る様 で あ る.. 感 染細胞の斜面 寒天培養に よる継代成績. 2代 以後 は 細 胞 集 落 培 養.. 100× は 斜 面 寒 天 に 培 養 し た細 胞 の 凍結 融 解 し た 上 清 の 稀 釈 を 示 す..
(5) Adenovirus. 表4. 1.. Virus量. 2.. 表 中10×,. はTCID50で 100×. 12型. 関. す. る 研. 究. 853. 種 々の感染細胞 の斜 面寒天培路に よる継 代成 績. 行 った . は 斜 面 寒 天 に 培 養 し た 細 胞 の 凍 結 融 解 し た 上 清 の 稀 釈 を 示 す.. 細 胞 に変 性 を 認 め た. 10‑3で. Ⅲ 総 括 及 び考 案. 細 胞 に変 性 を認 め た.之. Adenovirus 12型 は各 種 の 株 化 細 胞 に 対 し,又 primary culture cellに 対 して も感 受 性 は高 くな い. 単 層培 養 したHeLa‑S3細. に. 胞 に 同時 に種 々のVirus. よ る成 績 で は1/2 TCID50で 性 細 胞 の 出現 を 認 め, 得 る50%細. は2代. の成 績 と差 が な い が, 10‑1, 法 に比 べ て 増 殖 確 認 に1代. 天 上 に細胞 集 落 に 発育 せ しめ る方 法 に よつ て7日 毎 に継 代 を続 け此 の3者 に 就 い てvirusの. 目. 増殖 態度. を比較 検 討 した.. 10‑3で. で 感 染 によ る変. 3代 で はvirus増. 部 は凍 結融 解 して 次 代 に 接種 す る方 法,一. 細 胞を 継代 す る方 法,更 に一 部 は 感 染 細 胞 を斜 面 寒. 上の. 殖を確認 し. 胞 に変 性 を認 め,凍 結 融 解 に よ る継 代 法. 量 を感 染せ しめ7日 間 維 持 液 下 に 増 殖 させ た後,一 部は感染. は4代 で50%以. に比 べ て 感 染 細 胞 の 継 代 に. 2×10‑2で. は凍 結 融 解. 遅 れ, 10‑2,. 2×10‑3,. は増 殖 を確 認 し得 る多 数 細 胞(50%以. 上)の. 変 性 を 認 め た の は5代 で あ るか ら,凍 結 融 解 法 に 比 べ て1代 遅 れ て い る. 次 に斜 面 寒 天上 に 細 胞 集 落 培 養 法 に よ るVirus増. 感染 細 胞 の凍 結 融 解 によ る方 法 で 継 代 した 成 績 は, virus量 がTCID50の1/2. , 10‑1,. 2×10‑2で. は. 殖 の 成 績 で はTCID50の1/2,. 10‑1で. 認 し得 る ま で に 細 胞 変 性 を認 め,. は3代 で 確. 2×10‑2,. 10‑2,. 2代 でvirus感 染 に よ る細 胞 変 性 と見 られ る変 性 細. 2×10‑3,. 胞の 出現 を認 め,. を認 め, virusの 増 殖 は 明 らか で あ り,凍 結 融 解 継. 3代 で は 感 染 に よ る細 胞 変 性 を50. %以 上 の細 胞 に 認 め, 10‑2, 感染細 胞 の 出現 を 少 数 に 認 め,. 2×10‑3で. は3代. 4代 で は80%以. で. 上の. 10‑3何. れ も4代 で50%以. 上 に細 胞 変 性. 代 法 に に よ る成 績 と殆 ん ど一 致 して い る. 以 上3種. の 継 代 法 で 感 染virusの. 増 殖 を検 べ た 成.
(6) 854. 藤. 田. 耕. 三. 績 か ら凍結融解継 代法 と斜面寒天上 細胞集落継代 法. の10‑1で. とは差 がな いが感染 細胞継代法 ではvirusの 増殖確. 代 でvirus増. 認 まで に凡1代 の遅れが見 られ た.. た. 2.. 結. 論. 単 層 培 養HeLa‑S3細. 12型 の種. 落 継 代 法 の3方 法 を用 い て7日. 1) Rowe. W. P., Huebner R. T.,. 績 は,1)2)法. 献. Gilmore L. K.,. Med. 84. 570, 1953. 15). 16). 2) Hilleman M. R. & Werner. T. H.:. Proc. Soc.. Exp. Biol. & Med. 85, 183, 1954 3) Nera F. A. & Endero T. F.:. J. Immunol. 72,. Pereira. H.. Nature. 183,. ges.. virusforsch.. 6, 45,. Pereira. H.. 18). Allison. A.. 19). 医 学 の あ ゆ み,. 55,. 6) H. G. Pereira:. 4,. 1964. Britisch Medical Bulletin,. 15,. 3, 1959 7) Suzuki S., Tateno I.,:. Jap.. J.. Exp.. Med.. inpress 14, 2848, 1959. Ginobery. 21). Jametz:. 22). Bayer:. C.,. 131, 835, 1962. 25). 9) Yabe Y., Trentin. J. J., & Taylor G.,:. Proc.. Biol. Med. 111, 343, 1962. 10) Heubuer R. T., Rowe. W. P., & Lane.. 26). W. T.:. Proc. Nat. Acad. Sci. 48, 2051, 1962. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 115, 1141, 1964 12) Pereira H. G.: 医 学 の あ ゆ み:. Lancet 7375, 21, 1965 678,. 1965. 14) Pereira H. G.: virology,. 6, 601, 1958. J.. G.,. &. 1960. Farthing. C. P.:. J.. Japan.. J.. Med.. 133,. 1958. 1957. Exptl.. Med.. Hyg.. 67,. Med. 10,. powell. I.,. 107,. 276,. 105, 267,. B.,. 1958. 195,. 1957. 1960. Trentin. J. J.:. Virology. &. Stare.. Boccia.. Relli. D.. Virology. 1963. Huebner. R.. J.,. Natl.. 27). Pereira. 28). Green. H.. 29). Green. H.:. 30). Ginoberg. 11) Girardi A. T., Hilleman M. R. & Zwickey R. E.:. cell. 1964. 369,. Proc.. Exptl.. 571-572.. Ejima.:. Virus. Archetti 20,. H.. 321,. S.:. H. O.,. G.:. C. P.:. 1960. Exptl.. 617,. H.. 186,. Pereira. Am. J.. Farthing. 1960. 316,. 10,. H.. C.,. Pereira. Nature. Biol.. Mayer 23,. & 21,. G.:. 23) •b–ì—ç•ì:. Science. A.,. A.. Nischickawa, &. 20). 24). 8) Trentin J. J., Yabe Y. & Taylor G.:. 1959. 10,. Fukumi, Sci.. Allison. J.. Virology. Arch.. & 895,. impress. 17). 1955. G.. Armstrong Resarch. 315. 13). に 比 べ て 稍 劣 る.. た 恩 師,村 上 栄 教 授 に 謹 しん で 謝 意 を 捧 げ ます.. Parrott R. H., & Ward J. G., : Proc. Exp. Biol.. Soc. Exp.. 感 染 細 胞 の 単 層 培 養 継 代法 に よ り継 代 した成. 稿 を 終 る に あ た り,終 始 御 指導 並 び に御 校 閲 を 賜 っ. 凍 結 融 解 法 に よ り 継 代 し, virus量TCID50. 4) Kjellen L.:. 殖 状 態 は凍 結 融 解 法 と差 が見 ら. 目毎 に継 代 を 続 け,. 文. 5). 斜 面 寒 天 上 感 染 細 胞 集 落 培 養 継 代 法 によ り継. 3.. virus増 殖 状 態 を 検 べ 次 の 成 績 を得 た. 1.. 10‑3で は4. れ な い.. 7日 間 培 養 し,そ の 後 の 継. 代 は 凍 結 融 解 継 代 法,細 胞 継 代 法,斜 面 寒 天 細 胞 集. 2×10‑3,. 殖 を 感 染 細 胞 変性 の 上 か ら 確 認 出来. 代 した時 のvirus増. 胞 にAdenovirus. 々量 を 用 い て 感 染 させ,. は3代 で, 10‑2,. Rowe. Acad.. H.. G.,. W.. Sci.. P.,. U.. Allison. &. S.. A. C.:. Lone. 48,. W.. 2051,. Nature. T.:. 1962. 196,. 244,. 1962. 31). &. Pina,. M.:. Virology H.. 甲 野 礼 作 等:. S.:. J.. Virus. Virology 18,. Exper.. 10,. 20,. 601, Med.. 267,. 199,. 1962 107, 133, 1985. 1960. 1963.
(7) Adenovirus. Studies 1.. The. tissue. 12型. on. に. 関. す. る 研. Adenovirus. culture. 究. 855. Type. of adenovirus. 12. 12. by. three. methods. By Kozo FUJI. TA. Department of Microbiology Okayama University Medical School Okayama, Japan (Director: Prof. Sakae Murakami) ABSTRACT It. is. sters, the. that. also. adenovirus. other are. posed. of. virus. in. is,. the. therefore,. quantity With. this. methods. with. adenovirus. view. survival tumor. nduces. tumor. do of. the. developed. to. in. of. is 1.. the the. 12. adenoviruses. so. out. the. authors. a. high. proportion. extent.. In. inoculated. the. some. in some. virus by. find. to. in. virus,. and. appropriate. of. the. animals,. the. of. the. isolation. methods. ham. this. virus. presence. of. to. young. study. virus. detect. or from. even. ab. man.. a. minute. virus.. three. methods. of. necessary. of. type. types. problems. sence It. known. and. 12 most. The. mind,. successive for. tissue. the. period. suitable.. tissue. The. culture. conducted. cultures of. 7. results. days of. conducted. a. using for. this. for. series. of. monolayer each. study. experiments. HeLa. generation are. briefly. of. HeLa. generations. by. cells to. in. see. which. summarized cells. the. infected of. as. with. following. culture. the. three. follows. freezing-thawing. te. chniques: The. cells. cultured was. growing. for. 7. changed. rifuged,. 1ml. then. the. culture. was. TCID50. of. virus. ground. of. cellular. generations Virus. As after. in. two. be. about 3.. with. in. sediment, and. the the by. From the and. on. most simple. of. which. were. In. frozen. the. 10-2,. and. of. infected. and. medium. thawed,. cent-. Subsequently,. doses. 2•~10-3,. 12. the. cells.. proliferation. of. type. period. HeLa. confirm. of. 1,. of. virus. and. and. 10-3. 10-1 on. the. TCID50,. 4. placed. in. cells:. cells. solution,. The. foregoing. the. were. test. growth. cultured. this. rate. first tubes. of. for. 7. generation and. virus. days, was. cultured.. in. this. and divided. Successive. series. proved. to. experiments.. agar: the. cell. suspension. about. five. equal. half. the. the. HeLa. of of. of. the. half. This. method. concluded. that. first cells,. cells. of. supernatant. cells. the. masses. other. virus.. infected. amount. The and. the. HeLa. trypsin. was. This. agar.. infected. manner.. slant. one. of. to. doses. with. experiments. preceding these. monolayer. the. centrifuged,. suitable. cells. adenovirus. culture. monolayer. to. generations the. similar. on. the. proliferation two. in. into Then. medium,. the. in. in. solution.. again. each. generation.. the. successive. each. culture. cultured.. with. of. new. needed. in. infected. generation. after. and. were. termination. into. were. experiments. as. divided. cultured. tubes. first. generation. through. preceding. trypsin. the. placed. generations. cells. same. the. test. At The was. degeneration,. parts,. Virus. As. one.. for. conducted. the. the. needed.. the. were. fresh. 3. preceding. equal. cultures. of. continued. dispersing. into. in. generation.. supernatant. culture. the. monolayer. one. used,. were. 2.. as. with and. tissue. in. days. the. was growing. placed gave. for. the. on on. was in. 7. days. was. placed. sediment. was also. cultured generation. the results. were. slanted. the. agar. for. so. of 7. the agar,. days. with. monolayer. not. and. surface. frozen-thawed new. dispersed. centrifuged. was. 1ml. to. of. determine. different. from. those. methods.. results method maintain. it. is for. successive. the. detection generations. the of. tissue virus. .. culture growth. conducted because. on it. is. the easy. slant to. agar. manipulate. is.
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