ラットにおける DMH 誘発大腸癌株細胞 (RCN-9) を用いた肝転移モデル作成と実験化学療法 ―抗癌剤門脈内投与の効果について―

ラ ッ トに お け るDMH誘

発 大 腸 癌 株 細 胞(RCN-9)

を用 い た肝 転 移 モ デル 作 成 と実験 化 学療 法

抗 癌 剤 門 脈 内 投 与 の 効 果 に つ い て

岡 山大学 医学 部 第一外 科学 教室(指 導:折 田薫三 教授)

赤

在

義

浩

(平成5年1月11日

受 稿)

Key words:大

腸癌 肝転移,動 物 モ デル,微 小 肝転移,抗 癌剤 門脈 内投 与

緒 言 大 腸 癌 は 胃癌 に 比 し肝 転 移 の 比 率 が 高 く,進 行 大 腸 癌 に お い て は 初 回 手 術 時 既 に10-30%前 後 に肝 転 移 を 認 め る1,2).ま た,治 癒 切 除 後 の 異 時 性 肝 再 発 が20%前 後 と 多 く,肝 転 移 は 大 腸 癌 の 予 後 を不 良 とす る大 き な 因 子 と な っ て い る3). こ の た め 大 腸 癌 治 癒 成 績 向上 に は,肝 転 移 に 対 す る有 効 な 治 療 法 の 確 立 が 重 要 で あ る こ と は論 を待 た な い.大 腸 癌 肝 転 移 に 対 し て は,現 在 ま で 種 々 の 治 療 法 が 臨 床 で 試 み ら れ て き た.し か し,治 療 の 有 効 性 を臨 床 的 に 評 価 す る こ とは, 患 者 の 背 景 因 子 の 差 異,無 治 療 群 設 置 の 倫 理 的 問 題 か ら な か な か 困 難 で あ る の が 現 状 で あ る4). これ ら諸 因 子 を 除 外 す る た め に は,適 切 な 動 物 を 用 い た 肝 転 移 モ デ ル が 必 要 で あ る.著 者 は, 大 腸 癌 肝 転 移 に対 す る治 療 法 を検 討 す る 目 的 で, ラ ッ ト大 腸 癌 肝 転 移 モ デ ル を 作 成 し,こ の モ デ ル を微 小 肝 転 移 巣 に 対 す る抗 癌 剤 門 脈 内 投 与 の 治 療 実 験 に 応 用 し,若 干 の 知 見 を得 た の で 報 告 す る. 材 料 と 方 法 1. 肝 転 移 モ デ ル の 作 成 実 験 腫 瘍:実 験 に は, 1, 2-dimethyl hydrazine (DMH)誘 発 のF344ラ ッ ト大 腸 癌 株 細 胞(RCN -9)を 用 い た(新 潟 大 学 第 一 外 科 よ り提 供)_. 当 科 に お い てRPMI 1640 mediumに よ りin vitroで 継 代 培 養 し,PBSに て1×107cells/ml の 細 胞 浮 遊 液 に 調 製 し,実 験 に 用 い た. 実 験 動 物:動 物 は 日本 チ ャ ー ル ス ・ リバ ー(株) よ り購 入 し たF344ラ ッ ト,6週 齢,雄 を使 用 し た. 2. 実 験 化 学 療 法 使 用 薬 剤:協 和 醗 酵 工 業(株)より提 供 され た5 -fluorouracil(5-FU) _{, Mitomycin-C (MMC),} 日本 化 薬(株)より提 供 され たCis-diammine-dich-loroplatinum(II) (CDDP)を 使 用 し た.投 与 量 は ヌー ドマ ウ ス を用 い た制 癌 剤 適 応 研 究 会 の 制 癌 剤 効 果 判 定 基 準 に 基 づ き5), 5-FU, MMC, CDDPの 総 投 与 量 をそ れ ぞれ150mg/kg, 6mg/kg, 8mg/kgと した. 実 験 方 法:エ タ ノー ル 麻 酔 下 にF344ラ ッ トを 開 腹 し,回 盲 部 腸 間 膜 静 脈 よ り外径0.61mmの ポ リエ チ レ ン チ ュー ブ(Becton Dickinson社)を 門 脈 下 端 ま で 挿 入 し,正 中 創 よ り皮 下 トン ネ ル を 通 して 背 部 に 出 し,ア ダ プ タ ー に 接 続 固 定 し た(図1).チ ュ ー ブ 挿 入5日 後 にRCN-9細 胞 5×106cells/mlを チ ュ ー ブ を介 して 門 脈 内 接 種 し,肝 転 移 モ デ ル を作 成 した. 投 与 方 法:5-FU, MMC, CDDPの 投 与 ス ケ ジ ュ ー ル は,腫 瘍 細 胞 接 種 翌 々 日(day 2)の み1回 投 与,day 2,9,16の3回 投 与,day 2 -16ま で の 連 日15回 投 与 の3群 と し(図2) _,総 投 与 量 は 同 一 と した.投 与 経 路 は チ ュ ー ブ を 介 し て の 経 門 脈 的 投 与 と,尾 静 脈 よ りの 経 静 脈 的 投 与 と した.コ ン トロ ー ル群,5-FU群(1, 3,15回 投 与,経 門 脈 ・静 脈 的 投 与),MMC群 323

(1,3,15回 投 与,経 門 脈 ・静 脈 的 投 与),CDDP 群(1,3,15回 投 与,経 門 脈 ・静 脈 的 投 与), そ れ ぞ れn=5で 実 験 を施 行 した.腫 瘍 細 胞 注 入 後21日 目 に ラ ッ トを 屠 殺 し,治 療 効 果 判 定 の た め に,肝 表 面 の 転 移 結 節 数 を 測 定 し た. 図1  門脈 に挿 入 した チ ュー ブ を背 部 皮 下 にて ア ダ プ ター に 接 続 固定 したF344ラ ッ ト 図2  薬 剤 投 与 の ス ケ ジ ュ ー ル 図3  腫 瘍細胞門脈内接種後21日 目の多発肝転移結節 図4  腫瘍細胞門脈内接種後1日 目の門脈 内腫 瘍塞栓 効 果 判 定:効 果 判 定 はday 21に ラ ッ トを屠 殺 し,肝 表 面 の 転 移 結 節 数 を 測 定 し,薬 剤 無 投 与 群 の 肝 転 移 結 節 数 を コ ン トロー ル と し て 抑 制 率 (inhibition rate)を 算 定 し,肝 転 移 腫 瘍 増 殖 抑 制 率 と した.副 作 用 の 指 標 と し て はday 21に お け る ラ ッ ト体 重 を 測 定 し,延 命 効 果 は 腫 瘍 細 胞 接 種 後 腫 瘍 死 す る まで の 生 存 日数 に よ っ た.統 計 学 的 評 価 はStudent's t testを 用 い た. 投 与 経 路 別 肝 組 織 内 薬 剤 濃 度 の 測 定:投 与 経 路 別 の 薬 剤 の 肝 組 織 内 濃 度 の 推 移 をみ る ため に, 薬 剤 と して5-FUを 選 択 し,薬 剤 投 与 後5,10, 15,30,60,90,120,180,240分 に そ れ ぞれ ラ ッ トを 脱 血 死 させ,全 肝 を 摘 出,直 ち に 凍 結 保 存 し,摩 砕 後,高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィー 法 に よ り薬 剤 濃 度 を測 定 した. 結 果 1. 肝 転 移 モ デ ル の作 成 腫 瘍 細 胞5×106個 門 脈 内 接 種 後21日 目,肝 全 葉 に散 在 して 肉 眼 的 転 移 が 認 め られ た(図3). 肝 表 面 の 転 移 結 節 は 小 円 形 で,直 径1-2mm,

そ の 数 は 約200/肝 で あ っ た.転 移 巣 は 肝 全 体 に 多 発 して 認 め られ た が,腎,脾,肺 な どの 他 臓 器 に は 肉 眼 的 転 移 は 認 め な か っ た.腫 瘍 細 胞 門 注 後1日 目,肉 眼 的 肝 転 移 を 認 め な い が 門 脈 内 に 腫 瘍 塞 栓 を 認 め た(図4).更 に5日 目 に は, 肝 表 面 被 膜 下 に 中分 化 型 腺 癌 の 微 小 転 移 巣 の 形 成 を認 め た(図5). 図5  腫 瘍 細 胞 門脈 内 接種 後5日 目の被 膜下 微 小 転 移 巣 図6  5-FUの 経 門 脈 的投 与 と経 静脈 的 投 与 に お け る肝 転移 増 殖 抑制 効 果(A)と 体 重 の推 移(B)の 比 較 図7  5-FUの 経 門脈 的 投 与 と経 静脈 的 投 与 に おけ る生 存 日数 の 比較 2. 実 験 化 学 療 法 5-FU経 門 脈 的 投 与 に お け る転 移 腫 瘍 増 殖 抑 制 率 は,1,3,15回 投 与 い ず れ も経 静 脈 的 投 与 に 比 し有 意 に 高 か っ た(p<0.05).5-FU経 門 脈 的 投 与 と経 静 脈 的 投 与 に お け る体 重 減 少 に は 有 意 な 差 を 認 め な か っ た が,1回 投 与 は3, 15回 投 与 が 体 重 減 少 を示 し た の に 比 し,軽 度 で は あ るが,体 重 増 加 傾 向 に あ っ た(図6).生 食 投 与 の コ ン トロー ル群 は全 例34日 以 内 に死 亡 し, そ の 平 均 生 存 日数 は30.5日 で あ っ た.5-FU経 門 脈 的 投 与 に よ る 平 均 生 存 日数 は,1,3,15 回 投 与 と も コ ン トロ ー ル 群 に 比 し有 意 に延 長 し た(p<0.05).し か し,経 静 脈 的 投 与 に お け る 延 命 効 果 は 僅 か で あ り,有 意 な差 は 認 め な か っ た(図7). 5-FU 150mg/kgを 投 与 後 の 経 時 的 薬

剤肝 組織 内濃度 は,経 静 脈的 投 与 に比 し経 門脈

的投 与 の減衰 は遅延 し,2-3倍

の 高濃 度 が維

持 され て いた(図8).

図8  肝 内5-FU濃 度 の 経 時的 推 移 図9  MMCの 経 門 脈 的投 与 と経 静 脈 的 投 与 にお け る肝 転 移 増殖 抑 制効 果(A)と 体 重 の推 移(B)の 比 較 図10  CDDPの 経 門脈 的 投 与 と経 静 脈 的投 与 にお け る肝 転 移 増殖 抑 制効 果(A)と 体 重 の推 移(B)の 比 較 MMC投 与 に お け る肝 転 移 増 殖 抑 制 効 果 は い ず れ も経 門 脈 的 投 与 が 経 静 脈 的 投 与 に 比 し高 く, ま た15回 投 与 が1,3回 投 与 に 比 し 高 い傾 向 に あ っ たが 有 意 な差 は 認 め られ な か っ た.ま た 体 重 減 少 に つ い て は 経 門 脈 ・静 脈 的 投 与,1,3, 15回 投 与 間 に そ れ ぞ れ有 意 な差 は な か っ た(図 9).CDDP投 与 に お け る肝 転 移 増 殖 抑 制 効 果 は い ず れ も経 門脈 的 投 与 が 経 静 脈 的 投 与 に 比 し高 い 傾 向 が あ っ た が,1,3,15回 投 与 の 抑 制 効 果 に は 差 が なか っ た.体 重 減 少 に つ い て は1回 投 与 が3,15回 投 与 に 比 し,ま た 経 門 脈 的 投 与

が 経 静 脈 的 投 与 に 比 し そ れ ぞ れ 少 な い 傾 向 に あ っ た が,有 意 な 差 で は な か っ た(図10) _. 考 察 大 腸 癌 肝 転 移 に 対 す る 関 心 の 向 上 と と もに, 大 腸 癌 肝 転 移 モ デ ル を 用 い た研 究 が 増 加 して い る.こ れ ま で の 報 告 を み る と,動 物 は マ ウ ス が 主 と し て 用 い ら れ て お り,肝 転 移 の 作 成 方 法 は, 腫 瘍 細 胞 の 門 脈 内 投 与6-8),脾 臓 内 投 与9,10),盲腸 内 投 与11)が 行 わ れ て い る.ま た 化 学 誘 発 剤 で 大 腸 癌 を発 生 させ,自 然 肝 転 移 を作 成 す る方 法 も 報 告 さ れ て い る12). 著 者 は1, 2-dimethyl hydrazine (DMH)誘 発 の ラ ッ ト大 腸 癌(RCN-9)を 用 い て 肝 転 移 モ デ ル を作 成 し た.ラ ッ ト門 脈 内 に チ ュ ー ブ を挿 入 し,皮 下 トン ネ ル を通 し背 部 に て ア ダ プ ター に 接 続 し た た め,制 癌 剤 の 経 門 脈 的 間 欠 投 与, 持 続 投 与 の 実 験 系 に も応 用 で き る.本 腫 瘍 は 組 織 学 的 に は 中分 化 腺 癌 で,RPMI-1640培 養 液 で 継 代 が 容 易 で あ る. しか も,腫 瘍 細 胞 の 門脈 内 投 与 に よ り,比 較 的 短 期 間 に 全 例,肝 全 葉 に 散 在 して 微 小 肝 転 移 結 節 を形 成 す る.こ れ ら の こ とか ら,本 モ デ ル は 今 後 大 腸 癌 肝 転 移 に 対 す る 実 験 化 学 療 法,殊 に 経 門 脈 的 投 与 の 検 討 に 有 用 で あ る と考 え る. 動 物 モ デ ル に お け る 肝 転 移 の 評 価 方 法 に は, 肝 重 量,肝 転 移 数 の 測 定 の ほ か,ア イ ソ トー プ 法9), Bosslet13), Wexler14)ら の 方 法 な どが あ る. 著 者 は 有 意 差 の 検 出 感 度 は低 い も の の,簡 便 で あ る こ と か ら,肝 転 移 増 殖 抑 制 に は 肝 転 移 数 の 測 定,治 療 効 果 の 評 価 は 生 存 日数 の 比 較 を 用 い た. 今 回,本 モ デ ル を用 い て 肝 転 移 に 対 す る実 験 化 学 療 法 を施 行 し た.一 般 に,肉 眼 的 肝 転 移 結 節 が 形 成 され た 段 階 で は,転 移 癌 の 化 学 療 法 に よ る抑 制 は 困 難 で あ る こ とが 報 告 さ れ て い る の で15),転移 早 期 の 段 階 で あ る微 小 転 移 巣 の 時 期 に 制 癌 剤 を投 与 す る こ と と した. 大 腸 癌 肝 転 移 巣 の 栄 養 血 管 に 関 して は,い く つ か の 報 告 が あ る.肉 眼 的 肝 転 移 巣 の 場 合 は 大 部 分 が 動 脈 支 配 で あ る こ とが知 られ て い る16).直 径0.5-1.0mmの 肝 転 移 巣 で は,動 脈 支 配 が80% で,門 脈 支 配 が20%で あ る と さ れ る17).し か し, 転 移 の さ ら に 早 期 の 段 階 で あ る微 小 転 移 に お い て,肝 動 脈 と門 脈 が ど の よ う に 栄 養 供 給 し て い るか に つ い て は,未 だ 不 明 で あ る. 大 腸 癌 の 術 後 肝 転 移 再 発 に は,手 術 操 作 に よ り腫 瘍 細 胞 が 流 血 中 に 遊 離 し 門脈 を介 して 肝 に 着 床 転 移 す る もの と,手 術 時 す で に 微 小 転 移 巣 が 形 成 さ れ て い る もの が 考 え られ る18).いず れ に して も,肝 再 発 が 経 門 脈 的 に 成 立 す る.と す れ ば,微 小 転 移 の 段 階 で の腫 瘍 へ の 栄 養 供 給 は, 門 脈 優 位 の 可 能 性 が 高 い. Linは 腫 瘍 が 微 小 の と き は 門 脈 血 の供 給 が 優 位 で,腫 瘍 の 増 大 に 伴 い 門 脈 枝 が圧 迫 され,代 わ っ て 動 脈 血 の 供 給 が 増 加 す る と述 べ て い る19). 臨 床 的 に は 大 腸 癌 の 治 癒 切 除 後 に,臍 静 脈 か ら カ テ ー テ ル を挿 入 し5-FUを 投 与 し た 症 例 で は,有 意 に 肝 転 移 再 発 の 頻 度 が 低 下 し た との 報 告 も あ る20).その 後,同 様 の 報 告 も な さ れ た が21), 反 論 も あ る.反 論 に は 二 つ あ る.ひ とつ は,異 時 性 肝 転 移 は 約30%に 過 ぎず,そ の 他 の 患 者 で は 治 療 を必 要 と しな い2,22).い ま ひ とつ は,投 与 さ れ た制 癌 剤 に 感 受 性 が な け れ ば 転 移 腫 瘍 の 増 殖 をか え っ て促 進 す る の で は な い か とい う もの で あ る22,23). 今 回,腫 瘍 細 胞 門 注 後,微 小 転 移 の段 階 と考 え られ る 時 期 に 制 癌 剤 の 経 門 脈 的 ・静 脈 的 投 与 を施 行 した.い ず れ に お い て も,経 静 脈 的 投 与 に 比 し経 門 脈 的 投 与 が 肝 転 移 増 殖 抑 制 が 高 い 傾 向 に あ っ た.5-FUを 用 い た 肝 組 織 内薬 剤 濃 度 の 測 定 か ら,経 門 脈 的 投 与 に お い て 薬 剤 の 減 衰 が 遅 延 し,高 濃 度 の 薬 剤 が 維 持 さ れ て い た.こ の こ とか ら,経 門 脈 的 投 与 の 高 い 肝 転 移 増 殖 抑 制 は 肝 局 所 の 高 い 薬 剤 濃 度 に よ る抗 腫 瘍 効 果 の 増 強 に あ る と考 え られ る. 1,3,15回 投 与 間 で は,肝 転 移 増 殖 抑 制 効 果 に お い て そ れ ぞ れ 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た.し か も副 作 用 の 指 標 と して の 体 重 減 少 は, MMC投 与 群 以 外 は1回 投 与 が 少 な い傾 向 に あ っ た.従 っ て, time-dependentで あ る と考 え ら れ て い る5-FUな ど も, bolus injectionの 方 が 連 日投 与 に 比 し,副 作 用 を軽 減 し,し か も連 日 投 与 と同 等 な 腫 瘍 増 殖 抑 制 効 果 を 有 す る こ とが 示 唆 さ れ る.

ま た 副 作 用 に 関 して は,経 門 脈 的 投 与 が 経 静 脈 的 投 与 に 比 し小 さ い 傾 向 に あ っ た.近 年,肝

悪 性 腫 瘍 に 対 し,肝 動 脈 や 門 脈 に カ ニ ュ レー シ ョ ン を 行 い,そ れ に接 続 し た 皮 下 に留 置 し た リ ザ ー バ ー よ り制 癌 剤 を注 入 す る療 法 が 試 み ら れ つ つ あ る が23),局 所 に 高 濃 度 の 薬 剤 を 到 達 させ, 抗 腫 瘍 効 果 の 増 強 と副 作 用 の 減 少 を 図 る こ とに あ り,著 者 の 研 究 は こ の こ と を実 験 的 に 証 明 し た も の と考 え る. 今 回 の 実 験 は,微 小 肝 転 移 の モ デ ル を 想 定 し, 制 癌 剤 の 門 脈 投 与 を施 行 し た.そ の結 果,経 静 脈 的 投 与 に 比 し,肝 転 移 数 は 有 意 に減 少 し,生 存 日数 の 延 長 も有 意 で あ っ た.こ の こ とは,感 受 性 の あ る制 癌 剤 の 門 脈 内 投 与 に よ り,病 巣 の 根 絶 に は 到 ら な い が,微 小 肝 転 移 巣 の 増 殖 を 抑 制 し得 る 可 能 性 を 示 唆 す る. 近 年,術 前 ・術 中 の 画 像 診 断 を 中心 と し た 肝 転 移 の 検 索 が す す み,微 小 肝 転 移 の 診 断 が 可 能 と な りつ つ あ る.ま た,術 後 の 原 発 巣 の 免 疫 組 織 学 的 検 討 に て 肝 転 移 再 発 のhigh risk group の 判 別 もな され る よ うに な って き た24,25)_{.従 って,} 経 門 脈 的 制 癌 剤 投 与 を必 要 とす る 患 者 の 選 定 に よ っ て,そ の 術 後 補 助 化 学 療 法 と して の 臨 床 的 効 果 は 高 ま る もの と思 わ れ る. 結 論 1. ラ ッ トを 用 い 大 腸 癌 肝 転 移 モ デ ル を 作 成 した.腫 瘍 細 胞 の 門 脈 内 注 入 に よ り,比 較 的 短 期 間 に100%肝 転 移 が 成 立 し,大 腸 癌 肝 転 移 の 実 験 化 学 療 法 に,殊 に 経 門 脈 的 化 学 療 法 の 治 療 実 験 に 有 用 で あ る と考 え られ た. 2. 制 癌 剤 の 門 脈 内 投 与 は静 脈 内 投 与 に比 し, 副 作 用 少 な く,し か も微 小 肝 転 移 の 発 育 を よ り 強 く抑 制 す る可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 稿 を終 え る に あた り,御 指 導,御 校 閲 を賜 った折 田薫 三教 授 に謝 意 を表 します.ま た,直 接 御 指導 を 戴 いた 淵 本定 儀 前 講 師,岩 垣 博 巳助 手 に深 謝 す る と ともに,多 大 の御 援 助 を戴 い た本 学 第一 外 科 消化 器 グ ルー プ の諸 兄 に 感謝 致 します. 文 献 1) 森 谷 宣 晧, 小 山 靖 夫, 北 条 慶 一:大 腸 癌 肝 転 移 の 検 討-転 移 巣 の 切 除 と そ の 遠 隔 成 績 を 中 心 に-. 日 本 大 腸 肛 門 病 会 誌 (1983) 36, 1-6. 2) 椎 木 滋 雄, 淵 本 定 儀, 岩 垣 博 巳, 安 井 義 治, 佐 々 木 章 公, 大 倉 充 博, 浦 久 保 直 澄, 浜 田 史 洋, 三 村 久, 折 田 薫 三:大 腸 癌 同 時 性 肝 転 移 症 例 の 臨 床 病 理 学 的 検 討. 日 本 大 腸 肛 門 病 会 誌 (1991) 44, 1107-1112. 3) 富 永 健:大 腸 癌 の 予 後 因 子. 癌 と 化 療 (1988) 15, 2202-2208.

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Efficacy of adjuvant portal vein chemotherapy

for liver micrometastases

Yoshihiro AKAZAI

First Department of Surgery,

Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan

(Director: Prof. K. Orita)

To establish an effective chemotherapy against liver metastases, we compared the anti proliferative effects of portal vein drug administration with that of intravenous administra tion, using a rat hepatic micrometastasis model. The model was produced by inoculating 1, 2-dimethyl hydrazine (DMH)-induced rat colonic carcinoma (RCN-9) cells into the portal vein. The drugs used were 5-fluorouracil (5-FU), mitomycin-C (MMC) and cisdiammine

dichloroplatinum (CDDP), at total doses of 150mg/kg, 6mg/kg and 8mg/kg, respectively. Animals were classified into three groups in terms of drug administration times; one time

administration 2 days after tumor cell inoculation (day 2), three times on days 2, 9 and 16, and daily for fifteen days between day 2 and day 16. On day 21 after inoculation of the tumor cells, all rats were sacrificed and metastatic nodules were calculated. Portal vein administration of anticancer drugs, 5-FU, MMC, CDDP, had a tendency to inhibit the proliferation of liver micrometastases and was accompanied by fewer side effects, in comparison with intravenous

infusion. In addition, significant prolongation of survival was achieved in the portal vein infusion group.

These results suggest that intraportal administration of drugs is an effective modality to inhibit micro or occult liver metastases.