関す 研究 膵内分 動態 実 験的急性膵炎

3 44 金 沢 大 学 十 全 医 学 会 雑 誌 第8 6巻 第4号 3 亜 ^‑3 6 6 (1 97 7)

実_{験 的 急性 膵 炎}^に お ける膵 内分^泌動 態に 関 する研 究

金 沢 大 学 医 学 部 第2 外科 学 講 座 (^主任: 宮 崎 逸 夫 教授)

杉 井 衛

(昭和52 年5 月6 日受 付)

本論 文^の要 旨^{の 一} 部は 1976 年 第1 8回日本 消化器 病 学 会 秋 季大 会. 197 7年 第63_{垣] 日}本消 化 器病 学 会 総 会^{に おいて}発 表し た^.

急性 膵 炎^の本 態は^いま だ充 分に解 明^{さ れて い ない} が, Try psin を中 心と し た膵 酵 素^の問質 内逸 脱^によ る自己消 化^であ る と 理解さ れて い る^{け6 ) →}方^,急 性 膵 炎にお け る病 態生至削 ま^. 従 来^, 主と して膵 外 分泌^の面 か ら検 索さ れてお り, 膵 内 分泌腺と その ホ ル モ ^ンの分 泌 動 態^{につ い て の}報 告は比 較 的少ない . し か し,1 9 6 0 年 Be r s o n & Yalo wT) によっ てイン スリンの 免 疫 学 的測 定法^が確 立さ れて以 来^, 急 性 膵 炎^{にお け る イン}

スリ^ンの分 泌 動 態^につ い て の報 告^{8 ト川)} も見ら れ る よ う にな^っ た^. ま た. 最 近^{に い}た り, グ^ルカゴンも測 定 可 能と な り, 本^{症にお け る}内 分泌動 態^に対す る関 心か高 ま りつ つある^‖). し か し, イ ^ンスリ^ンにつ い ては血 清

のイ^ンスリン値が直 接 膵La nge rha n s 氏 島_{( 以}下 ラ

島と略す) β細 胞^の機 能を反 映して いる か ど う か十 分 に解 決さ れて いない^{1 2)}. そのた め, イ^{ン ス} リ^ン測 定 法 が確 立さ れ た現 在^でも, 糖尿 病 あるいは急 性 膵 炎な ど にお け るβ細 胞 機 能 低 下^の診 断^には依 然 血 糖 値^の測 定 が主と して用^いら れ. 補 助的^にイ^ン スリ^ンの測 定が な さ れて いる. そこ で最近では, β細 胞 機 能を よ り直 接 的に検索す る た めに. 膵 組 織あ る^いは膵ラ島 周辺 海 流 法^{13 )〜15)}, 膵 切 片あ るいは分 離 膵^ラ島を in c ubatio n

す る方法^{16 卜 24)}組 織 培 養法²⁵⁾²⁶⁾ な ど が利 用さ れ る よ うに なった^.

ところで, 急 性膵 炎^にお け る糖 尿お よ び高血 糖^の発 生 頻 度は^, そ れ ぞ れ10 ^〜3 0 %^{27 卜 29)}. 2 0^一‑9 0 %^{29 ト 3 2)} と 報 告さ れ. 実験 的^にも 高血 糖. 糖 代 謝 異 常な ど^の内分 泌障害が報 告さ れて いる^2)8). その発 生 原 因^{につ い て}は 必ず し も明 確^では ない. し か し, 急 性 膵 炎^にお け る膵 内分 泌 動 態は∴病態 解 明や治 療 上^の観 点か ら重 要な意 義を も^つ と思わ れ る.

著 者はラッ ト に急 性 膵 炎を作 製し^, 急 性 膵 炎 時^にお

け る膵 内 分泌動 態^, 特^に膵 内分 泌^{ホ ル モンの}合成 能お よ び分 泌 能につ いて検 討し若干^の成 績^を得たの で報告 す る.

実 験 方 法 1 ^. 実 験 動物

体 重1 50 ^〜35 0g の呑 竜 系堆^ラッ トを実 験に供し た.

2 . 急 性 膵 炎 群お よ び対 照群^の作 製 方 法 1) 急 性 膵 炎 群

ラ ッ トを24時 間絶 食後^､ エ ^ー テ ル麻 酔 下^{に て}開 腹 L ^, B lo ck ら^{33 )}の方 法^, すな わ ち総胆 管の十^二指腸開 口部^の最 下 端を絹 糸^で結 貧^し, 急 性 膵 炎 群^{と し た. こ}

の操作は^でき る だ け無 菌的に行ない, 他 臓 器^の損 傷,

出血^の防 止^に細 心^の注 意を払^っ た( 図1 )^. 2) 対 照 群

ラッ トを24時 間絶 食後. エ ^ー テ^ル麻 酔 下^{に て}開腹^の み行な^い対 照群と し た.

3 ^. 病理組織 学 的検 索 法

急性 膵 炎作 製12, 1 8. 2 4. 4 8, 7 2時 間 後. エ ^ー テル

麻 酔 下で膵 組 織を摘 出し, 直ちに中 性緩 衝ホル マリ^ン 液^で固 定し^, He m ato xylin^‑Eo sin 染 色 ( 以下H‑^E 染 色と略す) と^. Go m o ri の A l dehyde Fu chsin

染 色 (以下A^‑F染 色と略す) ^の藤田変法を行な^{い う}島 の病理 組織 学 的 変 化を検 索し た^. A^‑F染 色は摘 出IJ た 勝 組 織を^, 1 0 % 中 性緩 衝^{ホ ルマ}リン液^で2 ^〜 3 日固定 後. パ ラ フ ィ ン包 埋を行な^い, 標 本^{を 4 〜 6} 〃 に薄 切 し^. 脱^{パ ラ}後 水 洗し た^. 次い で , 酸 化 液( 2 ^.5 % 過^マ

ンガン酸^カリウム1 容, 5 % 硫酸 水1 容, 歳 留 水6 容) ^で 1分 間 酸 化し た^. 次^に標 本を 5 % 修 改 水^で還 元 脱 色して水 洗し, 6 0% アル コ ^ー ル に1分 間 浸し た後^.

ア ル デ ヒ ド フ ク シ^ン液 ( 塩 基 性フク ^シン 2.Og^{, パ}ラ

E xp^{e r}ir n e ntal stud_y o n in s ula r fu n ctio n in Exp^{e r}im e n t al _pa n c r e atitis. M a m o r u Sug ii,

Dep^{a r}tm e nt of S u rg^{e r}y ( Ⅱ)^, ( D i^{r e c}to r : Pr of. I. Mi ya z ak i)^. Scho ol of M edicin c, Ⅰくa^･ n a z a w a Univ e r sit y^.

実験 的急 性膵 炎^にお け る膵 内分 泌 動 態に関 す^る研 究

Du o 由n u m 〆 一一/

図1 急 性 膵 炎 作 製方 法( B l^{o c}k の方 法)

ア ル デ ヒド2 .O ml, 濃 塩 酸2^.Oml^, 6 0 % ア ルコ ^ー ル 100n ‑1) で3 0分 間 染 色し た^. 次に標 本を 6 0 % ア ル コ

ー ル で3 回 洗^った後, 軽く水洗し, フ ク シンポン ソ

ー液 (^{ボ ン}ソ^{ー ･ ド･} キシリヂン0 .5g ^, 醸 性フ ク

シン0^･2g^･ オレ ン ジG O.2g^. 0.5 % 酢酸 水1 0 0 m l ) ^で 8 分 間染 色し た. 更^{に こ}れ を0 ^.5 %酢 軟 水^で洗^{い ,} 3

% 燐タング^スデ^ン酸 液^に数 分 問浸し, 再び0.5 % 酢 酸 水で洗い, 2 % ^ライトグ リ ^{ー ン}液^で数 分 問 染 色し た ^. こ の染 色後^.標本を0,5% 酢酸 水で洗い .無 水^{ア ル コ ー}

ル で脱水し^{, キシロ ー ルで}透徹 後, 封 入を行なった.

4 ^･ 血 糖 値. イン ス リ^ン値^の測 定

急性 膵 炎作 製1 2,1 8, 2 4^. 48^, 7 2時 間後, エ ^ー テ ル

麻酔下^で開腹, 下 大 静 脈よ り約5 ^ml採 血し^, 血 糖 値^. 血清イ^ンスリン値を測定し た^. 同 時^に膵 組 織を摘 出し て膵組 織 内のイ ンスリ^ン値も測 定し た.

1 ) 血 糖 値 測定 法

採血後 直ちに遠 心し^, 得ら れ た血清よ り, 0 ^‑t｡Iu^.

id in e 法 ( G lu c o s e Te st Wako) に て 血 糖 値を 定し た. 単位はm g.^{/d lであ る.}

2₎ 血 清イ^ンスリ^ン値 測定 法

血糖 値測 定と同じ血 清を凍結 保 存し^, 1 カ月以内^に P hadeba s in s ulin te st(塩 野 義 社 製₎ で イ ン ス

リン値を測 定し た. 単位^は〟U/mlであ る.

3) 膵 組 織 内イン ス リ ン抽 出 法³⁴⁾

摘出^{L た}膵組 織を軽く水 洗し た後, 2 ^〜 3 m m 角^に 細切し^･ これ を あ ら か じ め膵組 織1 0 0mg 当た り 1 11 11 以上^の酸性^エ タ^{ノー ル} ( ^エタノ ^ー ル7 5 0ml, 水2 3 5ml.

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濃 塩 酸1 5^皿1) を入れて水冷し たホ モ ジ ナ イ サ ^ー に投 入し, 直ちに水 冷し な が らホ モジナイ ズ し た^. 更^に ,

これに^パラ フ_ィム で ふた を して. 約12 ^〜1 5時 間^, 0 ^〜

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図2 膵 組 織 内イ^{ン ス リ ン}抽 出法

3 46

4^{‑ J}Cで放 置し た. そ^の後 資 料を再び軽く ^{ホ モ} ジナ イ ズ して冷 却遠 心器^で遠心 し た^. ( 3^,0 0 0^rpm ･ 1 5分 間)^･ 次^に. その上 清液^を取り^, 沈 殿には前と等量^の酸性 ^エ

タ ノ^ー ルを加えて再びホ モジナイ ズ し^､ 0 ^〜 4 ^つC ^で 1時 間以上 放 置 後^. 冷去口遠 心を行な ^っ た･ 双方^の上 宿 液を合わ せ た液を希 釈し^て. P hadeba s in s ulin te^･ st によ り^, イ^{ン ス}リン値 を 測定し た( 図 2 ) ^■

4) 組織 内蛋 白 定 量 法

蛋白^の定量は Lo w ry 法^で測 定し た^. 単位はm g /d l であ る^.

5 ^, 経 静 脈 的ブド ウ糖 負 荷 試 験 りV【^{G T′}r ) 急性 膵 炎 群お よ び単 開腹 群^{ラッ ト の}尾静 脈よ り1 ^m g / g 体重^{のブ ド ウ}糖を注 入し, 1 0 ,2 0 , 3 0 .6 0 , 9 0分 後^{に ヘマ ト ク リ ッ ト}管^{に て}眼 高 静 脈 叢よ り採 血し･ 血 糖 値と血 清イ^{ン ス}リン値を測定し た^.

6 ^. Auto r ad iogr aphy

I V‑^{G T T と}同様^{に, ラ ッ ト}尾 静 舵よ り ³H^‑Le u ci^‑

n e ( D I^;Le u cin eN^4,5‑^{3H ) 1.5pci/ g体 重を注 入L て1} 時 間 後^に肺 摘して, そ れ を1 0 % ^{ホ ルマ}リ^ン液^で固定し

パ ラ フ_ィ ンで包 埋し た^. 更^に 標 本を 4 ^〜 6〟 て 切 出

し. デッ ビン グ法^{35) で} 乳 剤 ( Saku r a N R‑^M2) を塗 布し^て冷 蔵 庫 内 (0 ^〜 4 ℃) ^で6 週 間 露 出し た^‑ こ の

標 本 を現 像し, H ^‑ E染 色を行な ^っ た^･ Auto r ad io^･

g^{r a m} の Gr ain 数^{の カ ウ ン ト}は光 学 顕 微鏡1000 倍

で行ない, ラ島 細 胞1個 内^の標 識^{ア ミ ノ}酸^の取 込み状 況を検 討し た^.

7 ^. 分 離^ラ島^にお け る塞 白 合 成 能お よ ぴイン スリ^ン 分 泌 能^の検 索

1) ^ラ島分 離 法^{36 ト 38)}

急 性 膵 炎群お よ び単 開腹 群^{ラッ ト}を ･ ラボナ ^ー ル

(50I ng /kg体 重) ^の腹 腔 内 投^仁i で麻酔し･ 以下^の様 な手技で ラ島^の分 離を行な^っ た. ま ず^{ラッ ト}を上 腹 部 正 中 切開^で閲 腹後^. 細 胆 管を十二指 腸 開口部直 前^で結 染( 急性 膵 炎 群^{ラ ット で}は 二重結 款と な る¹)し, 更^に 肝 管^の合流 離附 丘よ り総 胆 管 内^{へ ,} 2:卜19^{ケ ー ジ の}翼 状 針^を別 人し, ブ ド^ウ糖 =川 m g/ d l濃 度) を含む Ha nks 液20^{Il l}l を注 入して. 膵 全 体^を膨 化さ せ た^{･ こ} の膨化し た膵 組 織を鋭 的^に摘 出し, 直ち^に2 0 ^〜 3 01111 の冷去口し た LIa nks 液 中^で洗 漉し∴浮 遊 物を除 去し た^. 摘 出L た膵 組 織をピン セッ ト^{で つ} ま み ^, 眼科 用 ク ^{ー パ ー} を用^{い て で}畠 る だ け細 切し, 三角^{フ ラ スコ}内

へ入れ た. 更に こ の申^へ Collage n a s e ( Ty peⅣ･ L^･

ot,No. 1 5 C 2 46^, W o rth ing to n 杜 艶= O^m gと bo vi^･

n e s e r u m al bu min ( L^ot^. N^o. M 4 6 2 0 6^. A ^{r m o u･}

r 社製) 1 00n lgお よ ぴ Ha nks 液5 ^ml を加え た^･ 次

に こ の三角^{フ ラ スコ}を密 栓して3 7^￠c^の W ^{ate r} bath 井

in c ubato r の中^で1 50 ^〜2 0 0匝レ 分^の振凌^の 下に約1 5 分 間 膵 切 片を Co11age n a s e で消 化さ せ た^. 泥状^に 消 化さ れ た資料をメ ス シリ^ン ダー^{内で W a r m Ha n･}

ks 液 (､室 温) ^で4回^, 次に CoI d Ha nks 液( 4 ⁰ C前 後) ^で4 臥 合計8回^の洗 浄^, 沈 殿を繰り返L て

残 存す る膵 外 分泌腺組 織. 結 合 組 織 ^. Collage n a s e

な ど を除 去し た^. 最終^の洗 浄を終え た後, メ ス シ リン

ダ^ー内^に残^っ た資 料^に少 量^の C^ol d Ha nks 液 を追 加してよ く混 和^{し, これ を ic e bath} 内^の冷 却さ れ たシャ ^{ー レ}に移し た^. 次^に内 径5 m n lの市販 ガラ ス管

で作 製L た C a pi11a l^‑y P ipet te を用い て実 体 顕 微 鏡(1 5倍 率) 下^{で ラ}島を採 取し. 以下^の実 験^に供し た,

本 法に よ り 1 匹^{の ラ ット}よ り^, 膵 炎 群^では80 ^〜1 2 0個 対 照 群^で1 80 ^〜2 0 0偶の ラ島が分 離^､ 採 取^で■^‑

き た( 図 3 )^.

2 ) 分離^ラ島^{の 3}H‑^{Le u cin e} 取込 み実 験 径200 ^〜2 5 0〃 の大き さ^で辺 縁が整なラ島1 0^〜1 5個を 選びT これ^に1 9 9培 地( ^{ニ ッ ス イ}社 製) 1^.O^ml,

3H^･Le u cin e( D L L^{e u c}in e‑^4,5‑^{3日) 20}〟C i を加え^, 029 5 % ^. C O25 % ^の混 合ガス,37^Qcの下で3 0分 間in c ubatio n L た. 次^に Capilla ry P ipet te を用^{い て ラ}島をシ ャ ^{ー レ}内^に移し注 意 深く 3 回 水洗し た. 更に ラ島^にH2

Pa n c r e a s

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図 3 ラ島 分離 法 (Collage n a s e d ige stio n m ethod)