高等植物を由来とする腫瘍細胞毒性成分の探索研究

論文 内 容の 要旨

申 請 者 は 天 然 か ら の 新 規 抗 腫 瘍 活 性 成 分 の 探 索 を 目 的 に ， 抽 出 エ キ ス に 腫 瘍 細 胞 毒 性 が 認 め ら れ た ビ ャ ク ダ ン 科 Santalum album 心 材 ， メ ギ 科 Caulophyllum thalictroides 地 下 部 ，ユ リ 科 Fritillaria meleagris 鱗 茎 お よ び Bessera elegans 鱗 茎 の 成 分 探 索 を 行 っ た ． そ の 結 果 ， 新 規 化 合 物 38 種 を 含 む 80 種 の 化 合 物 を 単 離 し ， そ れ ら の 構 造 を 明 ら か に す る と と も に ，腫 瘍 細 胞（ HL-60 白 血 病 細 胞 ，A549 肺 が ん 細 胞 な ど ）と TIG-3 線 維 芽 細 胞 に 対 す る 細 胞 毒 性 を 評 価 し ， 腫 瘍 選 択 性 ， 構 造 活 性 相 関 ， ア ポ ト ー シ ス 誘 導 活 性 ，PPAR-γ リ ガ ン ド 活 性 天 然 物 で あ る マ グ ノ ロ ー ル と の 併 用 効 果 な ど を 検 討 し た ．

【 第 1 章 】 ビ ャ ク ダ ン 科 Santalum album心 材 の 化 学 成 分 1 , 2 )

S. albumの 心 材 (1.0 kg) を MeOHに て 抽 出 し ，減 圧 下 濃 縮 し た ．得 ら れ た MeOH抽 出

エ キ ス は HL-60 細 胞 に 対 し て 細 胞 毒 性 を 示 し た (IC5 0 2.1 µg/mL)．こ の エ キ ス を Diaion

CHO OH R OH R OH OH OH OH OH 1 2 O OCH3 HO OCH3 OH OH OH OH H3CO HO OH OCH3 O O OCH3 OH OCH3 H3CO HO OCH3 H H 22 23 24 OH OH OH OH OH OH OH OH R OH OH OH OH OH R OH OH OH OH OH OH OH OH H H 8 9 10 11 R = CH2OH 12 R = CHO 13 14 15 16 R = CH3 17 R = CH2OH 18 19 O O OHC OCH3 OH R OCH3 OH 7 8 20 (7R,8R) 21 (7S,8S) 3 R = CH2OH 7 R = CH3 4 R = COOH 5 R = CH3 6 R = CH2OH R = OH R = OCH3 HO OH OH 【 第 2 章 】 メ ギ 科 Caulophyllum thalictroides地 下 部 の 化 学 成 分3 )

C. thalictroides の 地 下 部 を MeOH に て 抽 出 し た ． 得 ら れ た MeOH 抽 出 エ キ ス (IC5 0

12.1 µg/mL) を S. albumと 同 様 の 方 法 に よ り 分 離 ， 精 製 し ， 4 種 の 新 規 ト リ テ ル ペ ン 配 糖 体 (30, 32-34) を 含 む 22 種 の 化 合 物 (25-46) を 単 離 し た ． R1O H H H R3 COOR4 R1O H H OH O O O 27 28 H OH Glc-(1 2)-Ara Ara AraO H COOH H 29 OH RO H H 31 O O H H R2 OH R2 R1 R2 Glc-(1 2)-Ara R = RO H COOH H H OH 30 R = Glc-(1 2)-Ara H CHO CHO CH₂OH CH2OH CH2OH CH₃ CH2OH H OH OH OH OH H H Ara Ara Glc-(1 2)-Ara Ara Ara Ara Ara H H H Glc Glc-(1 6)-Glc H H 37 38 39 40 41 Glc-(1 2)-Ara Glc-(1 2)-Ara Ara Glc-(1 2)-Ara Ara H H OH OH OH CH3 CH2OH CH₃ CH3 CH₂OH H H H H H Rha-(1 4)-Glc-(1 6)-Glc Rha-(1 4)-Glc-(1 6)-Glc Rha-(1 4)-Glc-(1 6)-Glc Rha-(1 4)-Glc-(1 6)-Glc Rha-(1 4)-Glc-(1 6)-Glc CH2OH CH₂OH CH3 CH2OH CH₂OH H OH H H H 42 43 44 45 46 Ara Ara Glc-(1 2)-Ara Glc-(1 2)-Ara H R₁ R₂ R₃ R₄ 25 26 32 33 34 35 36 R₁ R₂ R₃ R₄ 【 第 3 章 】 ユ リ 科 Fritillaria meleagris鱗 茎 の 化 学 成 分 4 )

F. meleagris の 鱗 茎 を MeOH に て 抽 出 し た ． 得 ら れ た MeOH 抽 出 エ キ ス (IC5 0 13.5

【 第 4 章 】 ユ リ 科 Bessera elegans鱗 茎 の 化 学 成 分 5 )

B. elegans の 鱗 茎 を MeOH に て 抽 出 し た ． 得 ら れ た MeOH 抽 出 エ キ ス (IC5 0 20.2

HSC-4 細 胞 ) に 対 し て も 細 胞 毒 性 を 示 し た ． リ グ ナ ン 類 の な か で は ， 側 鎖 に ア ル デ ヒ ド 基 を 有 す る 20， 21 が HL-60 細 胞 と A549 細 胞 に 対 し て ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し た ． ト リ テ ル ペ ン 配 糖 体 の な か で は ，モ ノ デ ス モ シ ド で あ る 25 と 35 が 腫 瘍 細 胞 選 択 的 に 細 胞 毒 性 を 示 し た ． ス テ ロ イ ド 配 糖 体 の な か で は ， 47 と 58 が HL-60 細 胞 に 対 し て ， 57 が A549 細 胞 に 対 し て 腫 瘍 選 択 的 な 細 胞 毒 性 を 示 し た ． こ の 選 択 性 は ス ピ ロ 環 部 (22 位 ) の 立 体 配 置 が 関 与 し て い る と 考 え ら れ る ． コ レ ス タ ン 型 ス テ ロ イ ド 誘 導 体 55aで 処 理 し た HL-60 細 胞 は ， ア ポ ト ー シ ス に 特 徴 的 な 形 態 的 変 化 と caspase-3 の 活 性 化 を 示 し ， G2/M期 の 細 胞 の 蓄 積 と と も に sub-G1ピ ー ク の 上 昇 を 認 め た ． し た が っ て ， 55aは G2/M期 で 細 胞 周 期 を 停 止 さ せ ， ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る こ と が 示 さ れ た ． プ ソ イ ド フ ロ ス タ ノ ー ル 型 ス テ ロ イ ド 配 糖 体 73 は 時 間 依 存 的 に ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し ，A549 細 胞 に 対 し て は G0/G1 期 に お い て 細 胞 周 期 を 停 止 さ せ ， ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し た ． プ ソ イ ド フ ロ ス タ ノ ー ル 型 ス テ ロ イ ド 配 糖 体 類 は 一 般 に 細 胞 毒 性 を 示 さ な い た め ，73 が 腫 瘍 選 択 的 に 細 胞 毒 性 を 示 し た こ と は 興 味 深 い 新 知 見 で あ る ． 近 年 ， 種 々 の が ん 細 胞 に お い て ペ ル オ キ シ ソ ー ム 増 殖 剤 応 答 性 受 容 体 (PPAR)-γ が 高 発 現 し ， PPAR-γ リ ガ ン ド の 抗 腫 瘍 活 性 や 抗 が ん 剤 の 増 強 作 用 が 注 目 さ れ て い る ．

Table 1. Cytotoxic activities of 1-24, etoposide, and cisplatin against HL-60 leukemia cells and TIG-3 normal cells

HL-60 TIG-3 HL-60 TIG-3 HL-60 TIG-3 HL-60 TIG-3 HL-60 TIG-3

1 2.20 ± 0.23 >40 6 11.1 ± 0.19 >40 8 19.7 ± 0.23 >40 14 >40 >40 20 1.50 ± 0.02 >40 2 >40 >40 6a 0.70 ± 0.08 4.0 ± 0.03 9 >40 >40 15 36.0 ± 2.20 >40 21 4.30 ± 0.13 >40 3 >40 >40 6b >40 >40 10 13.0 ± 0.68 11.5 ± 2.06 16 9.90 ± 0.52 >40 22 >40 >40 3b >40 >40 7 21.3 ± 0.51 >40 11 19.9 ± 0.67 13.5 ± 0.49 17 11.9 ± 0.41 >40 23 >40 >40 4 >40 >40 7a >40 >40 12 2.10 ± 0.03 12.1 ± 2.15 18 10.4 ± 0.42 38.5 ± 0.55 24 >40 >40 5 13.8 ± 0.97 >40 7b >40 >40 13 >40 >40 19 20.3 ± 0.51 >40 etoposide 0.48 ± 0.03 14.5 ± 1.00 5a >40 >40 cisplatin 1.76 ± 0.05 2.62 ± 0.18 5b >40 >40 a

Date are represented the mean value ± S.E.M. of three experiments performed in triplicate.

IC50 (µM)

Compd IC50 (µM)

IC50 (µM) a

Compd Compd IC50 (µM) _Compd IC50 (µM) _Compd

Table 2. Cytotoxic activities of 25-80, etoposide, and cisplatin against HL-60 cells, A549 cells and TIG-3 normal cells

HL-60 TIG-3 HL-60 TIG-3 HL-60 A549 TIG-3 HL-60 A549 TIG-3

25 8.02 ± 0.23 >10 36 >10 >10 47 5.00 ± 0.16 > 10 1.0b 57 > 10 7.93 ± 0.16 > 10 26 >10 >10 37 >10 >10 48 5.74 ± 0.10 > 10 1.0b 58 4.42 ± 0.92 > 10 > 10 27 >10 >10 38 >10 >10 49 > 10 > 10 > 10 59 6.10 ± 0.04 6.53 ± 0.22 1.0b 28 >10 >10 39 >10 >10 50 3.77 ± 0.25 6.83 ± 0.25 1.0b 60 6.77 ± 0.05 4.44 ± 0.09 1.0b 29 >10 >10 40 >10 >10 51 > 10 7.57 ± 0.24 > 10 61 4.68 ± 0.09 5.19 ± 0.02 1.0b 30 >10 >10 41 >10 >10 52 > 10 4.45 ± 0.05 1.0b _{62 > 10 > 10 > 10} 31 >10 >10 42 >10 >10 53 > 10 > 10 > 10 63 > 10 > 10 > 10 32 >10 >10 43 >10 >10 54 > 10 > 10 > 10 64 > 10 > 10 > 10 33 >10 >10 44 >10 >10 55 > 10 > 10 > 10 34 >10 >10 45 >10 >10 55a 7.78 ± 0.09 > 10 > 10 35 6.25 ± 0.36 >10 46 >10 >10 56 > 10 > 10 > 10

HL-60 A549 TIG-3 HL-60 A549 TIG-3 HL-60 A549 TIG-3

65 5.41 ± 0.24 4.08 ± 0.14 1.82 ± 0.01 71 > 10 > 10 > 10 77 6.14 ± 0.14 0.50 ± 0.01 > 10 66 > 10 > 10 > 10 72 > 10 > 10 2.02 ± 0.01 78 4.24 ± 0.04 1.29 ± 0.02 > 10 67 > 10 > 10 > 10 73 3.75 ± 0.11 1.64 ± 0.09 > 10 79 0.43 ± 0.02 1.99 ± 0.06 4.57 ± 0.19 68 > 10 > 10 > 10 74 3.09 ± 0.13 1.10 ± 0.01 1.12 ± 0.01 80 > 10 > 10 > 10 69 8.05 ± 0.28 3.55 ± 0.07 1.74 ± 0.01 75 4.12 ± 0.20 1.53 ± 0.04 > 10 etoposide 0.32 ± 0.01 4.07 ± 0.23 11.2 ± 1.37 70 6.22 ± 0.04 3.80 ± 0.07 > 10 76 > 10 > 10 > 10 cisplatin 1.23 ± 0.03 2.30 ± 0.04 2.01 ± 0.32 a

Date are represented the mean value ± S.E.M. of three experiments performed in triplicate.b IC50 values are less than 1.0 µM.

IC50 (µM) _Compd IC50 (µM)

Compd IC50 (µM) _Compd IC50 (µM) _Compd IC50 (µM)

そ こ で ， 天 然 物 由 来 の PPAR-γ リ ガ ン ド で あ る マ グ ノ ロ ー ル と ， 腫 瘍 細 胞 選 択 的 に 毒 性 を 示 し た セ ス キ テ ル ペ ン 類 (1，5，6，16，17) お よ び リ グ ナ ン 類 (20，21) と の 併 用 効 果 を 検 討 し た ． そ の 結 果 ， セ ス キ テ ル ペ ン 類 お よ び リ グ ナ ン 類 は マ グ ノ ロ ー ル と の 併 用 に よ り 濃 度 依 存 的 に HL-60 細 胞 に 対 す る 毒 性 が 増 強 し ，ア ポ ト ー シ ス に 特 徴 的 な 形 態 的 変 化 が 認 め ら れ た ．化 合 物 1 の 細 胞 毒 性 は マ グ ノ ロ ー ル (1 µg/mL) と の 併 用 に よ り 100 倍 以 上 増 強 さ れ ，0.01 µg/mL の 濃 度 で HL-60 細 胞 に 対 し て ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し た ． In vivo 試 験 に お い て も ， マ グ ノ ロ ー ル の よ う な 天 然 物 由 来 PPAR-γ リ ガ ン ド の 併 用 に よ る 腫 瘍 細 胞 毒 性 成 分 の 投 与 量 の 大 幅 な 減 量 が 可 能 で あ れ ば ， 天 然 由 来 成 分 を 用 い た が ん 治 療 の 臨 床 応 用 へ の 展 開 が 期 待 で き る ． 【 研 究 結 果 の 掲 載 誌 】

1) Phytochemistry, 77, 304-311 (2012); 2) Chem. Pharm. Bull., 58, 587-590 (2010); 3) J.

Nat. Prod., 72, 1155-1160 (2009); 4) Steroids, 78, 670-682 (2013); 5) Phytochemistry, 96,

論文 審 査の 結果 の要 旨

松 尾 侑 希 子 氏 の 博 士 学 位 論 文 は ， 天 然 か ら の 新 規 抗 腫 瘍 活 性 成 分 の 探 索 を 目 的 に ， ビ ャ ク ダ ン 科 Santalum album 心 材 ， メ ギ 科 Caulophyllum thalictroides 地 下 部 ， ユ リ 科

Fritillaria meleagris 鱗 茎 ， ユ リ 科 Bessera elegans 鱗 茎 の 成 分 分 離 を 行 い ， 単 離 さ れ た