杉本利彦

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(1)静岡大学博士論文. プロナーゼおよびSDS耐性のホスフアターゼ活性因子の単離と性状の解析. 鐸周大軍圏雷. 1999年12月大学院理工学研究科環境科学専攻. 杉本利彦.

(2) 目次 1．要旨 2．略語 3．序 3・1・カエル卵成熟過程におけるリン酸化／脱リン酸反応 3・2・高分子量多機能性プロテアーゼ複合体（プロテアソーム）のリン酸化 3．3．研究目的. 4．材料と方法. 10. 4．1．実験動物. 10. 4．2．試薬類. 10. 4．3．培養液の組成. 11. 4．4．緩衝液の組成. 11. 4．5．ホスフアターゼ活性の測定法. 11. 4．6．ペプチダーゼ活性の測定法. 11. 4．7．卵母細胞の単離と／〃レ〃roでの培養. 11. 4・8・卵母細胞からの可溶性画分（サイトソル）の調製. 11. 4．9．卵巣からのプロナーゼ消化物の調製. 12. 4・10・DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィー. 13.

(3) 4・11・QAE一トヨパールカラムクロマトグラフィー. 13. 4・12・ゲルカラムクロマトグラフィー. 14. 4・13・グリセロール密度勾配超遠心分離. 14. 4・14・高速液体クロマトグラフィー. 14. 4・15・SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）. 15. 4・16・活性因子のホスフアターゼ活性に及ぼす各種試剤等の効果16 a）タンパク質ならびに核酸分解酵素による処理 b）各種化学試剤による処理 C）有機溶媒による処理. 4．17．アミノ酸分析 4．18．タンパク質の定量. 5．結果. 18. 5・1・アフリカツメガエル卵巣卵からのメガロホスフアターゼの単離と性状の解析. 18. 5・1・1・メガロホスフアターゼの単離. 18. 5・1・2・メガロホスフアターゼの性状の解析. 20. 1）タンパク質ならびに核酸分解酵素処理の効果. 20. 2）変性剤（エタノールおよび尿素）の効果. 21. 3）各種試剤の効果. 21. 4）温度の効果. 22. 5・2・アフリカツメガエル卵巣卵プロテアーゼ消化物からのホスフアターゼ活性因子の単離と性状の解析. ii. 23.

(4) 5・2．1．ホスフアターゼ活性因子の単離. 23. 5・2・2・ホスフアターゼ活性因子の性状の解析. 25. a）分子サイズ. 25. b）組成分析. 26. 1）紫外部吸収スペクトル. 26. 2）アミノ酸分析. 27. 3）脂質の分析. 28. 4）糖質の分析. 28. C）活性に及ぼす効果. 28. 1）SDS処理. 28. 2）タンパク質ならびに核酸分解酵素処理. 29. 3）pHの効果. 30. 4）試剤処理の効果. 31. 5）酸化剤処理. 32. 6）有機溶媒処理. 32. 7）Triton X−114の効果. 33. 5・3・ホスフアターゼ活性因子の生理的機能の探索. 34. 5．3．1．カエル卵成熟過程における関与. 34. 5．3．2．器官／組織特異性. 34. 5・3・3・20Sおよび26Sプロテアソームのペプチダーゼ活性に及ぼす効果. 35. 6．考察. 37. 6．1．メガロホスフアターゼの単離 6・2・ホスフアターゼ活性因子タイプ1およびタイプ2の単離 6・3・ホスフアターゼ活性因子（タイプ1およびタイプ2）の性状 iii.

(5) 6・4・メガロホスフアターゼと活性因子（タイプ1およびタイプ2）の活性本体の比較. 43. 6．5．アルカリ性ホスフアターゼとの比較. 45. 6．6．生理的機能の探索. 46. 6．7．総括. 48. 7．参考文献. 50. 8．謝辞. 62. lV.

(6) 1．要旨リン酸化／脱リン酸の可逆的反応は細胞内の機能調節において根幹をなしている。なかでも、細胞周期包期からM期への移行過程に対応するカエル卵成熟過程においては、Cdc2／サイクリンB一複合体としての卵成熟促進因子（MPF）そのものがリン酸化／脱リン酸反応に依存して活性化されるとともに、高分子量多機能性プロテアーゼ複合体（プロテアソーム）の働きにより分解を受けることも知られている。しかし、キナーゼの働きによるリン酸化反応は解析が非常に進んでいるものの、ホスフアターゼの働きによる脱リン酸反応に関する生化学的な知見は必ずしも多くない。我々は、既にアフリカツメガエル卵巣卵サイトソルに極めて巨大な分子複合体であるホスフアターゼ（分子質量が少なくとも20・000kDaと概算され、巨大分子であることからメガロホスフアターゼと命名）を見出し、その性状の一部を明らかにしていた0本研究において、この知見を確証するとともに、メガロホスフアターゼの更なる生化学的性状についてホスフアターゼ活性を指標として解析した結果、多くの点で極めて異質なことが分かった0主な点は次の通りである。（1）タンパク質分解酵素を作用させても活性は消失しなかった0しかし、核酸分解酵素を作用させると活性の低下が見られた0（2）タンパク質の変性作用を持っている陰イオン性界面活性剤（SDS）を5％濃度で処理しても活性は消失しなかった。（3）活性の至適pHは中性で非リソソーム由来であり、いわゆるアルカリ性ホスフアターゼとは異なっていた。しかし、研究をさらに掘り下げるためには、メガロホスフアターゼ分子が巨大であることなど異質なだけに直接研究の対象とすることは解析上多くの困難を伴った。このことで、本研究の途次に、上記（1）に記したようにメガロホスフアターゼ活性はタンパク質分解酵素に耐性であることを見出していたので、卵巣そのものをタンパク質分解酵素のなかでも特異性の広いプロナーゼで処理し得られた消化物を対象と. 1.

(7) して解析した。その結果、プロナーゼ処理したもののホスフアターゼ活性は十分残存していることが確認できたので、生じた活性因子を単離レ性状の一部を明らかにした。プロナーゼ消化物からDEAE−セルロース、QAE−トヨ／トル、セフアロースCL− 6Bまたは−2Bと一連のカラムクロマトグラフィーおよびグリセロール密度勾配遠心分離法を組み合わせることによってホスフアターゼ活性因子として2つのタイプ（タイプ1とタイプ2）を単離した。各タイプの未変性条件下でのゲルカラムクロマトグラフィーでの挙動から、それぞれの分子質量を140kDaと20，000kDaと概算した。分子サイズから、タイプ1はプロナーゼ処理した結果を反映していると考えられたが、タイプ2はプロナーゼ処理したにもかかわらずメガロホスフアターゼ同様いまなお巨大であった。なお、タイプ2はタイプ1と違って脂質や糖質も含み著しく巨大分子となっておりミセル様構造を形成している可能性も示唆された。両タイプを解析して明らかにした主な性状は次の通りである。（1）活性染色法によるSDS−PAGEで求めた活性因子本体の分子サイズは、タイプ1 が140kDa、タイプ2が130kDaであった。なお、対応するバンドはタンパク質を染色する色素やタンパク質のほかに核酸をも染色する銀でも染色されなかった。しかし、いずれのタイプもアミノ酸分析をした結果、アミノ酸が検出されたことからタンパク質を含むことには違いない。なお、アミノ酸としてシステインが検出されていないが、あるとしてもSH基の修飾試薬NEMの処理で活性は阻害しなかったので、システイン残基は活性に関与していないことが示唆された。（2）いずれもタンパク質分解酵素で処理しても活性に影響を与えなかった。しかし、核酸分解酵素で処理すると活性は低下した。活性本体にタンパク質よりもポリヌクレオチド様因子の関与が示唆された。（3）タンパク質を変性させる各種の有機溶媒で処理してもいずれも活性は消失しなかったが、フェノール処理だけは活性が低下した。（4）二価陽イオンのキレート剤EDTAの処理で活性が阻害されたことから、活性に二価陽イオンの関与が示唆された。（5）活性の至適PHは中性で、既知のアルカリ性ホスフアターゼ. 2.

(8) とは異なっていた。（6）アフリカツメガエルの卵巣以外の器官／組織（心臓、精巣はか）にも広く検出されたので、類似したホスフアターゼは普遍的に存在することが分かった。（7）両タイプともプロテアソームのうち26S型のペプチダーゼ活性を著しく低下させた。以上、本研究を通して、アフリカツメガエル卵巣卵をプロナーゼ処理したことで単離したホスフアターゼ活性因子はSDSに耐性であるなど、生化学的に極めて異質な性状を多数持っていることが明らかになったが、未だ化学的実体を特定できていない。本ホスフアターゼ活性因子にポリヌクレオチドを含む可能性もあるなど酵素機能を持つ既知のRNA（リボザイム）に類似した酵素の発見に次ぐものともなり得るだけに、化学的実体の解明は急務な課題である。また、本研究で得られた知見は、研究の最終的な目標であるカエル卵成熟機構の解明に新しい道を開くものと期待される。引き続き、両タイプの実体そしてメガロホスフアターゼそのものの実体を明らかにするとともに、カエル卵成熟の制御機構との関わりでの生理的な機能の探索が重要な課題である。. 3.

(9) 2．略語 AMC‥7−amino4−methy．coumarine. ALP‥alkaJinephosphatase. AmS：ammOniumsuJfate ATP：adenosinetriphosphate bis：N・N■−methyJene−bis−aCry．amide. BSA：bovineserumalbumin CAMP：CyCJicAMP CBBG：CoomassiebrHiantblueG−250 CBBR‥CoomassiebriHjantblueR−250. DDW：distjHed anddeionizedwater DEAE‥diethyJaminoethyJ. EDTA‥ethyJenediamine−N，N，N・，N・−tetraaCeticacid. EtBr：ethidium bromide GV：germinaJvesicJe GVBD：germinaJvesiclebreakdown HEPES‥2−［4−（2−Hydroxyethy．）−1−PiperazynyJ］ethanesulfonicacid. ト1：inhibitoト1 J−2：inhjbitor−2. LLVY‥SuCCinyJ−L−Jeucy．−L−．euCyJ−L−Va．y．−L−tyrOSine−. 4−methyJcoumaryl−7−amide 2−ME‥2−merCaPtOethanoI. MES：2−mOrPhoJjnoethanesulfonicacid MJS‥maturationinducingsubstance. 4.

(10) MPF：M−Phase（maturation）promotingfactor 4−MU：4−methyJumbeHiferone 4−MUP‥4−methyIumbe．．ifery．phosphate. NEM‥N−ethyJmaIeimide. PAGE‥POJyacryJamidege，e．ectrophoresis. PIk：POJoJike kinase PP：PrOteinphosphatase PPl：tyPe−1proteinphosphatase PP2A：tyPe−2proteinphosphatasecJassA PP2B：tyPe−2proteinphosphatasecJassB PP2C‥tyPe−2proteinphosphataseclassC. PTP：PrOteintyrosjnephosphatase QAE：quaternaryaminoethyl rPm：reVOJutionsperminute SDS：SOdiumdodecy．suJfate Tricine：Tris（hydroxymethy．）methyIglycine Tris：Trjs（hydroxymethyl）aminomethane.

(11) 3．序 3・1・カエル卵成熟過程におけるリン酸化／脱リン酸反応可逆的リン酸化／脱リン酸反応は、生体内での種々の機能調節反応において極めて重要であることは疑いない【1・4−6・8・9，11・15−23・26−32，34，35，37−40，42，44，4 7・50・51・53・54・56・57・59−66】0ここで、リン酸化反応に関与する酵素群は、基質にリン酸基を付加するキナーゼ、およびリン酸化された基質からリン酸基を脱離するホスフアターゼの2つに大別される0生体内における基質としてはタンパク質、核酸、糖、脂質が知られている【5・11・17・40・53・63，65】。なかでもタンパク質を基質とするホスフアターゼ（プロテインホスフアターゼ）に着目すると、リン酸化セリンおよびスレオニンを標的とするセリン′スレオニンホスフアターゼ、リン酸化チロシンを標的とするチロシンホスフアターゼに分類される【4，63，65】（表1）。ここで、セリン／スレオニンホスフアターゼ（PP）はこの酵素に対する阻害物質の感受性およびイオンの要求性を基準にした場合、PPl、PP2A、PP2B、PP2Cおよびその他のホスフアターゼと5群に分類される0チロシンホスフアターゼ（PTP）は細胞内の局在性に従い細胞膜結合型と細胞質型の2つに分類される。なお、Cdc25などデュアルスペシフィックホスフアターゼはチロシンホスフアターゼの一種として分類されるが、セリン／スレオニンホスフアターゼ活性も併せて保有している。本研究の最終的な目標は「カエル卵成熟の制御機構の解明」にあるが、カエル卵成熟の過程は細胞周期上毎期からM期への移行過程に対応し（図1および2）、卵成熟誘起物質（MIS：maturationinducingsubstance）であるプロゲステロンが卵母細胞表面に存在するリセプターに結合することから始まる【24，35】（図1）。引き続き、細胞内CAMPレベルが低下したあと、一連の反応が進行しプロテインキナーゼ群（CAK、Weel、miklなど）の働きによってM期促進因子（MPF）の構成サブユニットであるプロテインキナーゼそのもののCdc2キナーゼの分子上14番目のチロシン残 6.

(12) 基、15と161番目のスレオニン残基がリン酸化されるが、14番目のチロシン残基および15番目のスレオニン残基がCdc25の働きで脱リン醸されることにより、プロテインキナーゼ活性を保有しているMPFが活性化される【24，31，35，651（図2）。ここで、Cdc25そのものがPIxlをはじめとするPO．0一一ike−kinase（Plk）群のセリン／スレオニンキナーゼによって促進的にリン酸化され、他方、セリン／スレオニンホスフアターゼの一種プロテインホスフアターゼ（PP2A）によって抑制的に脱リン酸される【30・31・6510このようにキナ一骨ホスフアターゼに注目しただけでも重要な反応が多数見られる。一方、アルカリ性ホスフアターゼ【15，19，21・27・29・34，42，47，54，62，64，661は至適PHをアルカリ性街域に持ち、生物学の研究にマーカー酵素として用いられてきた0例えば、アフリカツメガエルの充分に成長した卵母細胞の微絨毛における発現【341やマウス発生過程における発現様式の変化【54，621、始原生殖細胞における発現マーカー的役割【27，291や、抗体を標識する際に用いる免疫染色法など極めて多くの点で有用である0しかし、生理的な役割については不明である。現在、ホスフアターゼをカエル卵成熟制御機構の解析との関わりで考えたとき、プロテインホスフアターゼのはかにホスフアチジルイノシトールホスフアターゼ【53】などホスフアターゼの生化学的および生理学的な機能を解析することの重要性が著しく増大している0しかし、今日までホスフアターゼを対象とした生化学的な研究はキナーゼほど必ずしも解析が充分行われていない。. 3・2・高分子量多機能性プロテアーゼ複合体（プロテアソーム）のリン酸化カエル卵成熟過程において、MPF活性の低下が見られるが、このことはCdc2キナーゼとサイクリンBの複合体であるMPFのうちサイクリンBがユビキチン化され、それが高分子量多機能性プロテアーゼ複合体（プロテアソーム）によって分解される. 7.

(13) ことによっている。また、サイクリンBのユビキチン化される過程においてもサイクロソームのサブユニットがリン酸化された状態に依存している【12，25，44，46，55， 58，611。ニホンヒキガエルの系で、プロテアソーム自身は当初リン酸化されやすいが、卵成熟が進行するにともないリン酸化を受けにくくなる【391。このようにカエル卵成熟の制御機構を解明するためには、プロテアソームの活性変動も考慮に入れた研究の方向が必要である。本研究では、外山らとの共同研究において、プロテアソームのうち26S型を構成するサブユニットそのもの（分子質量125kDa）がリン酸化されるとともに26Sプロテアソームそのものの活性が変動することを明らかにしている。今回、プロテアーゼおよびSDSに耐性のホスフアターゼ活性因子そのものが、 26Sプロテアソーム活性を著しく阻害することを見出した。. 3．3．研究目的本研究の最終的な目的は、「カエル卵成熟の制御機構を解明すること」にある。この実験系は、細胞周期の制御機構を解明するうえでの細胞生物学的モデルであることにとどまらず、発生生物学的・分子生物学的・生化学的視点からも非常に重要な研究対象である。この目的のためには、生体機能調節において極めて重要な可逆的リン酸化反応、つまりリン酸化／脱リン酸に関わる酵素としてのキナーゼとホスフアターゼに注目して解析する必要がある。ホスフアターゼそのものは酵素である以上、タンパク質に一般的な性状として不安定で失活しやすい。このために、ホスフアターゼに限らず単離精製にあたっては、活性が低下ないしは失活しないように温度、PH、イオン強度などに注意を払った実験計画を立てて研究を進めた。アフリカツメガエル卵巣卵をそのまま超遠心分離して得た上清画分を酵素源とし、てゲル漉過で分離した。蛍光基質4−methylumbeHiferyJphosphate（4−MUP）の加水分解活性を指標にして測定したところ、素通り画分に極めて巨大な分子サイズのホスフアターゼ活性成分（メガロホスフアターゼ）が回収され、その性状の一部を 8.

(14) 明らかにした【561。見出したホスフアターゼは、極めて巨大な分子量を有する点で従来まで知られているホスフアターゼ【1，4−6，8，9，11，15−23，26−32，34，35，37− 40，42，44，47，50，51，53，54，56，57，59−66】とは次のような点で全く異なっていた。 1）高濃度のイオン性界面活性剤（SDS）で処理しても活性が低下しない。 2）タンパク質分解酵素に対しても活性は低下しない。など、従来の酵素と比べたとき生化学的に極めて特異な性状を持っていた。これらの知見を踏まえて、SDS存在下での特異的なホスフアターゼの触媒活性の測定法、卵巣そのもののタンパク質分解酵素処理を採用した単離法、SDS−PAGE後のゲル上に活性を持ったバンドの検出法を確立し、本酵素の活性因子の性状の一部を明らかにした。本論文では、アフリカツメガエル卵巣卵をそのまま超遠心分離して得た上浦画分を酵素源として単離した酵素（メガロホスフアターゼ）と卵巣をプロテアーゼで処理したあと単離したタイプ1とタイプ2に関する研究をそれぞれ分けてまとめた。. 9.

(15) 4．材料と方法 4．1．実験動物アフリカツメガエル（鵜〃叩〟5／ae再5）は、城北生物教材株式会社（静岡市）あるいはカトーSカガク株式会社（東京都）から随時購入した。ニホンヒキガエル（β〟わノa卯〃／C〟S）は大内一夫氏（埼玉県三郷市）より購入した。. 4．2．試薬類実験に用いた試薬はそれぞれカッコ日内の会社より購入し、断りのある場合以外は特級品を用いた。 2−プロパノール，アセトニトリル，オカダ酸，バナジン酸，硫酸アンモニウム，N− ethyJmaleimide（NEM）［和光純薬工業1，Tris（hydroxymethyl）aminomethane （Trjs），SDS，TritonX−100【ナカライテスク】，4−methylumbeHiferyl Phosphate（4−MUP），4−methylumbeHiferone（4−MU），aCryJamjde，bis， ZnSO4，CBBG，CBBR，ブリジー35，tryPSin，lysyrendopeptidase，thermoJysin， PrOteinaseK，DNaseI，RNaseAlSigma］，NucleasePl【ヤマサ1，. Chymotrypsinl長瀬産業】，MES，HEPES，Tricinel同仁化学研究所】，TritonX− 114lAldrich］，コラゲナーゼS−1【新田ゼラチン】，プロナーゼEl科研化学株式会社］，DEAE−セルロース（DE52），CM−セルロース（CM52），P−セルロース（Pll） lWhatmann］，QAE−トヨパール，TSK−ゲルフェニルー5PW【東ソー】，セフアロース CL−2BおよびCL−6B，フェニルセフアロースCL−6BlPharmaciaBjotech］，2D銀染色試薬Ⅱおよび脂質染色用ズダンプラック染色試薬「第一」【第一化学薬品】. 10.

(16) 4．3．培養液の組成用いた培養液の組成は次の通りである。培養液A：116・36mMNaCr／1・34mMKCr／6・78mMCa（NO3）2／1．66mMMgSO4／ 8・42mMTris−HCJ（PH7．4）培養液B‥85mMNaCl／1・5mMKCr／0・5mMCaCJ2／0．6mMMgCl2／ 5・OmMTris−HCJ（PH7．6）. 4．4．緩衝液の組成用いた緩衝液の組成は次の通りである。 MT緩衝液：10mM2−ME／50mMTris−HCl（PH7．6） MHT緩衝液：50mM MES／50mM HEPES／50mMTricine （各PHはNaOHを滴下して調整した）. 4・5・ホスフアターゼ活性の測定法ホスフアターゼ活性はFernleyとWaJkerの方法【15］の使用緩衝液（ammediol）およびpH（9・72）を以下のように改変して測定した。90〟lの基質溶液（11〝M4− MUP／5・6mM2−ME／56mMTris−HCJ，PH7．0）に10LLlの試料を加え37℃で反応させた01時間後、反応液中に100LLlの10％SDSと2mJの100mMTris−HCJ（PH 8・0）を加えて反応を停止させた。基質4−MUPが水解され生成した4−MUの蛍光強度を蛍光分光光度計（日立，F−3000）により励起波長365nm、蛍光波長454nmで測定しホスフアターゼ活性値とした。. 4．6．ペプチダーゼ活性の測定法 10LLJの試料に90LLlの基質溶液（11LLM LLVY，110mMTris−HCl，PH7．4）を. 11.

(17) 加え37℃で保温した010分後、100LL．の10％SDSと2mlの100mMTris−HCl （PH9・0）を加えて反応を停止させた0基質が水解され生成したAMCの蛍光強度を蛍光分光光度計により励起波長360nm、蛍光波長460nmで測定しペプチダーゼ活性値とした。. 4・7・卵母細胞の単離と血両roでの培養アフリカツメガエル雌成体を断頭し、充分に放血した後摘出した卵巣を培養液A で十分洗浄した0通常、卵巣（パック容積として25mりをリングピンセットで断片化したあと、蓋付きポリエチレン製スピッツ（50mト容量）内に移し培養液Aを加えて 50mlとした0そのあとコラゲナーゼS−125mgを加えて0・05％溶液とし、蓋をして室温で振塗した0約2時間後、遊離した相当数の卵母細胞を得た時点で、一定量の培養液Aで数回洗ってコラゲナーゼとともに卵径の小さい卵母細胞群を除去した。. 4・8・卵母細胞からの可溶性画分（サイトソル）の調製単離した卵母細胞20両（パック容積）をローター50・3丁場遠沈管（5m惰量）内に集めて、4℃下、5，000rpmで10分間遠心分離（Beckman，L8−70Mもしくは Optima−L）し余分な外液を除去したo引き続き、4℃下で、105，000xgで60分間超遠心分離（ローター50・3Ti）を行って、最上層に浮遊している脂質層と、沈法との間にある黄色気味の透明な液層を分取した0液層をパスツールピペットでエッペンドルフチューブ（1・5m惰量）内に移したあと、4℃下、10，000rpmで10分間の遠心分離（TOⅥYMに−150）を再度行い、脂質層と沈漆との間の可溶性画分を回収した。可溶性画分（サイトソル）は、そのまま実験に用いるか、分注したあと−85℃で凍結保存し用時解凍して用いた。. 12.

(18) 4・9・卵巣からのプロナーゼ処理消化物の調製アフリカツメガエル雌成体から摘出した卵巣を、培養液Aで十分洗浄したあとリングピンセットで断片化し、MT緩衝液に置き換えて繰り返し洗浄した。その後、卵巣断片（パック容積）あたり3倍容のMT緩衝液を加えテフロンペッスル付きPotter− EJvehjem型ホモジナイザー（井内盛栄堂，50ml容量）を用いて4℃下でホモジナイズした。ホモジネートにプロナーゼE（最終濃度5mg／mJ）を直接加え、室温で振塗し処理した。16時間後、4℃下、105，000xgで60分間超遠心分離（Beckman，L8− 70MもしくはOptima−L；ローター70Ti）し、上清画分を回収しプロナーゼ処理消化物とした。. 4・10・DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィープロナーゼ処理消化物をMT緩衝液に対し充分に透析したあと、DEAE−セルロースカラム（2cm2X5cm＝10mf）に加え、同じ緩衝液100mlで非吸着画分を除いた。吸着画分は、順次0・07M，0・20M，そして0・50MのNaClを含むそれぞれ50mlのMT緩衝液で溶出した。全ての操作は4℃下で行い、流速は40mI／cm2・hrで1管当たり 5mlで分画した。. 4・11・QAE−トヨパールカラムクロマトグラフィー DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーによって回収した酵素活性画分は、 MT緩衝液に対し充分に透析した後、QAE−トヨパールカラム（2cm2X5cm＝10mJ）に加え100両の同じ緩衝液で非吸着画分を除いた。吸着画分は、順次0．10M，0．30M，そして0・50MのNaC憧含むそれぞれ50mJのMT緩衝液で溶出した。全ての操作は 4℃下で行い、流速は40mJ／cm2・hrで1管当たり5mlで分画した。. 13.

(19) 4・12・ゲルカラムクロマトグラフィー QAE−トヨパールカラムクロマトグラフィーによって回収した酵素活性画分は、そのまま凍結乾燥（装置：Taitec・VD−80型）LDDWで溶解して2m．とした。試料は、 0・3MNaCIを含むMT緩衝液で平衡化したセフアロースCL−2B（0．78cm2X64 cm＝50mJ）もしくはセフアロースCL−6B（1・0cm2X50cm＝50m．）カラムに加え、. 同じ緩衝液で溶離した0全ての操作は4℃下で行い、流速10m．／cm2・hrで1管当たり1mlで分画した。. 4・13・グリセロール密度勾配超遠心分離ゲルカラムクロマトグラフィーによって回収した酵素活性画分3m−を、予めグラジエントマスター（東和科学社・106−200B型）を用いてニトロセルロース製遠沈管（12mト容量）内に作製したグー」セロール密度勾配層（5−35％）の最上部に積層し、4 ℃下、27・000rpmで18時間超遠心分離（Beckman，Optima−L；ローター SW41Ti）した0遠心分離後はautomatic．iquidchargerA．C−2L（東陽科学社）を用いて上部から500〟ずつ分画・分取した。. 4・14・高速液体クロマトグラフィー部分精製した酵素試料は等量の2M硫酸アンモニウムと混合したあと、シリンジフィルター（Advantec，直径0・35〟m）で濾過し、1M硫酸アンモニウム／50mM HEPES−NaOH（PH7・6）で平衡化したTSKゲルフェニルー5PWRPカラム（0．14 cm2X7cm＝1mJ）に加えた0同じ緩衝液から硫酸アンモニウムのない50mM HEPES−NaOH（PH7・6）まで計5m．での硫酸アンモニウム濃度を直線的に低下させる勾配法で展開した0次に50mMHEPES−NaOH（PH7・6）から50％2−プロパノールを含む50mMHEPES−NaOH（PH7・6）まで計12・5m腔の直線的濃度勾配法で溶出した0全ての操作は室温下で行い、流速は0・5m仙nで1管当たり0・5m■で分画した。 14.

(20) 4・15・SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）精製試料の純度は、試料に2−MEとSDSをそれぞれ1％になるように加えて5分間煮沸・溶解し、SDS存在下のゲル電気泳動をLaemm．iの方法【33］に従い、2連式ミニスラブゲル（9cmx9cm）電気泳動装置（アト，AE−6450）を用いて検定した。アクリルアミド溶液（30％アクリルアミド・0・8％bis）から、濃縮ゲルはアクリルアミド濃度3・9％、分離ゲルはアクリルアミド濃度6％を作製した0泳動は定電流（ゲル1枚当たり濃縮ゲル内は12mA・分離ゲル内は18mA）下で行った。泳動後のゲルは0・1％Coomassiebr日日antb．ueR−250（CBBR）−40％メタノールー10％酢酸溶液で染色、20％メタノールー10％酢酸溶液で脱染色（色素染色法）か、2D銀染色試薬 Ⅱ「第一」による銀染色（銀染色法）した。他方、試料をSDS−PAGEした後のゲル上にホスフアターゼ活性をもったバンドを検出する場合（活性染色法）は、試料を上記のように加熱溶解せずにそのまま泳動した0泳動後のゲルはDDWで一度すすいだあと、ポリエチレン製ラップ上に移してゲル1枚当たり2mJの基質溶液（1mM4−MUP・5・6mM2−ME，56mMTris−HCJ，PH 7・0）を積層し、37℃で静置した01時間後、暗所下トランスイルミネ一夕ー（フナコシ・TM−20）で蛍光の有無を検出し、ポラロイドカメラ（ポラロイド社）で撮影保存し. 活性染色法を行ったあとのゲルから酵素活性因子の回収にあたって、該当するバンドを片刃カミソリ（洗浄済み）で切り出し細片化後、蓋付きガラス製三角フラスコ（50mト容量）内に移した0ここに10倍容のアセトニトリルを加え室温で振塗した。 16時間後抽出液を分取しアセトニトリルを減圧下に留去し、残留溶液をアミノ酸分析用の試料等に供した。. 15.

(21) 4・16・活性因子のホスフアターゼ活性に及ぼす各種試剤等の効果 a）タンパク質ならびに核酸分解酵素による処理 30〟lの試料に10〟Jの100mMTris−HC．（PH8・0）と10〟一のタンパク質ないし. は核酸分解酵素溶液（100mMTris−HC．・PH8・0，に溶解）を加え、室温で処理した。 16時間後必要な分析に供した。 b）各種化学試剤による処理 25〟lの試料に25〟困ヒ学試剤を加え、室温で処理した01時間後、必要な分析に供した。. （i）水溶性の有機溶媒による処理‥25〟■の試料に有機溶媒を等量加え、室温で処理した01時間後、必要な分析に供した。（ii）2相性の有機溶媒による処理‥25〟−の試料に水と混和しない有機溶媒を等量加え、室温で処理した01時間後、5・000rpmで5分間遠心分離rOMY，MC−150）した後、水屑および有機層の二層を分画しそれぞれを回収して必要な分析に供した。. 4・17・アミノ酸分析試料を4℃下DDWに対し充分透析を行った後、硬質ガラス製試験管（18mmx180 mm）内に移し、最終濃度6Nになるように濃HC．（＄U光純薬工業・アミノ酸分析用）を一定量加えた0次に減圧下に封管し、110℃で加水分解を行った048時間後開封した試料は凍結乾燥し、100〟■の0・02NHC■を加えて、シリンジフィルター（Advantec・直径0・35州こ通したあとのろ液の一部を、自動アミノ酸分析装置（日立、L8500A）でアミノ酸を分析した0なお、標準アミノ酸として生体試料用アミノ酸（和光純薬工業）を用いた。. 16.

(22) 4・18・タンパク質の定量タンパク質量はCoomassiebrjHiantbJueG−250を用いて、595nmでの吸光度を測定するBradfordの方法（CBB法）【31で測定するほかに280nmでの吸光度から換算した0いずれもウシ血清アルブミン（Elmg仙＝0・66）を標準タンパク質とし、分光光度計（日立・∪−3210）を用いて測定した。. 17.

(23) 5．結果 5・1■アフリカツメガエル卵巣卵からのメガロホスフアターゼの単離と性状の解析. 5・1・1・メガロホスフアターゼの単離アフリカツメガエル卵巣卵サイトソルを酵素源としてセフアロースCL2Bゲルカラムクロマトグラフィーでの素通り画分に回収したホスフアターゼ（メガロホスフアターゼと命名した）の単離法は、既報の方法に従った【5610本研究において単離法を再検討した結果、当初溶離液にメガロホスフアターゼの安定化剤としてトレハロース【43】を添加していたが、代わりに巨大分子複合体であることから活性が消失することなく狭雑成分を解離・除去する目的で0・3MVaC権力ロえる方法を採用した。卵巣卵サイトソルを同じゲルカラムクロマトグラフィーで分画した結果、顕著なホスフアターゼ活性はやはり素通り画分（Vo）に回収した（図3）。このことから、メガロホスフアターゼはイオン強度を上げた条件であっても巨大分子として挙動すること. ゲルカラムクロマトグラフィーで回収したメガロホスフアターゼ活性画分は白濁を呈していたが、同じクロマトグラフィーを繰り返しても白濁は除去できなかった【5610白濁はベジクル様−ミセル様構造に由来している可能性が示唆された。メガロホスフアターゼの化学的実体を明らかにするうえで清澄化する条件を見出すために、メガロホスフアターゼ源に非イオン性界面活性剤であるブリジー35および TritonX−100、陰イオン性界面活性剤としてSDSを加えて4−MUP水解活性に及ぼす効果を調べた（表2）。活性は対照と比べるとブリジー35は16％ほど低下したものの、TritonX−100は 18.

(24) むしろ26％上昇した0意外だったことに、タンパク質の変性効果が非常に高いSDS を高濃度（1％）作用させても活性は消失することなく、むしろ24％ほど上昇した。以上、メガロホスフアターゼをTritonX−100やSDSで処理しても活性は消失することなく、白濁した溶液が清澄溶液として回収されることが分かった。検討した界面活性剤のうちSDSを取り上げて、4−MUP水解活性に及ぼす効果を調べた0卵巣卵サイトソルのゲルカラムクロマトグラフィーで後半の画分に回収したホスフアターゼ（低分子型ホスフアターゼと命名）（図3A−No・40以降）とメガロホスフアターゼを対象とし比較した（図4）0低分子型ホスフアターゼの活性はSDS濃度 0・1％で全く消失したが、メガロホスフアターゼの活性はSDS濃度0．1％で消失しなかったのみならず、1％に上げても80％残存し、20％ほど低下したに過ぎなかった。このことから、低分子型ホスフアターゼの失活は、いわゆる通常の酵素タンパク質に普遍的に見られる性状であるが、メガロホスフアターゼに関してはSDSに対する異常なまでの安定性は通常の酵素とは非常に異なっていた。このことを確証するために新たに調製したサイトソルを粗酵素源としてセフアロースCL−2Bカラムで分画し、各画分の4−MUP水解活性をそのまま測定したほかに、0・5％SDSを添加して測定し比較した（図5）o SDSなしの活性は、いわゆるメガロホスフアターゼと低分子型ホスフアターゼとに見られ、図3での結果と類似していた。しかしSDSを添加すると、低分子型ホスフアターゼに由来する活性は全く消失したのに対し、メガロホスフアターゼに由来する活性は消失せずに残存していた0つまり、低分子型ホスフアターゼの活性は0・5％SDSで容易に失活するのに対し、メガロホスフアターゼの活性は 0・5％SDSに対して消失することなく回収した0以上、0・5％SDS存在下で4−MUP水解活性を測定することにより、メガロホスフアターゼを特異的に検出することが可能となった。メガロホスフアターゼがSDSに対し極めて安定であることが確認できたので、図5 で分画した各画分を加熱処理しないでSDS−PAGE後活性染色法を行った（図6）。メガロホスフアターゼおよび低分子型ホスフアターゼを含むいずれの画分にも色素で 19.

(25) 染色されたバンドが多数検出され、タンパク質成分が混在していた。他方、活性染色法での結果から、メガロホスフアターゼの回収された嶺域のみに蛍光活性が検出され、図5でSDS存在下に求めたホスフアターゼ活性を含む画分に対応していた。加熱処理した標準タンパク質を同時に泳動したときの移動度から換算して求めた概算分子質量は約130kDaであった（図6B）0なお、低分子型ホスフアターゼが溶出された画分には蛍光活性は全く検出されなかった0以上、ゲル上での活性染色像は溶液で蛍光活性を測定した結果を反映していたので、活性染色法はメガロホスフアターゼを検出するうえで有用な分析法の1つとして確立した。. 5・1・2・メガロホスフアターゼの性状の解析 1）タンパク質ならびに核酸分解酵素処理の効果メガロホスフアターゼの化学的実体を明らかにする手がかりを得るために、各種タンパク質および核酸分解酵素で処理したメガロホスフアターゼの4−MUP水解活性に及ぼす効果について検討した（表3）。メガロホスフアターゼ活性は、塩基性アミノ酸のカルポキシル基側を特異的に切断するトリプシン【7】処理では92％、グルタミン酸残基のカルポキシル基側を切断するV8プロテアーゼ【141処理では72％、タンパク質分解酵素のなかでも基質特異性の広いプロナーゼ（プロナーゼE）【71処理では81％と、いずれも8−28％ほど活性は低下したものの著しく消失しなかった0他方、核酸分解酵素としてDNAを非特異的に切断するDNaseJl7］を作用させた場合の活性は22％、RNAのピリミジン残基の隣接を切断するRNaseAl7］を作用させた場合には43％に低下した。以上、メガロホスフアターゼをタンパク質分解酵素で処理しても活性にはほとんど影響を与えなかった0しかし、核酸分解酵素で処理した場合には、活性が低下したので、活性に核酸の関与が示唆され非常に興味を与えた。. 20.

(26) 2）変性剤（エタノールおよび尿素）の効果メガロホスフアターゼはSDSに耐性なうえタンパク質分解酵素に対しても抵抗性を持つことが分かったが、別の変性剤として有機溶媒であるエタノールや尿素のメガロホスフアターゼ由来の4−MUP水解活性に及ぼす効果について検討した（図7）。エタノールに関しては、濃度を10％まで上げても活性は全く変化しなかった。さらに上げて50％にしても活性が20％はど低下したもののエタノールに対して著しく安定なことが分かった。他方、尿素を作用させたときには、1M濃度で活性が85％にまで低下した。濃度をさらに4Mまで上げると、活性が全く消失することが分かった。以上の結果より、メガロホスフアターゼは新たにエタノールを作用させても変性されにくく安定な構造を保持しているとはいえ、尿素に対して不安定で失活することが分かった。. 3）各種試剤の効果メガロホスフアターゼ活性に及ぼす効果をさらに亜鉛イオン、2価陽イオンのキレート剤であるEDTAl41】、タンパク質中のチオール基の修飾剤であるN−エチルマレイミド（NEM）【41】、ならびにホスフアターゼの一般的阻害剤としてバナジン酸【231を用いて調べた（表4）。ここではこれら試剤の効果を、プロナーゼで処理したメガロホスフアターゼの活性も指標として調べ対比した。メガロホスフアターゼの活性はそれぞれ亜鉛イオンで13％、EDTA処理により56％、NEMでは73％、バナジン酸では96％阻害した。ここで、メガロホスフアターゼをプロナーゼで処理しても活性は消失しないが、亜鉛イオンを加えても9％とほとんど影響ないが、EDTA処理では31％、バナジン酸では73％と阻害が見られた。また、NEMで処理しても活性の著しい低下は見られなかった（表4）。以上、いずれを酵素源にしても活性がバナジン酸によって阻害したのでホスフアターゼ様活性を有していることには違いなかった。NEM処理での結果から、メガロ. 21.

(27) ホスフアターゼの活性中心にSH基（システイン残基）の関与が示唆されたものの、プロナーゼ処理して得た因子内にはSH基は活性に関与していないことが分かった。 EDTAに対する反応性は多少違いが見られた。メガロホスフアターゼそのものが保有している活性は、プロナーゼ処理したあとに残存しているホスフアターゼ活性を示す分子形状や、構成成分の違いを反映した結果によっていることが示唆された。. 4）温度の効果メガロホスフアターゼの活性を指標にして安定性を温度との関係で調べた。20℃ を基準にしたとき50℃まで徐々に上昇して2倍になった。しかし、55℃に上げるとむしろ20℃での値よりも低下し、60℃では活性が完全に消失した（図8）。このようにメガロホスフアターゼの温度による活性化は通常の酵素より緩やかであったが、このことは内在性の阻害因子が温度依存的に遊離して、活性を阻害した結果であるとも考えられる。ここで、60℃での処理により低下した活性が温度を元に戻したとき回復するか否かについて検討した（表5）。静置した30分後には13％しか回復しなかったが、24時間後には89％とほぼ完全に回復した。この結果から、消失した活性は温度を上げても不可逆的に変性したのでなく可逆的に構造が回復することが示唆された。. 22.

(28) 5・2・アフリカツメガエル卵巣卵プロテアーゼ消化物からのホスフアターゼ活性因子の単離と性状の解析我々が、アフリカツメガエル卵巣卵サイトソルに見出したメガロホスフアターゼの生化学的に特異な性状を明らかにすることが本研究の目的である。しかし、述べてきたように本酵素が巨大分子複合体でミセル様構造を保持している可能性などのために精製純度を特定するなど適切な単離法等が兄い出せなかった。加えて、単離・回収できる量がわずかであることも、研究を進めていくうえで支障をきたすと考えた。前項に記したように、本研究でメガロホスフアターゼがSDSのみならずタンパク質分解酵素に対して抵抗性があるということが明らかになったので、この知見に依拠してホスフアターゼ活性を持った因子を探索する方向から研究を進めた。具体的には、アフリカツメガエル卵巣そのものの均質液に、タンパク質分解酵素のうち幅広い基質特異性を持っているプロナーゼEを直接加えて処理した後に生じたホスフアターゼ活性因子を単離し、性状を明らかにした。. 5・2■1・ホスフアターゼ活性因子の単離アフリカツメガエル卵巣の均質液をプロナーゼEで処理し透析後に回収した画分を粗ホスフアターゼ活性因子として、4−MUP水解活性に及ぼすSDS濃度の効果を検討した（図9）。対照の試料として、プロナーゼ未処理の卵巣均質液を超遠心分離して得た上清を酵素源としたとき、はじめの活性を100％とLSDSを添加していくと、活性はSDS濃度0・125％で60％、0．25％で50％、0．5％で45％ほどまでに低下した。しかし、濃度をそれ以上5％まで上げていっても活性は低下せず一定であった。それに対し、プロナーゼ消化物を酵素源とした場合、SDSがなくても活性が見られた。いま、SDSを加えたとき、0・25％でほぼ100％、0．5％でほぼ85％、あと5％まで上げても変化することはなかった。これらのことから、卵巣の均質液を直接プロナーゼ処 23.

(29) 理してもSDSに耐性な活性は予期していたように残存することが確認できた。なお、プロナーゼで処理したことによりはじめ混在していた、SDSで変性を受けやすい低分子型ホスフアターゼは分解されたことが活性のプロフィルから明らかである。以上の結果、卵巣均質液をプロナーゼで処理しても残存しているホスフアターゼ活性は、メガロホスフアターゼそのものがタンパク質分解酵素に対して安定であることに対応していた。これら基礎的な知見が得られたので、卵巣卵プロナーゼ消化物を粗画分としてホスフアターゼ活性因子を単離、その性状を解析した（図10および11）。粗画分をプロナーゼで消化した成分等をイオン強度の低いMT緩衝液に対して透析して除いたあとの画分を、DEAE−セルロースカラムに加えると活性因子が吸着された0吸着画分は、0・07Mおよび0・20MNaC憧含む緩衝液を加えて回収した。各画分を別々にプールしてタイプ1とタイプ2の単離を進めた。つまり、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーで0・07MNaClを含む緩衝液で溶出した活性画分をピーク1としてプールし、QAE−トヨ／トルおよびセフアロースCL−6Bのカラムクロマトグラフィーを行って単離し「タイプ1」標品とした。なお、純度が不十分な場合にはグリセロール密度勾配超遠心分離法を組み合わせた。他方、DEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーで0．20MNaCIを含む緩衝液で溶出した活性画分をピーク2としてプールして、QAE−トヨ／トルおよびセフアロースCL2Bのカラムクロマトグラフィーを行って単離し、「タイプ2」標品とした。一連のカラムクロマトグラフィーによる各段階におけるタイプ1およびタイプ2 に相応するホスフアターゼ活性画分の単離した結果についてまとめた（表6）。ここでは、各試料を波長280nmでの吸光度を求めてタンパク質量を定量し試みに換算した0タイプ1は723倍に精製され回収率は36％であったのに対し、タイプ2の精製度は39倍と低かったが、回収率は47％であった。なお、単離各段階における試料を活性染色法のためのSDS−PAGEを行った際に、銀染色法で純度を検定した（図12）。以上の結果、最終的にタイプ1そしてタイプ2いずれも活性染色法によって特定の 24.

(30) 位置にのみ活性が検出されたことからそれぞれを確認できた。ここで、非常に不思議なことに活性染色を行ったゲルを銀染色した場合に活性の検出されたバンドそのものが銀で染色されないことが分かった。なお、活性のバンド以外にも銀で染色されたバンドは見られなかった0ここで得られた知見も、ホスフアターゼ活性因子の更なる異質的な性状を反映していることが分かった。なお、タイプ1とタイプ2それぞれを単離するにあたって、タイプ2の単離は比較的容易であるが、タイプ1の単離については更なる検討を必要とした。具体的には、フェニルー5PWカラムに供するHPLC法の導入を検討した（図13）。つまり、タイプ1は展開液として後で留去が可能と言うこともあって、2−プロ／リールを採用し濃度として20−30％の領域に活性が回収された0この画分の純度をSDS−PAGEで検定した結果（データ未掲載）、精製の進んだことが確認でき大変有用な方法として確立したが、今回はタイプ1の単離にあたっては採用しなかった。他方、タイプ1およびタイプ2の分析においてSDS−PAGEによる活性染色法の有用性については既に述べたが、ここでは純度の高い精製晶を分析用として回収する目的のために本法の有用性を検討した0具体的には、泳動後のゲルから活性因子に相当するバンドを効率的に回収することを検討した（表7）。活性画分を活性染色法による条件でSDS−PAGEを行った後、ゲル上に活性を確認したバンドに対応するゲルを切り出し100％アセトニトリルを加えて抽出液を回収した。検討した結果、タイプ1およびタイプ2についてそれぞれ活性は84％および97％といった高収率でゲルから回収された0本法は極めて高い純度の試料を必要とする際には有用な方法である。. 5・2・2・ホスフアターゼ活性因子の性状の解析 a）分子サイズ 25.

(31) タイプ1とタイプ2のゲルカラムクロマトグラフィーを未変性条件下で実施した場合、それぞれの挙動から（図10Cおよび11C）判定して分子質量はそれぞれ140kDa と20・000kDaと概算した。ここで、生じたタイプ1は分子サイズから判断してプロナーゼの消化を受けた結果であると考えられるが、タイプ2はプロナーゼで処理したにもかかわらずいまなお、巨大分子のサイズであった。なお、タイプ1およびタイプ2、それぞれの活性染色法（図12）によって求めた分子質量は、SDSで加熱処理した各標準タンパク質の移動度を基準にして換算した場合、タイプ1が140kDa、タイプ2が130kDaと概算した0いずれもSDSを加え温和な条件でのSDS−PAGEの結果は、活性因子の活性本体に対応するものと示唆された。以上の結果、タイプ1そのものが140kDaの活性本体でかつ単量体であると仮定した場合、タイプ2は類似した130kDaの活性本体に多数の因子が会合し巨大分子複合体としてミセル様構造体が存在しプロナーゼの処理に抵抗性を示したということが示唆された0ここでタイプ2の性状は、メガロホスフアターゼのゲルカラムクロマトグラフィー上での挙動および活性染色法により求めた活性本体の分子質量を比べたとき、両者は類似していることが示唆された（図10C，11Cおよび12）。なお、タイプ1およびタイプ2、それぞれをグリセロール密度勾配遠心分離をした結果、いずれも比較的低密度の領域（沈降係数として7Sあたり）に回収されたことから活性本体として挙動した結果であることが分かった（図10Dおよび11D）。以上、タイプ2の分子サイズに関する性状については、条件に非常に左右されることが分かった。. b）組成分析 1）紫外部吸収スペクトルタイプ1およびタイプ2のそれぞれの紫外部吸収を測定した（データ未掲載）。各タイプいずれもタンパク質中芳香族アミノ酸が含まれる場合に特徴的な280nmにお. 26.

(32) ける吸収極大【411および、核酸塩基に由来する260nmにおける吸収極大【411が見られなかった0なお、紫外部領域より220nmまで測定可能な波長までの吸収スペクトルは、吸光度が徐々に増大した。. 2）アミノ酸分析タイプ1およびタイプ2それぞれのSDS−PAGE後の活性染色法を行ったあと、通常タンパク質の染色・検出法である色素法（CBBR）および、タンパク質に加えて核酸のよりよい感度の染色・検出法である銀染色法によっても活性の見られたバンドは染色されなかった（図12）0このことは用いた試料濃度の検出感度にもよるとはいえ、タンパク質を含んでいるとは考えにくい結果であったので、このことの解決のために一つにはアミノ酸分析を行った（表8）0タイプ1およびタイプ2を塩酸で加水分解した結果、次に記すように間違いなくアミノ酸が相当量検出された。タイプ1の組成はハイドロキシリシン31％とグリシン23％と2種類のアミノ酸で 50％を越え、3番目のアラニンを加えると70％近くになった。はかにアスパラギン酸／アスパラギン9％、スレオニン6％、残りはロイシン、リシン、ヒスチジン、イソロイシン、アルギニンの順で検出された。他方、タイプ2の組成は、ハイドロキシリシン65％、グリシン12％で両者だけで72％となった。3番目のアスパラギン酸／アスパラギンとアラニンはほぼ同じだが、残りはリシン、ロイシン、スレオニン、イソロイシンの順であった。いずれも上記以外のアミノ酸は用いた条件下では検出されなかった。タイプ1およびタイプ2のアミノ酸組成を比べたとき、非常に類似していることが分かった0なかでも興味深いこととして、いずれのタイプにもハイドロキシリシン量は極めて顕著であった。また、システイン、チロシン、フェニルアラニンといったアミノ酸は検出されなかった。以上、タイプ1およびタイプ2いずれもタンパク質様成分が含まれていることが明らかになったが、特異な配列を持ったタンパク質であることが示唆された0なお、ハイドロキシリシンと同定したのは、生体試 27.

(33) 料用の標準アミノ酸の溶出位置から算定したものなので、ハイドロキシリシンであると最終的に同定するには更なる解析が必要である。. 3）脂質の分析タイプ1およびタイプ2に脂質成分が含まれているか否かをゲル電気泳動法で調べた（図14）0試料をリボプロテイン分離用ゲル電気泳動に供した後、脂質用染色色素であるズダンプラック【36】で染色した。その結果、ゲル上タイプ1はいずれもバンドが染色されなかった〇一万、タイプ2に関してはゲル上ほとんど泳動されない位置のバンドに染色された0このことからタイプ2は一定量の脂質成分を含んでいることが分かった。. 4）糖質の分析タイプ1およびタイプ2に糖質成分が含まれているか否かを簡便な方法で調べた。検出法として広く知られているフェノール硫酸漑13】を採用した（データ未掲載）が、タイプ1は反応が陰性であったのに対し、巨大分子のタイプ2は茶褐色に呈色した。この結果、巨大分子のタイプ2に糖質が含まれていることは明らかでタイプ1とは違っていた。以上の結果から、タイプ1には、糖質および脂質とも含まれている可能性が低いのに対し、プロナーゼで処理してもなお巨大分子複合体であるタイプ2には糖質および脂質成分が含まれ、両者に違いのあることが分かった。. C）活性に及ぼす効果 1）SDS処理単離されたタイプ1およびタイプ2の4−MUP水解活性に及ぼすSDSの効果につい. 28.

(34) て各種濃度下で検討した（図15）。タイプ1にSDS濃度を0．5％まで加えていったとき活性が80％に低下したが、1％に上げると活性は90％まで回復し、最大5％に上げたときにはもとの値にまで戻った。他方、タイプ2の活性はSDS濃度を0．125および 0．25％に上げると115％に上がったが、0．5％SDS濃度にすると最初の値である 100％になり、5％SDSまで上げてもその活性値は変動しなかった。両タイプの活性に及ぼすSDSのプロフィルに多少の違いは見られたもののいずれのタイプもメガロホスフアターゼの場合同様（図4参照）SDSに安定であることが確認できた。. 2）タンパク質ならびに核酸分解酵素処理タイプ1およびタイプ2それぞれを各種タンパク質および核酸分解酵素で処理したあと、0．5％SDS存在下に4−MUP水解活性を測定した（表9）。別途、同一の試料の結果を検定するために活性染色法を行った（図16）。タンパク質分解酵素として、メガロホスフアターゼを処理する際に用いた（表3）プロナーゼEおよびトリプシンのほかに、芳香族アミノ酸残基のカルポキシル基側を切断するキモトリプシン【7】、疎水性アミノ酸残基のアミノ基側を切断するサーモライシン【71、リシン残基のカルポキシル基側を極めて特異的に切断するリシルエンドペプチダーゼ【71、SDSのような変性剤存在下でも活性の残存しているプロティナーゼK【7】を用いた。タイプ1はトリプシンには極めて安定であったはか、プロナーゼ巨、リシルエンドペプチダーゼ、キモトリプシンおよびサーモライシンに対しても10％ほど活性が低下するのみであった。しかし、プロティナーゼKの処理では16％ほど低下した。タイプ2の場合、プロナーゼ巨では10％の低下、トリプシンおよびプロティナーゼKでは、活性が低下よりもむしろ増大する傾向が見られた。なお、キモトリプシンによる処理で活性が 26％はど低下した。メガロホスフアターゼの場合同様、タイプ1およびタイプ2、いずれもタンパク質分解酵素による処理によって活性は顕著に低下しなかったが、このことは活性染色法によって確認した。他方、メガロホスフアターゼの際にも用いた核酸分解酵素としてDNasel、RNaseAのほかに、今回新たに核酸を非特異的 29.

(35) に切断するヌクレアーゼPlの効果を加えて検討した。タイプ1の活性は、ヌクレアーゼPlでは44％、DNaselでは52％ほど低下したが、 RNas虫で処理すると79％はど著しく低下した。これら活性が低下していることは、活性染色法により染色されるバンドの強度が低下していることから確証された（図 16）。タイプ2の活性は、これら各種分解酵素で同様に処理したが、タイプ1の場合同様活性が低下した。このことは活性染色法によっても確証した（データ未掲載）。以上の結果から、タイプ1およびタイプ2いずれもホスフアターゼ活性を維持するには核酸成分（RNAおよび／ないしはDNA）が主として関与していることは明らかであった。このことは先に記したメガロホスフアターゼの場合に得られた性状に類似し、極めて興味深い知見であった。. 3）pHの効果タイプ1およびタイプ2のホスフアターゼ活性に及ぼすPHの効果を調べた（図17）。タイプ1の活性は、PH5．0−5．5まで全く見られないが、PH6．0−6．5から8．0まで徐々に増大した。しかし、PH8・5を越えると徐々に低下し、PH9．5ではPH6．0−6．5での値とほぼ同じであった。他方、タイプ2の活性は、PH5．0−6．0までほとんど見られないが、PH6・5からPH8・0まで徐々に増大した。PH8．5では多少下がり気味で、PH9．5 ではPH7・0の値とほぼ同じであった。以上、いずれのタイプも活性を示す至適PHは 8・0で中性付近であった。なお、この値はメガロホスフアターゼ活性の至適PHとほぼ同じであった【56】。一方、アルカリ性ホスフアターゼは小腸上皮などに主に発現していて、活性の至適pHは9．5−10．5とアルカリ性領域にあり、界面活性剤やタンパク質分解酵素に対しても比較的安定である【15，19，21，27，29，34，42，47，54，62，64，66】。本研究で単離したタイプ1およびタイプ2、それに加えてメガロホスフアターゼの至適PHをアルカリ性ホスフアターゼのものと比べたとき、非常に異なっているので別の酵素であることが分かった。. 30.

(36) 4）試剤処理の効果タイプ1およびタイプ2の4−MUP水解活性に及ぼすキレート剤である EDTAl65］、タンパク質中のチオール基の修飾剤であるN−エチルマレイミド（NEM）【631、ならびにホスフアターゼの阻害剤として広く知られているバナジン酸【63】に加えて、プロテインホスフアターゼ（PPl／PP2A）の特異的阻害剤としてのオカダ酸【231の効果を検討した（表10）。 1および10mM濃度のEDTAで処理するとタイプ1とタイプ2いずれも活性は低下したが、その程度はタイプ1の方が顕著であった。いずれにしろ両タイプとも活性発現に2価陽イオンの関与していることが示唆された。また、NEMで処理した場合、タイプ1は10mM濃度に上げても活性が低下せず、タイプ2も1mM濃度ではあるがタイプ1と同様、活性の低下が見られなかった。これらのことからタンパク質様の SH基が活性に関与していないことが示唆された。このことでは、いずれのタイプもアミノ酸分析の結果、システイン残基が検出されなかったことと対応していた。また、通常のセリン／スレオニンホスフアターゼ（PP）を阻害する濃度のオカダ酸で処理した場合、タイプ2の活性は21％ほど低下したに過ぎなかった。なお、バナジン酸を加えた場合、濃度に依存して活性が著しく低下したので、ホスフアターゼ様活性を保有していることが分かった。アルカリ性ホスフアターゼの阻害剤として知られているフェニルアラニン、チロシンおよびレバミゾール【19，42】がタイプ1およびタイプ2の4−MUP水解活性に及ぼす効果についても検討した（表10）。チロシンの場合、タイプ1の活性には全く影響を与えないが、タイプ2の活性が1mM濃度で13％ほど増大した。しかし、基本的には、いずれの活性にもほとんど影響を与えなかった。フェニルアラニンの場合、濃度が1mMでも10mMでもタイプ1の活性にはほとんど影響を与えないが、タイプ 2の活性は13−23％ほど増大した。また、レバミゾールの場合、50mMという高めの濃度だけではあるが、タイプ1およびタイプ2それぞれの活性が41−56％阻害した。以上、レバミゾールの効果に関しては、アルカリ性ホスフアターゼに対する阻 31.

(37) 害効果と類似していた。. 5）酸化剤処理タイプ1の性状についてのみであるがホスフアターゼ活性に及ぼす酸化剤としての過酸化水素の濃度効果について検討した（図18）。その結果、活性は濃度0．1％で約 60％に低下し、1％に上げると完全に消失した。さらに10％まであげたが活性は消失したままだった。従って、タイプ1を酸化状態におくことは失活させることが分かった。. 6）有機溶媒処理タイプ1およびタイプ2の4−MUP水解活性に対するメタノール、エタノール、 2−プロパノールおよびアセトニトリルといった、水に混和しやすい有機溶媒の効果についてまず検討した（表11および12）。その結果、タイプ2の活性は検討した有機溶媒のいずれに対してもほとんど影響を与えなかった。これに対し、タイプ1の活性はいずれの有機溶媒を用いても10％濃度にした場合、1・2から1．5倍と上がり、50％濃度にすると1．8から2．8倍までさらに増大した。他方、水と混和しないで2層となる有機溶媒としてクロロホルム、酢酸エチルおよびフェノールの効果についても検討した（表12）。クロロホルムや酢酸エチルを添加した場合、いずれのタイプの活性も88−96％は水屑に回収され活性は消失しなかった。ここで有機層にはほとんど活性は見られなかった。しかし、タンパク質の変性剤として核酸の抽出時に用いられるフェノール【7，49】を加えたあと、水屑および有機層それぞれの活性を求めたが、タイプ1の活性は16％ほど水屑に見られたものの非常に低下した。タイプ2の活性にいたっては全く消失した。. 32.

(38) 7）TritonX−114の効果 TritonX−114に水を加えると温度30℃以下では水と混和するが、30℃以上に上げると混和せずに白濁する働きがあるので、この性質を利用して膜タンパク質の分離によく使用されている【2】0タイプ1とタイプ2の性状には違いが見られるので、条件によっては水と混和せずに二相を形成する界面活性剤であるTritonX−114【21 の分配の効果とあわせて活性に及ぼす効果を調べた（表13）。その結果、タイプ1とタイプ2にTritonX−114を加えたあと2相を形成するので分配した活性値を比較した0タイプ1の活性は水屑に75％、Triton層に25％回収されたことから水溶性であることが分かった0これに対しタイプ2の活性は水層に 27％Triton層に73％と逆に親油性、つまり疎水性を反映していることが分かった。つまり、両者の性状に違いのあることが分かった0なお、タイプ1およびタイプ2 の代わりに粗酵素源として卵巣卵抽出物を、プロナーゼ未処理だが同じように TritonX−114を加えた場合、活性が水屑に60％、Triton層に40％と分配された。両タイプがそれぞれ分画された結果であると判断した0なお、SDSのない場合に求めた活性は、水層に79％と回収され19％はど増大したがこの値は低分子量型ホスフアターゼに由来した結果であると示唆された。. 33.

(39) 5・3・ホスフアターゼ活性因子の生理的機能の探索 5・3・1・カエル卵成熟過程における関与アフリカツメガエルの未成熟な卵母細胞に見出したメガロホスフアターゼは、排卵したあとの成熟卵にはゲルカラムクロマトグラフィーで素通り画分に活性が見られなかった（図19）0このことから、当初見られた活性が卵成熟の過程で消失した結果を反映し、卵成熟の制御に大きく関与していることが示唆された。更なる生理的役割を明らかにする手がかりを得るために、プロゲステロンもしくは亜鉛イオン【67・681によって誘起される卵成熟過程で、メガロホスフアターゼ活性がどのように変動するかを解析した（図20）。その結果、プロゲステロンが卵母細胞に働くと7時間後に卵成熟率が70％と卵成熟が進行した0この際、メガロホスフアターゼ活性は、はじめ有意な活性が見られたが、卵成熟が誘起され2時間後には70％、4時間後には50％と低下した。他方、プロゲステロンの代わりに亜鉛イオンを卵母細胞に作用させた場合、7時間後には卵成熟率が70％となった0この過程で求めたメガロホスフアターゼ活性はGVBDが起こる前に一度低下したが、GVBDの完了した6時間後には再び増大し、プロゲステロンの作用による場合と違いが見られた。以上、メガロホスフアターゼ活性はプロゲステロンおよび亜鉛イオン【67，681によって誘導される卵成熟過程において変動する傾向がいずれの場合にも見られ、両者に違いが見られた。このことから、カエル卵成熟過程においてメガロホスフアターゼが活性制御を受けていることが示唆された。. 5．3．2．器官／組織特異性アフリカツメガエル卵巣卵のプロナーゼ消化物にSDSにも耐性なホスフアターゼ活性を持った因子（タイプ1およびタイプ2）が活性染色法で容易に検出されたので、卵巣以外の器官ないしは組織に類似した活性因子が存在するか否かを検索すること 34.

(40) は、活性因子の機能を明らかにしていく上で必要なことである。アフリカツメガエル雌および雄成体から単離した各種器官ないしは組織を、プロナーゼで処理し遠心分離して得た上浦画分をプロナーゼ消化物とし、0．5％SDS存在下および非存在下での4−MUP水解活性を測定した（表14）。なお、それぞれの試料を活性染色法でも分析した（図21）。SDS存在下における活性値に着目して各種器官・組織での値を卵巣での値と比べたとき、卵巣よりも心臓は3倍ほど高かった。肝臓や小腸からのものは卵巣での値に似ていた。皮膚、精巣、肺および筋肉においても活性は充分あることが分かった0なお、採取した血液からは有意な活性量が得られなかった0他方、SDSが存在しない場合に求めた活性値とSDSがある場合での値との比率を算出した。卵巣の95・5％に対して精巣および心臓では100％以上であった。卵巣の場合より皮膚、肺、筋肉、肝臓は低いといってもそれ相応のメガロホスフアターゼの存在が確認できた0小腸に関してはSDSがなくても有意な活性が見られた。なお、これらの各試料を活性染色法により活性のバンドも分析した（図21）。卵巣ですでに明らかとなったタイプ1およびタイプ2を対照として、それぞれの器官／組織に見られるタイプの様式を特定した。卵巣のタイプ1およびタイプ2に相当するバンドは肝臓、皮膚、心臓および筋肉といった器官／組織のいずれにも検出された。しかし、精巣、小腸および肺ではタイプ2のみでタイプ1は検出されなかった。以上の結果より、卵巣から単離されたプロナーゼとSDSの両方の処理に耐性であるホスフアターゼ活性因子は、卵巣でのタイプ1およびタイプ2の分布の違いはともかく精巣、心臓、肝臓など検討した器官／組織に幅広く分布していることが分かった。本研究は生理的機能を考えるうえで極めて有益な知見であった。. 5・3・3・20Sおよび26Sプロテアソームのペプチダーゼ活性に及ぼす効果当研究室では、本研究を開始する以前からカエル卵成熟の制御機構の解明にあ 35.

(41) たって、高分子量多機能性プロテアーゼ複合体（プロテアソーム）の機能や構造に関する研究を別途続けている。本研究においてはヒキガエル卵巣からプロテアソームの生理的状態を反映した26Sプロテアソームを精製し、その生化学的な性状の一部を明らかにした（図22）。20Sプロテアソームをコアにして多数のサブユニットから構成されている26Sプロテアソームに注目したとき、カエル卵成熟過程において構成する一成分のリン酸化能に違いが見られている【39，611。このような知見を得ていたので、プロテアソーム活性の制御をリン酸化／脱リン酸という視点から検討することは有意な情報が得られることが示唆された。別途に単離した20Sないしは26S プロテアソームと、ホスフアターゼ活性因子であるタイプ1とタイプ2が、ホスフアターゼ活性とプロテアソーム活性（ここではキモトリプシン様活性に注目した）の相互にどのような制御をしているかを検討した。 20Sないしは26Sプロテアソームをタイプ1ないしはタイプ2と18時間保温した場合、20Sプロテアソームの活性はタイプ1では16％、タイプ2では27％といずれも上昇させた。他方、26Sプロテアソームの活性は、タイプ1そしてタイプ2いずれによっても85％と著しく阻害した（表15）。なお、別途それぞれ4−MUP水解活性を調べたが、0．5％SDSがあってもなくてもそれぞれの値には違いがないうえ、いずれも有意な活性の変化は見られなかった（表 16）。つまり、いずれのプロテアソームもホスフアターゼ活性を制御することはなかった。. 36.