培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌モデルの作製

(1)

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌モデルの作製

著者名(日) 吉浦健太

雑誌名共立女子大学家政学部紀要

巻 61

ページ 109‑114

発行年 2015‑01

URL http://id.nii.ac.jp/1087/00003005/

Creative Commons : 表示 ‑ 非営利 ‑ 改変禁止

http://creativecommons.org/licenses/by‑nc‑nd/3.0/deed.ja

(2)

共立女子大学家政学部紀要第

61

号

(2015)

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌モデルの作製

Demons

廿

ationof anticancer activity of natural killer cells against colon cancer cells

泊出

eωlturesystem.

吉浦健太

Kenta YOSHIURA

1 .はじめに

癌の予防法に対するアブローチとして、生体の免疫力を活用することは大きな可能性を持つ方法である。健常な生体においても、種々の環境要因および内在的要因により日夜体内で発生する酸化ストレスなどにより、遺伝子が傷害され、異常な細胞の出現は避けられないとされるにしかし体内を監視するナチュラルキラー

(NK)

細胞をはじめとする免疫系が異常細胞を捉えて殺傷することにより、臨床的な痛の発症を抑えていると考えられている幻にさらに今日では、

NK

細胞の活性を上げることが抗癌戦略として重要であるとの認識から、

NK

細胞機能を上昇させる食品成分や薬剤の探索が重要な研究課題となっているかヘ一方、生体の免疫システムの理解は近年急速に発展しており、家政学系をはじめ多くの学生にとっては難解である。そのなかにあって描免疫の分野は興味を刺激される学生が多く、学生実験等にふさわしい題材であるが、実験手技が煩雑であり材料入手が容易でないことなどで敷居が高いのが実情である。以上の理由から、一般研究室でも容易にまた安全に施行できる適切な実験系が望まれる。そこで、この研究においては、臨床的に重

家政学部食物栄養学科

要な固形癌の一つである大腸癌を対象とし、

NK

細胞が癌細胞を攻撃する様子を顕微鏡下でリアルタイムに観察するとともに、定量的な癌細胞殺傷効果およびサイトカインの測定や

RT‑PCR

による遺伝子発現を含む

NK

細胞機能の測定を含めた

invitro

モデルを作成した。

2.

材料と方法細胞株および培養法

NK

細胞として

KHYG・1

(独立行政法人医薬基盤研究所

JCRB

細胞パンク)、および大腸癌細胞

DLD・1

(東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター)を用いた。基本培養液は、

RPMI‑1640

(シグマ)に、

10%

牛胎児血清

(FBS)

、ペニシリン

(100U/m

l ) /ストレプトマイシン

(100μg/m

l ) (ライフテクノロジー)を添加したものとした。細胞は、 5 %二酸化炭素含有

37t

恒温楢で培養した。

培養細胞の顕微鏡観察および経時的撮影

DLD・1

細胞を基本培養液に懸濁し、

96

穴プ

レートに、ウェルあたり

10⁴

個を播種し、一夜

培養し、プレート底面に付着させた。

KHYG・1

細胞は、基本培養液に

50ng/mL

ヒトリコンビ

(3)

共立女子大学家政学部紀要第

61

号

(2015)

表

1

各遺伝子のプライマー塩基配列および

PCR

産物長

遺伝子(産物長} 位置

GAPDH (238 b

同左

右

グランザイム

B(167 bp)

左

右

パーフォリン

(223bp)

左

右

ナントインターロイキン

(hrIL)・

2

(ORF Genetics)

を添加したもので培養し、

DLD

・

1

細胞が付着したプレートに、ウェルあたり

10.

個を加えた。位相差顕微鏡により、

KHYG

・

1

細胞が

DLD

・

1

細胞を攻撃する様子を観察し継時的に撮影した。

乳酸脱水素酵素

(LDH)測定

前項と同様に、

DLD

・

1

細胞(ウェルあたり

10⁴

個)を

96

穴プレートで培養後、同数の KHYG ・ 1細胞を添加し、その後、継時的に培養上清を採取し、培養上清中の

LDH

の活性を、

細胞傷害性検出キット

plusLDH

(ロシュアプライドサイエンス)で測定した。具体的には、

キット中の試薬が培養上清中の

LDH

により還元されて生じたホルマザンの吸光度

(492nm)

をマイクロプレートリーダー(クロメート・

4;

マイクロテック)で測定した。

生存細胞数の検定

前項と同様に、

96

穴プレートに、

DLD

・

1

細胞をウェルあたり

10.

個培養した後、種々の細胞数の阻iYG‑

1

細胞を加え、

24

時間培養した。

その後、ウェルをリン酸塩緩衝液

(PBS)

で洗浄し、プレートの底面に付着した生存細胞数を、

Cell Counting

K i

t‑8 (CC

長

8;

同仁化学研究所) で測定した。具体的には、洗浄後のウェルに、

キット中の

WST

・

8

試薬を加え

2時間培養し、

生細胞が産生する

NADH

の還元活性により生

(bp:

塩基対) 塩基配列

GAGTC AACGG A'廿TGGTCGT TTGAT TTTGG AGGGA TCTCG GGAGG CCCTC TTGTG TGTAA A

甘

ACAGCGG GGGCT TAGTT CTATA CGGGA TTCCA GCTCC A CGCAG GAACC TTTGT GTGTC

じたホルマザンの吸光度

(450nm)を測定した。

培養液中の IFN‑)1測定

24

穴プレートに、

DLD

・

1

細胞を

3.5X 10.

個培養し付着させた後、同数の

KHY

G ‑

1

細胞

(10⁵

個/ml) を加え、

6

時間培養後、上清を採取し、

ELISA

キット

(HumanIFN gamma EUSA Ready‑SET‑Go! ;アフィメトリクス・ジャパン)

で

IFN‑

)1を測定した。具体的には、キット中のキャプチャー抗体を結合したプレートに検体を入れ

4t

で一夜インキュベートした。補足された

IFN‑

) 1 に、

HRP

二次抗体を結合させた後

TMB

基質を加え

2 M

硫酸で反応を停止し、

発色の吸光度

(450nm)を測定した。吸光度は、

キットに付属する標品で作成した検量線

(4‑‑ 500 pg/ml)

により濃度に換算した。

RT

・

PCR

による遺伝子発現解析

グランザイム

B

、パーフォリン、対照としてグリセルアルデヒド ‑ 3 ・リン酸デヒドロゲナーゼ

(GAPDH)遺伝子についてRT

・

PCR

を施行した。プライマーは、遺伝子配列データペース

(GenBank， The National Center for Biotechnology Information; NCB

I)をもとに、

オンラインフリーソフトの

Primer3Plus

へおよび

Primer‑BLAST(NCB

I)を利用して設計した。配列および

PCR

産物長を、表

1

に示した。

DLD

・

1

細胞

(10⁶

個)を

10cm

デイシュに一夜培養し接着させた上に、阻iYG‑

1

細胞

(10⁶

個)

‑110

ー

(4)

培養細胞を

JTI

いたナチュラルキラー調

JI

胞の抗大

l!

結婚モデルの作製

a .

rf"司臥.‑

、

・ー 18:33

を加え、

611

寺

:r

日培必後、

KHYG・1

調

11

胞を回収した。細胞の

RNA

は、簡易悶サ

A

羽

IIIJ¥

キット

RT‑PCR

用 ( カネカ ) で抽出し、

RT‑PCR

は、

PrimeScript ™ One Step RT‑PCR Kit Ver.2

( タカラバイオ)の試薬およびプロトコルで施行し

た

。PCR

反応は、

94⁰C: 30

秒、

60⁰C: 30

秒、

72⁰C : 30

秒を

30

サイクルとした。サーマルサイクラーは、

PCR

くん ( 北海道システムサイエンス ) を用いた。

PCR後、反応液に、 Midori Green Direct

(日本ジェネティクス) を加え、

296

アガロースゲルに屯気泳動し、青色

LED (470nm)

を!照射し搬影した

。

c

l

世

11 NK

細胞が大腸揃細胞を攻思する総子を従えた位相l 差lIJ(微鋭勾:J~。上段は時系列写真。数字は

1

校目

の時点からの経過II>IIIU

(

分 . 秒)を示

す。

NK細胞が形を変えながら揃細胞に向かつて遊走

し、援活した後、術細胞の劇

11

胞膜を穿孔し、その後、離れて行く。

1

、

12

千件闘の

'.f!J:

災、災級は痢細胞の車歯車

11

を示す。各写真、

4俳l

の点は

i

J:日してい

るNK調11胞の給郭を示す。下段はよ段20分40秒経過11寺の枠部分拡大。矢政i

は術細胞から流出する調

IJJ

胞質を示す。

NK:NK

梨

IIJ

胞.

C:大腸揃細胞。

400倍。

3.

結果

KHYG‑l

細胞による

DLD‑l

剥

11

胞攻懸の様態

精義プレート庇而に付着させたDLD・1

細胞に、

KHYG・1

網

11

胞を加え、位相差顕微鏡で観

察した。

図

1

上段時系列写兵に示すように、

KHYG・1

細胞は突起を出したり、細胞形態を

変えながら活発に遊走

し、

DLD・1

細胞に接近、

接触

し、その後数分で

DLD・1

網

11

胞の網

11

胞肢を穿孔した。その時、図

1

下段拡大写真に示すように、若手孔した梨

11

胞からの細胞内液の流出が確認された。

00 1.0

IIl:J OLO‑1

0.81~ KHYG・

1

園共 1 音益

0.6

0.4 0.2

逸鋭

LDM

活性

KHYG‑l

細胞による

DLD‑l

細胞傷害性の経時的定量評価

紺￨胞

l

民若手孔により細胞内

li

主が流出する結来、

翁11

胞内放に含まれる

LDH

が細胞外に逸脱すると考えられるため、培養液中の

LDH活性を経

時的に測定した。医

12

に示すように、

3

時間以後、

LDH

活性

の上昇すなわち細胞肢の悔害

が始まっていることが明らかとなった。 2 4 h r

健12 J

氏地

':1"

の

LDH

活性他の

4ffω移。KHYG‑l

細胞、

DLD・1

細胞、およびそれら

2

舗の共培必

l

時の、

各培養

l

時

1111

における核地中の

LDH

活性を示

す。

共jr..~ によりJi';・養液中の LDH 活性は m 加l

し、 6

1

1.¥'1111

経過以降前j f l 白を持続する。械事

I1

は、

J

持従

H在11

日

。

縦軸

はLDH

活性

(1

汲光度

OD)。

6 h r 1 2 h r

t音奏時間 3hr

。

KHYG・1

細胞数と

DLD‑l

細胞生存数の

￨

則係

KHYG‑1

細胞に攻怒された

DLD・1

細胞の

24 1

時間後の残存生存数を、

CCK・8

キットで評価

した。図

3

に示すように、攻蚊される

DLD・1

細胞

(Target)

に対し、加えた

KHYG・1

細胞

(5)

共立 !l:. f大学家政学部紀.~ 宮~

61:J (2015)

% 100

nu

wn

u

川山川

e o a u a

制

細胞生存市中

20 。

C 1:8 1:4 1:2 1:1 2:1

百

T

比

凶

3 DLD‑l

細胞数に対する:fI街した

KHYG・1

細胞訟の比

(Err

比)と、

DLD・1

細胞の生作数の関係。

悶iY

G

・

1

細胞と

DLD・1

総胞を共続長し、

24

時

1111

後、

KHYG・1

細胞を除去し、

l

ま而に

1・Jli

している

DLD‑l

細胞の伎作数を

CCK・8

アッセイで測定した。繍輸は、

E/T

比 :

KHYG‑l

絢

l

胞数と

DLD・l

細胞慾

(effector/ target)

の比、縦軸は対 ! ! 日

(KHYG

・

1

調I J 胞を加えない)に対する生イ

f

細胞数の比

(%)0C:

対 ! ! 日。

(Effeclor)が多

いほど、すなわち、

E/T比が

大きいほど、残存生イが紛

l

胞数は減少した。

KHYG‑l

細胞培益法'1

¹

の

INF‑y

のW

/}JII

陪fY

G‑l細胞と DLD

・

1

細胞を

6

時間共培

f1'i5

した後の収益法巾に、

92pg/ml

の

INF‑yが定

i

止された。KHYG ・

1

制胞、

DLD‑l

綱

IIJJ

包それぞれ単独府長でのよ奇必

i&ql

の

INF‑yはいずれも 4pg/ml

未満であった。

KHYG

・

l

細胞のグランザイム

B

およびパーフォリン遺伝子の発現

￨

災15

に

RT

・

PCR

の結栄を示す。GAPD

Hの発

現を対J!日として評価したとき、グランザイム

B

、

ノ

t

ーフォリンとも、

DLD

・

1

剥￨胞との共土常設前に比べ、

j

じ収益

6JIキ11111:変に発現がIYJ

らかに

l

約百l した

。

特にパーフォリンは、共椛~ljíJ はほとんど検出できなかったものが、共収

f1

'i5後、発現

カ{IYJ

らかにな

った。

pglml 100

80

〉・

E 60

40 20

。

DLD‑1 KHYG

・

1

共 I 音養

￨

提1

4 l"'tft

i ! 主 " ，の

IFN‑y iiio DLD・1

細胞、

KHYG・1

細胞、およびそれら 2 般の J~J，'f~時の、 6

".111

日後のJ

，flfi:

液中の

IFN‑y

{ 直を示す。

I JtJft

fi:により、

Jff;

j

削除l'

の

IFN‑y

が者f1

YI

に l ! ' l ) J I I した。

4.

考察

NK

網"胞は、向然免疫系で機能するリンパ球のひとつで、腕鋭利

l

胞やウイ

J

レス感染細胞を殺 {却する能)

J

を持つ。ヒトの細胞内では常に

iMl:

般泌が生成されており、泣伝子

D N A

をはじめ純々の生体分 f に傷害を与えている。このような前性酸謀・をはじめ、制々の環境因子が

DNA

の変興を芯起するため、捕鶏1

1

胞が体内に/11

m

す

ることは不

I I f 避とされる。しかし

N K

細胞が舵悦し、体内に生まれた異常利￨胞を早期j に排除するため、臨床的な婚の発症が抑制されていると

45

・えられている。以・近では、

N K翁11

胞の桶細胞殺防効*を、術治療に応用する試みも行われているが、現状では確立された治療法とは汀い錐い則。

従来、ヒト

N K

網

n

胞を研究する時は、ヒト水制

JlI

l から

N K

細胞を採取するが、実験のたびに数卜

ml

の探

rILl

を行うのは、供

Ifll

者の負担が大

きい。そこで、もしNK

細胞の性質を持つ網1

1

胞妹があれば、研究室で無限に明やすことが

IIr

能

なため、非常にイ

i f f l であ

る。KHYG‑l

細胞は、

ナチュラルキラー細胞が服務化した白血病息.r.‑ーから符られた制胞株で、ナチュラルキラー網1

1

胞の形質を保・持しているとされる

9)。

また、

KHYG

・

1

網"胞は、

K562

細胞や白血病細胞に対

‑112‑

(6)

続発細胞を

111

いたナチユラルキラー細胞の

J

応大Jl刷

Ih

モデルのイ午製

する殺俗学1:を示し、

NK

細胞のモデルとして有用であることも示されているへ

従来

NK

細胞の活性を評価

il

する研究においては、

NK

細胞に対する感受性が高いことが知られる白 J f l L病山来の K 5 6 2細胞を標的調

11

胞とすることが多い。今回の研究では、

NK

網

11

胞の標的として日本で州民

11

位別の死因で上位

(!)Jtl:

では

JIM

摘、¥'/

Nti

に次いで

3

位、女性では

l

位、男女あわせて

3

位 : 2012年厚生労働符人口動態統計)を占める大脇痛を選択した。大腸州細胞株

DLD‑l

は、結米で示すように

I

倒

YG‑l

細胞に感受性が向く、好適なモデルを作成することができた。

また、経

11

占的な顕微鏡搬

i35

を行うに際し、f，f(

的細胞が収益プレートの底而に付治している必要があり、

DLD

・

1

細胞は有

JTJ

であった。国

1

に示すように、

NK紺l

胞の活発な形態変化、遊定能、さらに鋪綱

11)

抱!肢の穿孔を観察できることは、学生尖験等にふさわしい。

細胞

l

供

ZF

^{孔による網}

11

胞内波の流

/1¥

は、細胞内酵素の逸脱をきたすが、今回の実験でJff; 1\~液 rl' の

LDH

活性の経時的な上昇が倣:認された。従来、翁

11)

抱伽寄J:E

i，l

実験は、放射性阿佐元主主 ‑ のクロム 5 1をあらかじめ細胞に取り込ませ、制胞が悔害されて細胞外に逸脱したクロム 5 1の放射能を計測する方法が主流であるが、肱射性同位元素のJ 収り扱いは厳重な管理が可能な施設に限られるなど制約が多い。今回は、細胞に内在する

LDH

のi J !

l

仏

E

により細胞働省尖験が可能であることが雌認された。

傷害された舗網

II

Jl包は死滅し生存網

11

胞数が減少するが、今回の実験で、その定祉を CCK‑ 8キットで施行できることが示された。標的調

11

胞として付着性の

DLD‑l

翁

11

胞を使ったのは、

NK

細胞との共府必後も、生存桶細胞が収益プレー

トの I!.~而に強く付才t していることに消 1::1 したた

めである

。J~:Í'，"'，:後 241時間後、府益法を取り除

き

、

プレ

ー

ト底而を戦くピペッティングし、

Hli:

した

KHYG

・

1

網

11

胞を取り除き、生存

DLD‑l

網

11

胞のみを践し、その数を CC K‑ 8キツトで則!

i

測 J ! I I I リ定し

た。図

3

では、初期の

DLD

・

1

細胞数に対する加えた

KHYG

・

1

剥

11

胞数の比

(Effector/Target; E/T

比)と生存

DLD

・

1

細胞の￨刈係を示したが、

E/T

比

1:8

で生存付着細胞数が半減している

。

生存していても付新能が低下した嫡調

IIJI

包も取り除かれて過大評価される可能性があるものの、

細胞伽症の

J

百年目として利用できると思われる

。 NK

細胞機能のひとつにサイトカインの

1

つインターフエロン・ガンマ(I

NF

・

y )

の産生、

分泌が知られているため、その定

i

止を

ELISA

法で行った。

KHYG

・

1

細胞と

DLD

・

1

網

11

胞のそれぞれ郎副! での府養および共培養をおこない

6

H 寺間後の収地

rl‑'

の

INF‑y

を、図 4に示した

o

KHYG

・

1

網

11

胞単独では

INF‑y

の分泌はわずかであり、

DLD‑l

細胞との共培養による刺激で

INF‑y

が多町

ilt

に産:.t分泌されたと考えられる

。

l

さ

11に

、

KHYG

・

1

細胞が

DLD‑l

細胞の潟

11

胞

!院を穿孔することが示されたが、

NK

細胞が繍殺

11

胞を攻! 壊する際、パーフォリンとグランザイム

B

を産生し、前者が細胞!肢を穿孔し、後者

pre post

M G gr pf G gr pf

bp

1000 500

I S I 5 悶

NG・1

調

11

胞のグランザイム B 、パーフォリン

遺伝

f

発説。RT・PCR法によりj抑制したDNA断 )，‑のアガロースゲルHt50‑U

永

，[VJf象。JlJ;H:iliil

の

KHYG・1

調 :

111

胞では、グランザイム

B

の発現世は

対Jt日のGAPDHより低く、パーフオリンの発現は

検

11¥できない。DLD‑l

調

11

胞との

RJ

庁長

611.¥'11

日後

では、グランザイムB、

パ

ーフォリンとも GAPDH

に l 匹敵する発

JJLを必める。M:

.

分

f ‑

l，t

マ

ーカ一、 G:GAPDH、

g

r:グラン‑+f

イム

B、

pf:

パーフォリン、 pre: 共j;~~t lÌíI 、 pOSI

: jtJe

; i

1t 6 I

I，¥，後、

bp:

J孟J

/ . i 対数。

(7)

共立女子大学家政学部紀要第 6 1 号 ( 2 0 1 5 )

を癌細胞内に注入して癌細胞にアポトーシスを引き起こすことが知られている

ω

へそこで、

この

2

つの遺伝子の発現を

RT‑PCR

により検討した。共培養前の

KHYG・1

細胞および、

DLD・1

細胞との共培養

6

時間後に回収した

KHYG‑1

細胞から

RNA

を抽出し、

RT‑PCR

を行った。対照となるハウスキーピング遺伝子の

GAPDH

と比較した場合、パーフォリン、グランザイム

B

とも共培養により発現が増加した o

特にパーフォリンは、共培養前は発現がほとんど検出できなかった。前項の

INF‑

i ' と同様に、

パーフォリンやグランザイム

Bは

、

DLD・1

細胞との共培養地吻

l

激となり発現が増強することが示された。なお、

PCR

産物の電気泳動後の可視化に際し、従来より、臭化エチジウムを

DNA

にインターカレーションさせ、紫外線で励起し発生する蛍光を観察する方法が一般的であるが、臭化エチジウムは強い変異原性が知られている。今回は、安全性の高い

DNA

蛍光染色試薬を用い、青色

LED

で励起し蛍光を発生させる方法を採用し、その実用性が確認された。

臭化エチジウムや紫外線の使用を避けること等で実験環境の安全性を向上することは、学生実験を企画する上で重要な要素であると考えられ

る。

5.

結び

NK

細胞の大腸癌細胞攻撃モデルを

KHYG^・1

細胞およぴ

DLD・1

細胞を用いて作成した。このモデルにおいて、細胞膜穿孔の瞬間の顕微鏡写真撮影、

LDH

逸脱法による細胞傷害試験、

WST‑8

試薬による細胞生存試験、

ELISA

法による培養液中の

INF‑

i ' 定量、

RT・PCR

によるグランザイム B、パーフォリン遺伝子の発現実験が従来法に比べ安全かつ容易に実施され、明瞭な結果が示された。この実験系は、食品成分の

NK

細胞機能に与える効果の評価をはじめと

する

NK

細胞の抗癌活性の検討に関わる実験に広く活用されるものと思われる。

文献

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6) J. Wei， S. Bhatt， L. M. Chang， H. A. Sampson and M. Mas1iamani: P

Lo

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7) S. Rozen and H. J. Skaletsky:

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J. Biomed. Biotechnol.， 2011， 676198 α011)

9) M. Yagita， C. L M， Huang， H. Umehara， Y. Matsuo， R. Tabata， M. Miyake， Y. Konaka and K Takatsuki: Leukemia， 14， 922α000)

10) G. Suck， D. R Branch， MJ. Sm同1，RG.

Miller， J. Vergidis， S. Fahim and A. Kea

曲1

9:D.ψ.Hematol.， 33， 11ω(2005) 11) M. F. van den Broek and H. Hengar佃er:

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12) S. P. Cullen， M. Brunet and S. J. M

紅白

1:

Cell Death D

的批，

17

，

616 (2010)

‑114

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌 モデルの作製

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌 モデルの作製

著者名(日) 吉浦 健太

雑誌名 共立女子大学家政学部紀要

巻 61

ページ 109‑114

発行年 2015‑01

URL http://id.nii.ac.jp/1087/00003005/

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http://creativecommons.org/licenses/by‑nc‑nd/3.0/deed.ja

共立女子大学家政学部紀要 第

号

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の 抗大腸癌モデルの作製

廿

泊 出

吉浦健太

1 .はじめに

細胞をはじめとする免疫系が異常細胞を 捉えて殺傷することにより、臨床的な痛の発症 を抑えていると考えられている幻にさらに今 日では、

細胞の活性を上げることが抗癌戦 略として重要であるとの認識から、

家政学部食物栄養学科

要な固形癌の一つである大腸癌を対象とし、

細胞が癌細胞を攻撃する様子を顕微鏡下で リアルタイムに観察するとともに、定量的な癌 細胞殺傷効果およびサイトカインの測定や

による遺伝子発現を含む

細胞機能 の測定を含めた

モデルを作成した。

材料と方法 細胞株および培養法

細胞として

(独立行政法人医薬 基盤研究所

細胞パンク)、および大腸癌 細胞

(東北大学加齢医学研究所医用細 胞資源センター)を用いた。基本培養液は、

(シグマ)に、

牛胎児血清

、 ペニシリン

l ) /ストレプトマイシン

l ) (ライフテクノロジー)を添加し たものとした。細胞は、 5 %二酸化炭素含有

恒温楢で培養した。

培養細胞の顕微鏡観察および経時的撮影

細胞を基本培養液に懸濁し、

穴プ

レートに、ウェルあたり

個を播種し、一夜

培養し、プレート底面に付着させた。

細胞は、基本培養液に

ヒトリコンビ

共立女子大学家政学部紀要 第

号

表

各遺伝子のプライマー塩基配列および

産物長

遺伝子(産物長} 位置

同 左

グランザイム

左

パーフォリン

左

ナ ン ト イ ン タ ー ロ イ キ ン

2

を添加したもので培養し、

・

細胞が付着したプレートに、ウェルあたり

個を加えた。位相差顕微鏡により、

・

細胞が

・

細胞を攻撃する様子を観察し継 時的に撮影した。

乳酸脱水素酵素

前項と同様に、

・

細胞(ウェルあたり

個)を

穴 プ レ ー ト で 培 養 後 、 同 数 の KHYG ・ 1細胞を添加し、その後、継時的に培 養上清を採取し、培養上清中の

の活性を、

細胞傷害性検出キット

(ロシュアプ ライドサイエンス)で測定した。具体的には、

キット中の試薬が培養上清中の

により還 元されて生じたホルマザンの吸光度

をマイクロプレートリーダー(クロメート・

マイクロテック)で測定した。

生存細胞数の検定

前項と同様に、

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌モデルの作製

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌モデルの作製

著者名(日) 吉浦健太

雑誌名共立女子大学家政学部紀要

共立女子大学家政学部紀要第

培養細胞を用いたナチュラルキラー細胞の抗大腸癌モデルの作製

泊出

細胞をはじめとする免疫系が異常細胞を捉えて殺傷することにより、臨床的な痛の発症を抑えていると考えられている幻にさらに今日では、

細胞の活性を上げることが抗癌戦略として重要であるとの認識から、

細胞が癌細胞を攻撃する様子を顕微鏡下でリアルタイムに観察するとともに、定量的な癌細胞殺傷効果およびサイトカインの測定や

細胞機能の測定を含めた

材料と方法細胞株および培養法

(独立行政法人医薬基盤研究所

細胞パンク)、および大腸癌細胞

(東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター)を用いた。基本培養液は、

、ペニシリン

l ) (ライフテクノロジー)を添加したものとした。細胞は、 5 %二酸化炭素含有

共立女子大学家政学部紀要第

同左

ナントインターロイキン

細胞を攻撃する様子を観察し継時的に撮影した。

穴プレートで培養後、同数の KHYG ・ 1細胞を添加し、その後、継時的に培養上清を採取し、培養上清中の

(ロシュアプライドサイエンス)で測定した。具体的には、

により還元されて生じたホルマザンの吸光度

細胞をウェルあたり

個培養した後、種々の細胞数の阻iYG‑

で洗浄し、プレートの底面に付着した生存細胞数を、

個培養し付着させた後、同数の

キット

)1を測定した。具体的には、キット中のキャプチャー抗体を結合したプレートに検体を入れ

で一夜インキュベートした。補足された

) 1 に、

二次抗体を結合させた後

、パーフォリン、対照としてグリセルアルデヒド ‑ 3 ・リン酸デヒドロゲナーゼ

を施行した。プライマーは、遺伝子配列データペース

へおよび

I)を利用して設計した。配列および

デイシュに一夜培養し接着させた上に、阻iYG‑

胞の抗大

胞を回収した。細胞の