コ ロニ ー形 成 法 を利 用 した ヒ ト肺 癌 の 診 断 な らび に治 療 に関 す る研 究
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(2) 674. 宮 Table. 1.. 井. Characteristics. 正. 博. of ABC-1,. CPA: Cyclophosphamide,. EBC-1. PCZ: Procarbazine,. and. SBC-1. VCR: Vincristine, MMC: Mitomycin. MTX: Methotrexate. C, NCS: Neocarzinostatin. ADM: Adriamycin は,生. 前CPA,. VCR,. zinostatinに. MTX,. PCZやNeocar. よ る強 力 な 化 学 療 法 が 行 わ れ た が,. こ れ に ま っ た く反 応 せ ず 死 亡 して い る. EBC‑1 の 倍 加 時 間 は42時 間 で あ っ た. SBC‑1は 不 明 の ま ま 右 肺 下 葉 切 除 術 を うけ,胸. 組織 型 水貯留で. 再 発 した 中 間細 胞型 肺 小 細胞 癌 患 者 の癌 性 胸 水 か ら 樹 立 さ れ た. SBC‑1のdonorに CPA,. VCR,. ADM,. MTX,. MTXの. PCZに. 対 して は. よ る 多 剤 併 用 療 法,. 胸 腔 内 投 与 が 行 わ れ たが 著 効 を. 奏 さ な か っ た.こ. のSBC‑1細. は 浮 遊 増 殖 し,互. い に 密 に 結 合 し て お り,そ. 胞 は大部分の細 胞 の. 倍 加 時 間 は53時 間 で あ る. 3種 類 の 細 胞 株 は,ス μg/ml(明. 治 製 菓 製),ペ. Fig. 1.. 2‑メ ル カ プ トエ タ ノ ー ル10mEq. で は,培. /l(Sigma製)を. 含 むRosewell. %ト. al Institute 1640(RPMI %胎. 児 ウ シ 血 清(Fetal. Park. Memori. 1640; Gibco製)に10 Calf. Serum;. FCS,. 加 え た 培 養 液 に て, 37℃,. 酸 ガ ス 培 養 器 で 継 代 培 養 さ れ て い る.実 対 数 増 殖 期 に あ る 生 細 胞 率90%以. 5%炭 験 には. 上 の 細 胞 を用. い た.. assay. for chemo. 養 液 を 除 い た あ と0.05%. リプ シ ン 液(Gibco製)を. EDTA加0.25. 加 え37℃ で5分. 間 作 用 させ て 単 一 細 胞 浮 遊 液 を 作 成 し,こ 1500r. p.m.. 5分 間 遠 沈 し培 養 液 に て2回. 験. 方. 2). 制癌 剤 へ の 接 触. ADM,. 40497S,. MMC,. MTX,. 培 養 液 に よ り行 っ た. CDDPは 法. VCRは. し た.各. 一 細 胞 浮遊 液の 作 成. 浮 遊 増 殖 す るABC‑1お. よ びSBC‑1に. ついて. ペ ッ ト操 作 に よ り.単一 細 胞 浮 遊 液 を作 成. し た.培. 養 容 器 の 底 面 に 付 着 し増 殖 す るEBC‑1. 3)培. 後 の希 釈 は. 胞 数 は2〜. な る よ う に 調 整 し,制 癌 剤 を5〜. 9薬 剤 濃 度 に 希 釈 し, 37℃ で1時. 以 下 に そ の 詳 細 を述 べ る. 1)単. 10×104/mlに. 生理. 液 体 状 で あ り,. 直 接 培 養 液 に よ り希 釈 を 行 っ た.細 Fig. 1に 実 験 方 法 の あ ら ま し を 図 示 す る が,. れを. 洗浄 し. た もの を 用 い た.. 食 塩 水 に よ り最 初 の 溶 解 を行 い,以 実. は,ピ. cloning test. ニ シ リン100単 位/ml. (明 治 製 菓 製),. Gibco製)を. Soft agar sensitivity. ト レ プ トマ イ シ ン100. 薬 剤 の 最 終 濃 度 はTable. 間incubate 2に 示 し た.. 養 株 細 胞 のplating. 制 癌 剤 に 接 触 させ た の ち, 1500r. p.m.で5分 間 遠 沈 し上 清 を す て 培 養 液 に て2回. 洗 浄 し,. 2.
(3) コ ロ ニ ー 形 成 法 を 利 用 し た ヒ ト肺 癌 の 診 断 な ら び に 治 療 に 関 す る 研 究 Table. 2.. Drug concentration experiments. studied. ニ ー と して,そ. in the. な お,実 plicateの. 675. の 数 を 算 定 し た.. 験 結 果 は,. 1薬 剤 濃 度 に つ い てtri. 測 定 を行 っ た 実 験 を少 な く と も2回. 繰 り返 し,そ. れ を総 括 し て 表 わ し た.各. 度 に お け る 生 細 胞 率 は,薬. 剤 無 添加 にお け る コ. ロ ニ ー 数 に 対 す る 比 率 で 表 わ し,こ トし てsurvival. curveを. 性 はsurvival. curveか. 薬剤濃. れをプロッ. 作 成 し た.薬. 剤 感受. ら得 ら れ る90%致. 死濃. Fig. 2. Morphology of coloniesof EBC‑1 cellgrown in soft agar on 14th day of plating 層 法 軟 寒 天 培 地 を 用 い 培 養 し た.す mmグ. リ ッ ド付 き 直 径35mmの. ャ ー レ(Lux製)を rine. 用 い,. Colloids製),. ウ ム1.2g/l, RPMI. FCS. 2‑メ. 1640を. 15%,炭. layer. g/l,. FCS. 15%,炭. 重 層 さ せ た.低. 温 室 に 約5分. 固 ま ら せ た の ち37℃, 2週. 1mlを. 間incubateし,. 5%炭 30個. あ らか. の 上 にaga. 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム1.2. 培 養 株 細 胞 を 含 むplating. Dose90;. (LD70)で. 表 わ し た.. LD90)お. よ び70%致. 成 酸 水素 ナ トリ. 2‑メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル10mEq/l,. 1640に. 度(Lethal. 死 濃度. 0.5%(Ma. ル カ プ ト エ タ ノ ー ル10mEq/l,. 含 むfeeder. 0.3%,. 2. プ ラス チ ック シ agarose. じめ 室 温 に て 固 ま ら せ て お き,そ rose. な わ ち,. layer. RPMI 1mlを. 間静 置 して 寒天 を 酸 ガ ス培 養 器 に て. 以 上 の細 胞集 塊 を コロ. ABC‑1,. EBC‑1,. 績 SBC‑1の3種. 類の細 胞株は い. ず れ も 軟 寒 天 培 地 に お い て コ ロ ニ ー を 形 成 し, コ ロ ニ ー 形 成 率(Colony CFE)は Fig.. そ れ ぞ れ2%, 2はEBC‑1細. Forming 4.5%,. Efficiency; 1%で. あ っ た.. 胞 の コ ロ ニ ー で あ る が,. い ず れ の 組 織 型 の 肺 癌 細 胞 も,境. 界 明瞭 な 細 胞. 集 塊 を 形 成 し た. ABC‑1,. EBC‑1. そ れ ぞ れFig.. SBC‑1のsurvival. 3, Fig.. 4, Fig.. curveを 5に. 示 す.ま. た90.
(4) 676. 宮. 井. 正. 博. 1時 間 の 接 触 で は 充 分 な 殺 細 胞 作 用 を 示 さ な か. Table 3. Lethal dose 70% (LD70) and 90% (LD90) of drugs tested in the three cell lines. っ た. MTXは26(μg/ml)でLD70と 100(μg/ml)で. もLD90に. は10(μg/ml)の 2). て はABC‑1の. MMC,. れ10(μg/ml)の. %致. 死 濃 度(LD90)と70%致. Table 1). 3に. 濃 度 で も20%の. MMC,. 濃 度 依 存 性 の 殺 細 胞 性 を 示 し た. CDDPは. ADMで. 強 く,. LD90は. (μg/ml), 3.8(μg/ml)で. MMC,. そ れ ぞ れ0.19,. LD70は. そ れ ぞ れ0.11, あ っ た.. MTX,. 0.55,. 対 し てEBC‑1は. 達 し な か っ た. VCRに. 場 合 と同 様 に, 10(μg/ml)の 達 し な か っ た.. 1.6,. VCRは. あ っ た. MTXに. で もLD70に. 細. 3). SBC‑1の SBC‑1で. MTXに. 7.9. VCRはABC‑1,. 0.85,. 40497S,. 濃度. EBC‑1に. 5). 比 して特 に. 対 す る 感 受 性 が 低 く, 100(μg/ml)の. 濃 度 で も20%の. と もに. 関 して. 制 癌 剤 感 受 性 試 験(Fig. は, ABC‑1,. 順 に. ml)の. 7.6. assay. はABC‑1の. 40497Sの 1.48,. 0.6,. MMC,. 40497S,. は そ れ らよ りも急峻 な直 線. CDDP,. そ れ ぞ れ0.16,. ず れ も. 的 な カ ー ブ を 描 い て 生 細 胞 率 は 減 少 し た.殺 胞 作 用 はADM,. MMC,. そ れ ぞ れ0.46, 1.5,. り さ ら に 感 受 性 が 低 く100(μg/ml)の. 濃 度 で もLD70に. 3). 両 対 数 グ ラ フ で 上 に 凸 な 曲 線 を示 し た. の に 対 し,. by cloning. ABC‑1よ. CDDPは,い. LD70は. (μg/ml)で. 死 濃 度(LD70)を. 制 癌 剤 感 受 性 試 験(Fig.. 40497S,. cells. 関 し. 殺 細 胞 作 用 しか. 細 胞 作 用 はADM,. 順 に 強 く, LD90は. 10(μg/ml),. for ABC-1. ま と め た.. ABC‑1の ADM,. curves. 4). VCRに. 対 して は 耐 性 を有 す る と思 わ. 示 さ な か っ た.殺. Fig. 3. Survival. MTX,. 場 合 と 同 様 の 傾 向 を 示 し た が,. EBC‑1はCDDPに. (mcg/ml). 達 しな か っ た.. 制 癌 剤 感 受 性 試 験(Fig.. 40497S,. 40497Sの. 達 し な か っ た. VCR. 濃 度 で もLD70に. EBC‑1の ADM,. な っ た が,. 殺 細 胞 作 用 し か 示 さ な か っ た. EBC‑1の. 濃 度 で もLD70に MMC,. 場 合 と同 じ く10(μg/ 達 し な い. ADM,. CDDPはABC‑1の. 場 合 と同 じ.
(5) コ ロ ニ ー 形 成 法 を 利 用 し た ヒ ト肺 癌 の 診 断 な ら び に 治 療 に 関 す る 研 究. Table given. 4. Maximum intravenously. Fig. 4. Survival. curves. for EBC-1. cells by cloning. assay. Fig. 5.. curves. for SBC-1. cells. assay. Survival. blood levels to patients. of drugs. by cloning. 677. Table 5. Response of bronchogenic carcino ma to monochemotherapy by cell type suma rized and reported by Selawry and Leghra.
(6) 678. 宮. く濃 度 依 存 性 の 殺 細 胞 作 用 を 示 し,殺 はADM, D90は. MMC,. CDDP,. そ れ ぞ れ0.27,. LD70は ml)で. 40497Sの. 0.8,. そ れ ぞ れ0.14,. 3.0,. 0.22,. 井. 細胞作用. 順 に 強 くL 7.5(μg/ml),. 0.8,. 正. 博. い る 方 法 は 手 技 は や や 繁 雑 で あ る が,前. 他 の 方 法 に 伴 う 欠 点 が な く薬 剤 へ の 接 触 時 間 が 任 意 で あ り細 胞 死 を 厳 密 に 定 量 的 に 表 現 す る と い う長 所 が あ り最 適 の 方 法 で あ る と考 え られ る .. 4.2(μg/. あ っ た.. ヒ トに お け る 薬 剤 の 体 内 動 態 を検 討 す る と, one 考. 案. 一 般 的 に 細 胞 死 に は , mitotic ductive. death;増. (interphase と は,放. 述 した. 期 死)が. 注 後 の 血 中 濃 度 は 多 くの 場 合,急. 峻 なdistribution nation. death(repro. 殖 死)とnon‑mitotic. death;間. shot静. death. あ る17).増 殖 死. 射 線 あ る い は 制 癌 剤 に 接 触 させ られ た. phaseか. phaseへ. ら ゆ る や か なelimi. 移 行 し,こ の 変 曲 点 に お け る 濃. 度 は 投 与 直 後 の 最 高 血 中 濃 度 の1/10〜1/20に. 相. 当 し22,23),こ れ は 近 似 的 に 臓 器 内 濃 度 を 反 映 し て い る も の と思 わ れ る.し. た が っ て この 濃度 で. 細 胞 が 一 見 正 常 と 異 な ら な い 機 能 を 示 し な が ら,. の1時. 細 胞 分 裂 直 後 あ る い は 分 裂 を く り返 し な が ら 死. 相 関 を 論 ず る 上 で ひ とつ の 理 論 的 根 拠 を 与 え る. に 至 る も の で あ り,間 期 死 と は 細 胞 分 裂 とは 直. もの と い え る.今. 接 の 関 係 な く死 に 至 る も の で あ る.増. 床 投 与 量 で 得 ら れ る 最 高 血 中 濃 度 を 文 献 か ら収. 合 は,細. 胞 の 増 殖 能 の 有 無,す. 殖死の場. なわ ち コロニ ー. 間 の接 触 に お け る細 胞 死 は 臨床 効 果 との. 録 しTable. 回 検 討 した6剤. に つ い て,臨. 4に 示 し た. 40497Sは. 形 成 能 に よ っ て 明 確 な 生 死 の 判 定 が で き る. Ro. shot静. perとDrewinkoは. した と 仮 定 す れ ば 理 論 的 に は 最 高 血 中 濃 度 は260. timeを. コ ロ ニ ー 形 成 法 とdoubling. み る 方 法, labeling. clusion法,. index法,. dye‑ex. μg/mlと. 51Cr release法,〔3H〕thymidine. 摂 取 率 を み る 方 法 を比 較 し て,コ. て70%以. ロニー 形 成 法. が細 胞 死 を反映 す る最 も適 確 な方 法 で あ る こ と を証 明 し て い る13) 従 来 行 わ れ て き た 肺 癌 細 胞 株 を 用 い たin. 注 は 不 可 能 で あ るが,. 難 溶 性でone. vi. な る.最. 高 血 中 濃 度 の1/10濃. 投与. 度におい. 上 の 殺 細 胞 効 果 が 得 ら れ た も の をin. vitroで 感 受 性 あ り とす る と判 断 す る と, 40497 SがABC‑1,. EBC‑1,. SBC‑1の. い ず れ に 対 して. も感 受 性 を 有 す る が,他. の 薬 剤 はin. 受 性 を 有 さ な か っ た.今. 回 検 討 し た3種. tro制 癌 剤 感 受 性 試 験 に は下 記 の 方 法 が あ る.す. 株 のdonorはTable. な わ ち下 山 は1層. MTX,. の 軟 寒 天 培 地 法 を用 い, CFEの. 20mg/kgを. vitroで 感 の細 胞. 1に 示 し た ご と くCPA,. VCR,. PCZに. よい細 胞 株 のみ に つ い て検 討 して い るが 基本 的. 法 の ほ か,. に は 今 回 の 方 法 と類 似 して い る10).最 近,イ. 与 が 行 わ れ た が 著 効 は 得 らて お ら ず16), in vi. シ ュ リ ン,ト wth. ラ ン ス フ ェ リ ン, Epidermal. Factor(EGF)な. ン Gro. どが 細 胞 の成 長促 進 因子. と して 注 目 され て お り18〜20),特 にEGFは. 肺癌. 細 胞 か ら も産 生 さ れ る こ とが 報 告 さ れ て い る21). Feeder. layerを. 用 い た 今 回 の 方 法 は, condition. ingと い う点 で 改 善 の 余 地 を 残 して い る.辻 平 板 寒 天 法 を 用 い て い る が,こ. らは. の方 法 は 感受 性. MMC,. よ る 強 力 な化 学 療. ADM,. MTXの. 胸腔 内投. troで 各 種 制 癌 剤 に 対 し て 感 受 性 が 低 く, donor にお いて も生前 化 学 療 法 の臨 床効 果が 認 め られ な か っ た 点 で は 一 応 の 相 関 を 示 し た. 肺 癌 は 組 織 型 に よ り化 学 療 法 の 有 効 率 に か な りの 差 が あ りSelawry32),. Leghra33)ら. が文 献 的. に 欧 米 の 報 告 か ら検 討 した 単 剤 に お け る 化 学 療 法 の 臨 床 効 果 はTable EBC‑1,. な 定 量 的 評 価 が 下 せ な い 点 と常 時 薬 剤 に 接 触 し. 較 す る と,. て い る 点 に 問 題 が あ る11).長 瀬 の 行 っ た マ イ ク. 性 差 は あ ま り認 め ら れ な か っ た(Table. ロ プ レ ー ト を 用 い て 微 小 コ ロ ニ ー 形 成 能 を見 る. の こ とは3種. 方 法 は,培. て 耐 性 を 示 し た 患 者 か ら 培 養 樹 立 され た こ と を. 養 液 が 節 約 で き る 長 所 が あ る が,腫. 瘍 細 胞 の 同 定 が 困 難 で あ り,ま. た 微 小 コ ロニ ー. で は 正 確 な 増 殖 死 を 表 現 し な い 欠 点 が あ る12) 以 上 よ り,今. 回 用 い た2層. 法 軟 寒 天培 地 を用. SBC‑1の3種. 5の 如 く で あ る. ABC‑1,. を コ ロ ニ ー の 形 態 に よ り判 定 し て い る た め 厳 密. 類 の 細 胞 株 のLD90を. 3種 類 の 細 胞 株 のin. 比. vitro制 癌 剤 感 3).こ. 類 の細 胞株 と も各種 制 癌 剤 に対 し. 反 映 し て い る も の と思 わ れ る. Barrancoら. は同一 臓 器癌 で 同一組織 型由来の. 細 胞 株 で も制 癌 剤 に 対 す る 感 受 性 は 異 な る こ と.
(7) コ ロ ニ ー 形 成 法 を利 用 し た ヒ ト肺 癌 の 診 断 な ら び に 治 療 に 関 す る研 究 を報 告 し て お り34),実 地 臨 床 の 場 に お い て は 今. 少 な か っ た.. 後 個 々 の 患 者 か ら の サ ン プ ル を用 い て 直 接in. 今 回 の 実 験 は 既 存 の 薬 剤 の 投 与 法 の 再 検 討,. vitro制 癌 剤 感 受 性 試 験 を行 う こ と が 望 ま れ る.. 多 剤 併 用 化 学 療 法 に お け る相 乗 効 果 の 基 礎 的 実 験,新. 結. 語. agar. cloning. 法 に よ り検 討 し た. Adriamycin, C, cis‑Platinumは. 性 を示 し, Methotrexate,. 用 の 可 能 性 を 示 し て い る.. 平. 40497S,. assay. 本論 文 を擱 筆 す るに あ た り,御 懇 篤 な る御 指 導 な. Mi. らび に御 校 閲 を賜 わ った 恩 師 木 村 郁 郎 教 授 に深 甚 の. 濃 度 依 存 性 の殺 細 胞 Vincristineは1時. 謝 意 を表 わ し ます.ま た,終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 を 賜 わ っ た 大 熨 泰 亮 講 師,平 木 俊 吉 博 士 に 深 謝 し ます.. 間. の 接 触 で は 充 分 な 殺 細 胞 性 を示 さ な か っ た. 90 %致 死 濃 度 で は3種. Schrek, R.:. 和56年 札 幌)に お い て 発 表 し た.. 考 文. 献. A method for counting the viable cells in normal and in malignant. Am. J. Cancer 28, 389-392, 2.. な お 本 論文 の 要 旨 は 第22回 日本 肺 癌 学 会 総 会(昭. 類 の細 胞株 間の 感受 性 差 は. 参 1.. 剤耐性. 細 胞癌 の細 胞 株 を用 いて 各種 制 癌 剤. に 対 す る感 受 性 試 験 をsoft. tomycin. し い 制 癌 剤 の ス ク リー ニ ン グ,薬. の 実 験 モデ ル の 作成 な ど きわめ て 多方面 へ の 応. 代 表 的 な ヒ ト肺 癌 の 組 織 型 で あ る 腺 癌,扁 上 皮 癌,小. 679. cell suspensions,. 1936.. Vycital, R. O., Schrek, R. and Clarke, T. H.:. Unstained cell counts as a method of evaluating. can. cerocidal agents. Cancer Res. 102, 304, 1952. 3.. Straus, F. H., Cheronis, N.D. and Straus, E.: Demonstration ms and living mammalian. 4.. tissues by triphenyltetrazolium. human breast cancer.. Surg. Gynecol. Obstet. 102, 420-426,. Knock, F. H.:. 6.. Bickis, I. J., Henderson, I. W.D. and Quastel, J. H.: 19, 103-113,. Sensitivity tests for cancer chemotherapy.. Science 108, 113-115,. 1948. on. 1956.. Arch. Surg. 91, 376-385,. Biochemical. 1965.. studies of human tumors.. Cancer. 1966.. Rygaard, J. and Povlsen, O.P.:. Heterotransplantaion. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 77, 758-760, 8.. chloride.. Black, M. M. and Speer, F. D.: In vitro and clinical effects of urethane plus triethylene melamine. 5.. 7.. of reducing enzyme systems in neoplas. Rous, P. and Murphy, J. B.:. of a human malignant. tumor to "nude" mice.. 1969.. Tumor implantation. in the developing embryo.. J. Am. Med. Assoc.. 150, 741, 1911. 9.. 副 島 清 治:. Diffusion. 10.. 下 山 正 徳:人. 11.. 辻 啓 次 郎,黄. chamberを. 用 い た 制 癌 剤 感 受 性 試 験 に つ い て,最. 癌 細 胞 培 養 と そ の 化 学 療 法 へ の 応 用,医 鉄 吉,高. 倉 信 孝:肺. ス ク リー ニ ン グ の 試 み‑,癌 12.. 長 瀬 千 秋:培 20,. 学 の あ ゆ み,. 癌 培 養 細 胞 の 制 癌 剤 感 受 性‑平. と化 学 療 法,. 3,. 74‑79,. 90,. 新 医 学,. 24,. 273‑283,. 1775‑1778,. 1969.. 1975.. 板 寒 天 コ ロニ ー 形 成 法 に よ る制 癌 剤. 1976.. 養 さ れ た ヒ ト肺 癌 細 胞 の 制 癌 剤 に 対 す る 感 受 性 の 測 定 に 関 す る 実 験 的 研 究,肺. 癌,. 20,. 11‑. 1980.. 13. Roper, P. R. and Drewinko, thality.. B.:. Comparison. Cancer Res. 36, 2182-2188,. 14. Takamizawa,. A., Matsumoto,. of in vitro methods to determine. drug-induced. S., Iwata, T., Katagiri, K., Tochino, Y. and Yamaguchi,. on cyclophosphamide. metabolites. and their related. of cyclophosphamide. and some related compounds,. 15. Hill, D.L., Laster, W. R. and Struck,. cell le. 1976.. R. F.:. compounds.. II. Preparation. J. Am. Chem. Soc. 95, 985-986,. Enzymatic metabolism. K.:. Studies. of an active species. of cyclophosphamide. 1973. and nicotine.
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