香川大学農学部紀要 第51号 1∼73，1987
大豆の小糖類の加水分解に関する研究
Studies on the Hydrolysis of Olig・OSaCCharides of Soybeans
TadasiKASAI
目 次 4 5 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 8 9 9 9 9 9 9 9 9 0 0 0 0 1 1 2 3 4 4 4 4 4 5 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 緒 論 第1章 大豆少糖類の確認 11 実験方法 111 試料および糖炉の抽出 11．2 か−ボンカラムクロマトグラフィーによる糖類の分離 113 ゲル濾過によるスタキオ・「スの単離 1．14 単離糖類のアセチル化 12実験結果 1“2。1 カーポソカラムクロマトグラフィーー 122 セファデックスG−15カラムクP、マトグラフィー 123 糖のアセチル化 124 融点および比旋光度 13 考 察 1。4 要 約 第2章 各種豆類の少糖類 21 実験方法 2．11 試料 212 一・般分析 21“3 遊離糖 214 デソプソ 215 ペクチン質とへミセルロ・−ス 216 セルロース 217 少糖類 22 実験結果 221−・般分析，炭水化物 22，2 各種豆類の少糖類の 23 考 察 24 要 約 第3牽 腸内微生物による加水分解 31 実験方法 311 励cゐer・ic九iα COヱi 312 五種類の培地での培養 3．1．3 大豆抽出糖液を含む培 3−1．4 各種糖標晶を単独に含 315 大豆抽出糖液を含む培地での培養による有機酸（糖）の生成 32 実験結果および考察ー2− 321各種培地での培 17 17 19 24 28 28 28 28 29 31 32 32 34 38 41 43 45 46 47 47 47 48 48 50 51 52 52 52 52 52 53 53 53 53 53 55 55 56 56 56 56 56 57 57 57 58 58 58 59 322 大豆抽出糖液を含む培地での培養による20菌株の比較 323 各種糖標晶を単独に含む培地での培養 324 大豆抽出糖液を含む培地での培養による有機酸（糖）の生成 33 要 約 第4章 腸内微生物のα−ガラクトシダーゼ 41 実験方法 411風coZi4株の細胞外および細胞内α−ガラクトシダ1一ゼ作用
412 E．colisubsp．．communiorIAM1272（No、13）のα−ガラクナシダl−ゼの精製と性質
413 且cog孟以外の二三の他の腸内細菌のα−ガラクトシダ・−ゼ作用 42 実験結果 421且coむ4株の細胞外および細胞内α一ガラクトシ・−ゼ作用 42”2 E．colisubsp．．comTnuniorIAM1272のα，ガラクトシダ1−ゼの精製と性質 423 且cogi以外の二三の他の腸内細菌のα−ガラクトシダ・−ゼ作用 424 （付）ねずみ小腸のα−ガラク十シダ・一ゼ 43 考 察 44 要 約 第5章 腸内微生物のβ−フルクトシダーゼ 51 実験方法 511 ショ糖を含む培地に培養したときの且coZ孟β−フルクトシダ・−ゼ活性 512 異なった糖を含む培地に培養したときのβ−フルクーシダ・−ゼ活性 52 実験結果 5−21 ショ糖を含む培地に培養したときの且cog￡のβ−フルクトシダーゼ活性 5−22 異なった糖を含む培地に培養したときの酵素病性 53 考 察 5。4 要 約 弟6章 胃酸に相当するpHにおける少糖類の加水分解 61 実験方法 611 試料と加水分解の条件 612 加水分解率の測定 613 ペーパークロマトクラフィー 62 実験結果 621 加水分解物の還元糖の測定 6．22 加水分解物のペーパー クロマトグラフィ・− 623 混合糖液の還元糖の測定と遊離フルクトース割合の算出 63 考 察 64 要 約 第7牽 加熱による大豆少糖業頁の変化 71 実験方法 7．11 試料および加熱条件 712 糖の抽出と定量 713 有効性リジンの定義 71。4 白虔の測定 7．2 実験結果 7−21 糖類の変化 722 有効性リジソ723 白 度
73 考 察 74 要 約−3− 第8章 大豆の発芽にともなう少糖類の分解 81 実験方法 811大豆の発芽 8−12 糖類，酵素の抽出 813一 ペーパークロマトグラフィーによる糖類の検出 81−4 ガスクロマトグラフィ・→による糖類の 815 α−ガラクトシダーゼ活性の測定 82 実験結果 821 発芽中の糖類の検出 822 発芽による少糖額の変化 823 発芽時のα−ガラクトシダーゼ活性 83 考 察 84 要 約 総 括 引用文献 英文要約 本論文では場合によっては次の略語を用いた Fru：フルクトース Gal：ガラクーース GIc：グルコース Mal：マルトース Mei：メリビオ・−ス Mtr：マンニノトリオ・−ス PNPGまたはα−PNPG：P−ニトロフエ．ニルーα−D−ガラクトピラノシド β−PNPG：p−ニトロフェニルーβ−D−ガラクトピラノシド Rar：ラフィノース Sta：スタキオース Suc：ショ糖 Ver：ベルパスコ・−ス CPG：リソ酸カルシウムゲル PPC：ぺ−パ・−クロマトグラフィー TMS：トリメチルツリル
−4− 大豆は食用豆類の中でもタソ／くク質源，脂質源として重要であり，これらの成分忙ついてはよく研究されてい るが，含量的にも少なくない糖質に関する研究は比較的少ない… 大豆には少糖類が約10％含まれているが，1950年ころまで米国の学者（1，2）はショ糖とラフィノ・−スとの定量値 を挙げ，日本の学者（3，4）は・ンヨ糖とスタキオ・−スのみを挙げていた…これほインベルクーゼやェムルシソでの加 水分解，あるいは硝酸酸化で粘液酸を生成するガラクトースからそれぞれラフィノ・−スあるいはスタキオースと 仮定した定量であった‖その後ペ・−パ・− クロマトグラフィ・−で分別定盈が容易に行えるようになり，この方法で 大豆の少糖顆を分別定量したのは川村（5）（1954）が最初でショ糖3．7％，ラフィノース1．0％，スタキか−・ス3．2％ としている．その後川村ら（6）はさらに詳細鑑定畳し，品種によって相当の幅があり，丸大豆の測定値はアラピノ ース：こん跡∼0一．006（平均0．．002）％，フルクトース：0∼0．1（こん跡）％，グルコース：0・002∼0・30（0い03）％， ショ糖：3．4∼6．5（4．6）％，ラフィノース：0．．6∼1．．5（1．1）％，スタキオース：2．6∼5．2（3．8）‰ べ／レバスコ・−ス ：0∼こん跡（こん跡）であると報告している． このような少糖炉はFig．0−1に示すような構造でラフィノース，スタキオーース，ベルパスコースなどは，それ ぞれモノ・−，ジ・−，トリガラクトシルサッカP・−スであるい ガラクトシルサッカ自・−スからフルクトースがとれ た還元性少糖類であるメリビオ1・・・・・ス，マンニノトリか−ス，ベルパスコテトラフトースなどは自然界に・は存在しな いようであるが，ラフィノt・・】・スやスタキオ−スのような非還元性のガラクトシルサッカロ・−スは食用の豆額（7∼9） だけでなく多くの野性のマメ科植物その他の種子にもみられる（10∼12）．． erb（】SCO†e†「（コOSe の名こ雲U8の0署O P−ちコP￠∝ 0†「■iose Meしibiose H OH ゆ名−L苫00Pの○署○ ぎちコP巴uON
Fig。0−1Structures of oligosaccharides soybean．
このような少糖類のヒトによる消化について考えるとき，ショ糖そのものは消化酵素インベルク・−ゼで加水分 解されるとしても，α−ガラクトシド結合をもつラフィノースやスタキオ・一スは分解されるであろうか…高等動 物の消化系にはこのα−ガラクトシドを水解するα−ガラクトシダ1−ゼは存在しないか（13），あるいは存在して
ー5− れば動物の消化系のインベルク・−ゼはβ−フルクトシダ・−ゼとしてよりもむしろα−グルコシダ1−ゼとして働く としている（17）．ラフィノ、・−・・スやスタキオース分子はショ糖残基をもつが，この残基のグルコ・−ス側はガラクト ースが結合しているので上記のようなインベルク叫ゼではこのショ糖残基に対してほとんど作用しないものと考 えられる．．BierⅠ・y（18）ほ哺乳動物のイソベルク・−ゼはラフィノ1・・・・■スやスタキオースにほ作用しないとしている・ またClark（19）もメリビオースとラフィノ1−スには作用しなかったとしている・このように消化酵素系からみれほ 大豆のガラクトシルサッカロースは全く加水分解を受けず消化されないことになる」しかし腸内には微生物が存 在するのでこれらの影響が考え．られる．書田ら（20）は大豆の少糖煩をネズミに与えた場合ほとんど排出されず利 用され，またこれが抗生物質の使用で影響されることから腸内微生物による消化が考えられるとしている・・
また胃液は強酸性であり（21），ショ糖のようなフルクトシドは酸により比較的容易に加水分解される（22）こと
からシ。糖残基のある大豆の少糖類も多少は腸内において加水分解されるものと考えられる‖ −・方大豆は加工や調理で加熱されるがこのとき褐変する‖この一周としてアミ／カルポニル（Maillard）反応 があり，遊離の単糖塀をはとんど含まない大豆ではカルポニル基の材料として少糖類の加熱による加水分解が考 えられるまた大豆はモヤシとして食用とされるが発芽によって少糖類，特にガラクナシルサッカP・−スが急速 に減少消失する（23∼27）ことが知られている． 本論文は，このような大豆の少糖類の消化利用の見地から，その加水分解に関連した研究を行ったもので，す でに発表した報告を中心に一・部未発表の成蔚を加えてとりまとめたものである・ 本研究を行うにあたりご指導と激励を頂きました香川大学名誉教授川村信一・郎博士，および本論文をまとめる にあたり終始御懇篤な御指導と御校閲を賜わりました日本大学教授石井謙二博士，同丸尾文治博士，同白井和娘 博士に深甚の謝意を表します…また研究の途上種々の御教示と御援助を頂きました香川大学教授鈴木裕博士，徳 島文理大学田主澄三助教授に厚く御礼申し上げます第1章 大豆少糖類の確認（28）
大豆の少糖類，シ。糖，ラフィノース，スタキオースについて，そのアセチル化物の融点，比旋光度の測定に ょる同定が川村らによって報告されている（2叶しかしこのうちスタキか一ステトラアセテ・−トはなお不純のよ うであり，その測定値は文献値（30）と大きな差がある日そこで再度これらの少糖類を遊離物およびアセチル化物 として確認を行った 1・1 実験方法 1・1・1 試料および糖類の抽出 試料としての大豆（G抄cわe mα方）ほ米国南部地方の代表的品種Hampton（1962年度産）のヘキサソにより エ業的に脱脂した・7レ‥−クを用いた．実験には脱脂フレークそのままと，脱脂フレークを水分含羞20％にしてか ら120℃，10分間オートクレープで加熱したものとについて行った．． 糖類の抽出は脱脂フレークそのまま，あるいは加熱したもの30gを80％ユタノ・・−−・ル250m′と共に・ミキサーにて 摩砕し，80％エタノール50mいにてフラスコに洗い込み，1時間加熱還流する．遠沈後，残漆を蒸溜水でよく洗 う．ユタノ・−ル抽出液および水洗液は減圧濃縮でアルコ・−ルを除き，飽和酢酸鉛溶液を加えて除タン／くクする・・ 過剰の鉛イオンは2Ⅳ炭酸ナトリウムを加えて除きpIi6小8に調製して，ロータリエバポレ・一夕にて40℃以下でー6一 約100m掃こ濃縮するいこの濃縮液ほイオン交換樹脂アンバライトIRC−50とIR−45（1‥1）を詰めたカラム（￠
30×450mm）に通して脱塩した小カラム流出液と洗液は再び濃縮し約15mZとし，抽出糖液として−20℃に貯蔵し
て次の実験に使用した．ゲル墟過によるスタキオースの分離については別に抽出糖液を調製したい 1・1・2 カーボンカラムクロマトゲラフイ・一による糖類の分離 W。1from（31），川村ら（29）の方法により，ダルコ（Darco）G−60とセライト（Celite）545の120gザつを50％ ユタノ・−ル300mgでよく混合して充填したカラム（￠36×45伽m）をさらに50％エ・クノールと次に蒸溜水を通し てよく洗う‖このカラムに抽出糖液10Ⅰ畑を加え，フラクショソコレクターを装備して蒸溜水，4，8，15，30％エタノールで順次溶出させる．各フラクショソほ20mげつとり，その1m‖こついてフェノー′レ硫酸法（32）に・
て糖を定量したい糖を含むフラクシ。ソはさらにべ・−パー クロマトグラフィー（展開溶媒：n−ブタノ・一ルービ リジンー水（6：4：3），3％塩酸／くラアニシジンの水飽和ブタノール液にて加熱発色）により糖頬を検出したり 同じ単一の糖を含むフラクショソを集め，減圧濃縮し，95％ユタノ・−ル溶液から結晶させた巾また−㈲ま真空乾 燥して無水粉末としてからアセチル化した， 1・1・3 ゲル濾過によるスタキオースの単離 スタキオースの嘩離のため大農の抽出糖液を調整し，大型カラムを特製■して使用した．脱脂大豆フレ・−クは粉 砕機で32メッツシヱ．に粉砕したものを用いた‖この脱脂大豆粉500gを80％ユタノ・−ル2gで3回還流抽出し，残壇 を蒸溜水1gで洗浄する−エタノール抽出液，洗浄液をさきの1・11と同じ方法で除タン／くクして濃縮したが脱 塩は行わず100m∼に濃縮してフリーザt一に貯蔵した Fig∴1−1に示すようにセファデックスG−15のカラムを準備し，抽出液の分離を繰り返し行った・この操作を 詳しく説明する‖ 底部を細くし（1）活栓（3）をつけたガラス管（￠30×2000mm）（2虹セフ ・7デックスG−15350g・（幹燥重畳）を充填し，フラクショソコレクタ ー（4）に接続するり カラム上端より下の位置に活栓（7）を有するガラス 管でサイホン（6）により接続した流出用の蒸溜水を入れた2Jのフラ スコ（5）がある… カラム管の上端にはゴム栓に，さきのサイホンとは 別に2本のガラス管を装置するり この2本のガラス管のうちピンチ コック（8）のついた1つは試料糖液の注入口とし，他の活栓（9）のつい た1つは空気調節用とする… カラム（2）は蒸溜水を流出してよく洗い， フェノ・−ルー」硫酸法で糖の流出されないことを確かめる‖ フラクシ ョソコレクタ1一には6mJずつ集め，流出速度は50mg／時間とし 24時間にコレクター試験管200本，全体で6×200＝1200mg となる ように活栓（3）で調節する．カラムの流出を続けながら（活栓（3）は動 かさない）カラム上端のサイホン活栓（7）を閉じ空気栓（9）を開き水面 がカラム上端セフ・7デックス床上面まで下ったとき，すばやくピソ チコック（8）のあるゴム管㈹からピペットで抽出糖液5m㌃を加える．． 注入糖液がカラム上端に広がったとき，空気栓（9）を閉じ，同時にコ レクターの採集を開始するい ピペットの試料糖液はカラムの流出に Fig…1−1Appar・atuSforg−elfiltration （See thetextforexplana− tion）．．−7− よって注入される．試料糖液の全盛（5mg）の注入が終われはすはやく空気栓（9）を開き，試料注入口（1助から蒸溜 水約5mgを注入する‖水面がカラム上端1：．5∼2小Ocmになれは空気栓（9），試料注入口ヒソチコック（8）を閉じ！サ イホソ栓（7）を開く．約1，100mJの流出で糖の全溶出が終わるので2回目の分離を同じ方法で試料注入から始め る−このときフラクショソコレクタ・−は1回目の分離の開始位置と同じ位掛こて開始する・・各フラクションは先 のカーボンカラムの場合（1．1…2）と同じ方法で糖類を検出し，特にスタキオース区分を集めた‖試料糖液は脱 塩していないので流出液の塩類の検出は電気抵抗によった… 1・1・4 単離糖類のアセチル化 糖のアセチル化反応ほ酢酸ナトリウムを触媒として行った（33）一10部の糖に5部の酢酸ナトリウムと70部の無 水酢酸を加えてオイルバス（120∼1300c）で10∼14分間加熱還流した… これを500部の氷水中に注ぎ，ときどき 撹押して冷蔵庫内に4時間放置した小傾潟法にて水を除き新たに氷水500部を加えシロップ状の半固形物を砕邑 冷蔵庫内にさらに2時間置く．この操作を2∼3回線り返した後，固形物を墟別，水洗してから50部の95％エタ ノールに加温溶解する．結晶させるため室温，さらに冷蔵庫内に置く‖結晶を波別し再び95％エタノールに溶か して再結晶させる。この結晶化を3回行って減圧乾燥（30℃）し，融点および旋光度を測定した 1■ 2 実験結果 1・2・1 カーボンカラムクロマトグラフィー 糖の溶出ほFig〃1−2 のようになった…ユタノ・−・ル濃 度を変えたとき急に糖が溶出し，4％エタノール溶出の 初めの2g（溶出畳2．．4∼4．2g）と8％ユタノ、−ル溶出の 初めの400mg（溶出義7小0∼7．4g）はそれぞれショ糖と ラフィノ1−スに相当し純粋であった．．これらは濃縮乾固 し，ユタノ・−ルから結晶させた．．15％ユタノ・−ル溶出の 初めの部分はスタキオースが小農混入していたv l・2・2 セファデックスG−15カラムクロマト グラフィー 糖溶出の結果をFig＼．1−3に示す．流出量850∼930mg の区分は電気抵抗7∼8kn／cmを示し，この区分に塩類 が存在すると思われた…流出盈6∼690mgおよび1080∼ 1200m∼区分の電気抵抗は200kn／cmでこれは脱塩水と同 じであり，この区分には塩焼がほとんど含まれていない ものとした巾 このカラムで流出分離操作は24時間毎に繰 り返し連続して行い，2回目，5回目，15回目について ペーパークロマトグラフィ・−・で調べた結果は同じであっ た．流出孟640∼700mg区分（Fig〃1−3の←M→）は再 分離した．．流出量550∼630mg区分（Fig．．1−3の←S→） はペーパ、−クロマトグラフィ1−でスタキオースに相当す るスポットのみで他の糖はみられなかった．この区分を 【†OHCon亡h●・・・・・■≠・・−−−−−−‥引トー・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・一●−8★−→●−t5事−−一−さ0★−
Fig．．1−2 Separationof olig・OSaCCharides from defatted soybean mealby carbon COlumn chromatogrIaphy．
uO⋮■D土TuむOUOOむ＞写口一ひ∝
500600700800900
Ⅰ←づ−LM→IE†fLuen†voLume（ml）
400
Fig。1−3 Separation of oligOSaCCharides from defattedsoybeanmealbygelfiltration．． S：pureStaChyosefractionsり
M：fr・aCtions of mixture consisting of StaChyose，raffinose，and sucrose．，
−8− 集め濃縮乾固し，エタノールから結晶させた． 1・2・3 糖のアセテル化 カーボンカラムクロマトグラフィーで単離したショ糖（1．．Og）およびラフィノース（089g）をアセチル化してそ れぞれ1い5gのアセチル化ショ糖および1．2gのアセチル化ラフィノ・−スの結晶を得た‖しかしスタキか−ス（0・42g， 痕跡のラフィノースを含む）のアセチル化物については結晶が得られなかった（沈澱物として白色粉末を得た） ゲル渡過で単離したスタキオースの大畠（6g）をアセチル化したがやはり結晶しなかった 小男（30）も結晶でき なかったと報告しているこの沈澱物を95％エタノールに加熱溶解，冷却沈澱させ遠沈分離したこの操作を融 点が上昇しなくなるまで繰り返した（7回） 1・2・4 融点および比旋光度 脱脂大豆フレークそのままとオ・−トクレブにて加熱したものから単離した糖塀についての測定値ほ同じであっ た．ここで単離した糖類の無水物およびアセチル化物の融点，比旋光度の測定値を文献値とともにTablel−1お よびTablel−2に示す Tablel−1Themeltingpointandspecificrotationofthefree，anhydroussugar・S fromraworautoclavedsoybeanflakes mりp 〔−α〕D
Sugar Found Literature Found Literature
Sucrose 176−1800 184−1850（34） 十66．．70／240（H20） ＋66．50（H20）（34） Ra董finose l18−1200 118−1200（35） ＋123．40／200（H20） ＋123．10（H20）（35） Stachyose 170−1720 1700（30） 十146．2や／200（H20） ＋146．30（H20）（30）
Tablel・−2 ThemeltingpointandspecificrotationoftheacetatesofsugarSfrom
raworautoclavedsoybeanflakes m．p． 〔α〕DAcetate Found Literature Found Literatur・e
Sucroseoctaacetate 870 870（36） ＋59”00／200（CHC13）＋59”60（CHC13）（36） Raffinosehendecaacetate 98−101O 99−1010（37） ＋97．40／160（EtOH）＋920（EtOH）（37）
Stachyosetetradecaacetate 94−950 95−960（30）＋120い10／160（EtOH）＋12020（EtOH）（30） 1・3 考 察 セファデックスG−15を用いたゲル墟過が大豆の少糖類，特にスタキオースの分離に好都合であった1．ベルパ スコ・−スその他の糖も分離できるようであったが対称外とした．ゲル濾過ではカーボンカラムクロマトグラフィ ーとは逆に高分子の糖が最初に流出し，また，流出速度も速いので歴時間で処理できた‖ スタキオースのアセチル化物については小貫（30）と同様結晶として得られなかったが7回沈澱精製したので， 融点，比旋光度とも測定値は小貫の場合と一・致した．アセチルラフィノースの比旋光度はやや高い値が得られた が，その他の測定値はすべて文献値とほぼ一・致した．．このことによって大豆の主な少糖類としてショ糖，ラフィ ノ・−ス，スタキオースの存在が確認された−これらの値は信頼できるものとしてSmithら（38）は引用しているい
−9− 1t4 要 約 大豆の少糖額（ショ糖，ラフィノース，スタキオ■・−ス，ベルパスコース）なカ叫ボンカラムクロマトグラフィ −とセファデックスG−15のゲル汝過により分離精製した′特に高分子螢のスタキフトースやベルパスコースの分 離がか−ボンカラムに比較してゲル墟過の方が良く，また短時間で容易であった 単離したショ糖，ラフィノ、−ス，スタキオースについて，そのアセチル化物とともに融点，比旋光度の湘軍か らこれらを同定確認した
第2章 各種豆類の少糖類
いずれの豆類でも，完熟種子に単糖輯は徴壷しか含まれず，少糖類としてショ糖のほかにラフィノ・−スやスタ キオ−スのようなガラクトツルサッカロースが含まれている（39∼41）りさらに豆凝匿よっては高級なラフィノ・−ス 族少糖頼であるベルパスコ・−スやアユゴースが知られている（42へ44）．楢崎ら（43）はアズキ，イソゲソマメ，ササ ゲにべルパスコ1−・スまたはアユゴース，ナクマメにべ／レバスコース，禄豆にほこの両者が存在するらしいことを 定性的に示している一．また川村（44）は緑豆の少糖額をカーボソカラムクロマトグラフィ・一により分離し，ショ糖 0・75，ラフィノ1−ス0牒4，スタキか−ス0．．80，ベルパスコ・−ス0・21，アユゴ−ス0小22％であるとしている 食品として大豆を含めた豆類全体の中で，大豆の少糖類の成分的，盈的関係を知るため，9種類の完熟した豆 類について統一・的方法で一・般分析，少糖類の分別定量を行ったn 2・1 実験方法 2・1・1 試 料 落花生（ArαC旭ゐ）pOgαeα），ソラマメ（Ⅵcぬノdわα），エンドウ（月盲αmざαとわαm Var．αrUe花βe），アズキ （V密花ααれg比丘αr・is），線豆（Ⅴ．．rJαdiα亡α），インゲソマメ（PんαSeO加s拙句闇・ね），ササゲ（Vなれα8eSq比如血鮎）， ナクマメ（（b花αUαg￡αggαd血α），それに大豆（GろγC去れe mα方）の9種頬で大豆の品種Hawkeye以外は市販の完 熟種子∴で品種は不明である” 2・1・2 一般分析 食品分析方法として決められている常法（45）によって水分，灰分，粗脂肪，粗タン／くク賀，粗繊維を定蓋し， 100％からこれらの％の合計を差し引いて可溶性無窒素物を算出した， 2・1・3 遊離糖 粉末（32メッシュ）試料に・10億容のエタノールを加えて還流抽出を行い，さらに冷水での洗浄をアソトロン法（46） で糖の反応がなくなるまで繰り返し，酢酸鉛で除タンパクし，イオン交換樹脂で処理して精製した（6）全糖をア ントロン法，還元糖をSomogyi法（47）で定見し，全糖葺から還元糖鼻を差し引いて非還元糖とした． 2・1・4 デンプン McCr・eadyら（48）による25％過塩素酸抽出法を用い，糖定量はアソトロン法によった， 2・1・5 ペクチン質とヘミセルロース 試料5gに0一．5％シュウ酸アンモニウム300mgを加え85℃で24時間抽出し，抽出液に3倍容のユタノ・−ルを・加 える・・生じた沈澱を熱水に溶かし，0‖1〃水酸化ナトリウムで脱メチルし，塩酸で酸性にしてから，塩化カルシ ウムを’加えペクチソ酸カルシウムとして沈澱させ測定した・豆によっては沈澱のpHが異なるため殺良となるよ うpHを変えた．ー10− 2・1・6 セルロース 粗繊維をさらにα−，β−，γ−セルロースに分別定量した−・粗繊維を17．5％水酸化ナトリウムと45分間撹拝 し，1−G−3グラスフィルタ・−で墟過し，残留物をα−セルPh−スとし，墟液に酢酸を加えてpH4．．0にしたと き生じる沈澱をβ一・セルロ、−スとした小波液中にあると思われるものを計算上γ−セルロ、−スとしたぃ α−とβ −セルP・−スは重畳法忙より瀾優し，γ−セルロースは粗繊維よりα−とβ−セルロースを差し引いて算出した 2・1・7 少糖類 糖類の抽出，精製ほ糖の検出をアンスロソ法の代わりにフェノールー硫酸法（32）に変えたはかは遊離糖（2‖1胡 の場合と同じである．少糖塀の分別定量はペーパークロマトグラフィーによる分離とこれのスポットに相当する 部分から水抽出によった．糖液を東洋濾紙NG514（40×40cm）に添著し，n−ブタノ・−ル・酢酸・水（4：1：2） の溶媒で3回上昇展開した．展開後，濾紙の−・部を3％の塩酸′ミラアニシジン水飽和ブタノール液で発色させて 糖の位置を確認した．残りの墟続から糖スポッ一に相当する部分を切り取り，自然流下法で冷水にて36時間溶出 し，フ・ユノールー硫酸法で糖を定量した． 2・2 実験結果 2・2・1一般分析，炭水化物（49） −L般分析の定盛値はTable2−1に示す．．遊離糖として還元糖，非還元糖およびデソプソ，ペクチンの定量値を Table2−2に示す−．ペクチン酸カルシウムとして沈澱させるときのpHはTable2−3に示した値が最良であった・ 大豆のデソプソをグルコアミラ・−ゼによって加水分解し，生じたグルコ・−スをグルコ・−スオキシダ−ゼ・バー オキシダ1−ゼ法によって定量した値（50）と本実験の過塩素酸法と比較したが大した差はなかった Table2−1Generalanalysis （％ on air−dry basis）
Moistur・e Ash Cr・ude Cr・ude Crude N−free fat pr・Otein＊ fiber ext！＋
1）AraChis布yPOgaea（peanut）
508 190 4950 2278 226 18・48
2）Vicia．faba（brIOad bean）
1247 384 191 2838 448 48・92
3）飽以m8αfiu払m Var、．αr・Uer乙Se（smooth pea）1462 2・59 080 2794 5173 48・32 303 127 2013 346 5855 335 104 2375 417 55．71 3．54 2．49 2013 2．．28 57．13 3121 096 23．38 417 5683 318 1。35 27．38 9り05 4708 4“37 2051 41。58 4．02 19．49 4）Vなna angularis（ad2；ukibean） 13156 5）Ⅴ．rαd払亡α（mung bean） 11り98
6）maseolus uukaT・is（kidney bean） 14”43
7）Vigna sesquipedalis（aspar・ag■uS bean） 11 55 8）αェ花αUαgiαg払d￡α￡α（sword bean） 11 96
9）Gわ′Cわe mα芳（soybean） 10り03
■N−factor：1）5い46，2）∼8）6．25 9）5．71
−11−
Table 2-2 Carbohydrates
（％ on air−dry basis）
Nonred11Cing Star・Ch Pectic N−free Balance＊
SugarS Substance ext．，
3 9 7 1 00 1 3 1 6 4 1 2 0 3 4 5 6
1︺ 0 5 3 0 6 0 3 0
1 一 一一一 一 18 48 48 92 48 32 58 55 55 71 57ノ13 56 83 47 08 19．49 11 53 40．09 44−81 56 73 49 97 42。34 48 99 43 82 9 0 0 8 7 7 8 7 83 8 丘U O 6 7 6 4 6
，・▲ ∩︶ O 1 0 0 ∩＞ ∩＞ 01）Peanut
2）Broad bean
3）Smooth pea
4）Adzukibean
5）Mung bean
6）Ⅹidrley bean7）Asparagus bean
8）Sword bean
9）Soybean
4 8 7 6 0 6 7 8 2 0 0 1 0 1 0 3 0 1 0 0 ハU O O ＜U O O O 7︰ 7・ ウ′ へJ 5 7． ﹁D 5 8 5 6 1 9 5 5 6 2 1 4 9 00 0 6 5 2 2 ＊N−free ext．．−（ReducingsugarS十Nonreducing・SugarS＋Starch＋Pecticsubstance）Table2−3 0ptimum pH to precipitate calcium pectate
1） 2） 3） 4） 5） 6） 7） 8） 9）
Legume Peanut Broad Smooth AdzukiMung Kidney AsparaguS Sword Soybean
bean pea bean bean bean bean bean
pH
56 5．6 54 54 56 60 50 54 5。6 粗放維をさらにα−，β−・，γ−セルP・−・ス と分別定量した結果Table2−4に示した．β− セルロ・−スを沈澱させるとき，いかなるpHに しても沈激を生じない種類もあった 2・2・2 各種豆類の少糖類の含有量（51） 少糖類の分別定温の結果をTable2−5に示 す．六糖類のアユ・ゴースは緑豆を除いてわずか しか存在しなかったので数値で示さず，計算上 0．001％台を±，それ以下を−で示した．同様に 大豆のベルパスコースは0．．01％台であったので ＋とした Table2−4 Celluloses （％ on air−dry basis） α− β−・ γ一Cellulose Ce11ulose Cellulose＊
1）Peanut
2）Br・Oad bean3）Smooth pea
4）Adzukibean
5）Mungbean
6）Kidney bean
7）Asparagus bean
8）Sword bean
9）Soybean
7 7 0 9 0 1 5 4 7 1 8 2 8 5 1 7 0 6 1エ 2 1⊥ l⊥ 2 1］ L 4 2 9 8 6 7 8 7 2 1 7 0 1 8 5 9 1 4 0 9 1⊥ 1 2 1︺ 〇 一1 2 5 0 379 一4 6一6 一一 O l1 0 038 ＊Crudefiber・−（α−Cellulose＋β−Cellulose） 2・3 考 察 数値的にはTable2−1，2−2，2−4を通じで論理的でないものがある．その一つには糖類，デソプソ，ペクチ ン質の合計と可溶性無窒素物との間に大きな差のあることである．．またα−セルロースの加水分解物からペーパ ークロマトグラフィーによりグルコース以外にガラクトース，マンノース，アラビノ・−ス，キシ′ロ・−スがみいだ されており，セルロースの分別法も完全でないい この方法は主に木材化学において行われている定義に従ったま でのことであり，木材と豆類とでは異なった方法によらねはならないと思う−12−
Table2−5 01igosaccharides of9 species ofair−drylegume Seeds Sucrose Raffinose Stachyose Ver・bascose Aj u g e S O
5 5 9 5 9 7 0 7 2 6 8 2 4 1 5 2 3 0 0 ∩︶ 0 0 ■1 0 ■l l⊥ 2 7 7 0 1 9 1 6 9 9 1 8 7 4 5 2 7 0 1十 ︵∠ ウ］ l山 ︵乙 a l山 ︿乙 8 1 2 2 1 4 1 1 5 ＋ 0 0 3 3 2 5 5 4 8 3 5 0 6 8 5 0 4 2 52
1）Peanut
2）Br・Oad bean3）Smooth pea
4）Adzukibean
5）Mung bean
6）Ⅹidney bean7）Asparagus bean
8）Sword bean
9）Soybean
9 一士 ±一〇一一一一 ハU Table2−2に示したBalanceの値は遊離糖とデソプソとペクチソ質の合計を可溶性無窒素物から差し引いた 数億である‖ この値をいわゆるへミセルロ−スの値とも考えられるが負の値のものがでてきた．．その理由は二つ 考えられる．その一つには可溶性無窒素物の値が少なくなっていることである．Table2−1に示したように．，落 花生（52）と大豆とについてほ，窒素畳から粗タンパク質を求めるいわゆる窒素係数が一・応定められており，それ ぞれ5．46と5〃71である。．その他の豆蹄では定められていないので，一般的に用いられている6．．25を用いた．この 係数では高すぎる（例えばソラマメについては指摘されている（53））ので租タソバク質が見かけ上多くなり，従 って可溶性無窒素物が小さくでていることである．その二つには，粗繊維のうちβ−セルロ・−スと丁・−セルロー スとは定義のしようによってはへミセルP・−スに入るので，これを加えるべきである。 Table2−5の少糖類の合計ほTable2−2の非還元糖に相当するもので豆類にはだいたい6−8％あるい アズキ， 緑豆，ナクマメでは少なく4∼5％，最も多いのが大豆の8％である… しかしこの大豆にはデソプソがほとんど 無い．．デソプソを多く含むェ・ソドゥにも少糖類が多いので，デソプソを含むかどうかということと少倍額の含有 率との間に関係ほ無いと思われるい ベルパスコースはエンドウに，アユゴーースは緑豆に他の豆一類に．くらぺて比較 的多く含まれている．．ショ糖を除けはその豆が含む最高級少糖類が最も少なく，それよりもーつだけガラクトシ ル基の少ない少糖類が最も多く含まれているlこのことはCouTtOisら（42）もⅥcぬとエer18C王上肋αr由とについ て認めている． 2・4 要 約 落花生，ソラマメ，エンドウ，アズキ，禄豆，インゲソマメ，ササゲ，ナクマメ，大豆について−・般分析とし ての水分，灰分，粗脂肪，粗タン／くク質，粗繊維を定慶し，可溶性無窒素物を算出，炭水化物として遊離糖，デ ソプソ，ペクチン質を定量した．粗繊維ほさらにα−，β−，γ−セルロースとして，また遊離糖のうち少糖類 を分別定孟した 還元性少糖類は検出できなかった．．すべての豆類匿非還元性少糖炉のショ糖，ラフィノース，スタキオース， ベルパスコ・−スが含まれ，微量のアユゴースの含まれるものもあった． デソプソを多く含む豆類では，その豆が含む最高級少糖類が最も少なく，それよりもガラクトシル残基の一つ だけ少ない少糖煩が最も多く含まれる憤向にあった−13−
第3章 腸内微生物による加水分解
大豆の少糖類を摂取した場合，哺乳動物でほ消化酵素をもたないのでショ糖以外は消化されないことになる・ しかしネズミに．大豆少糖摂を与えた場合ほとんど排出されず見かけ上消化されたことになる（20）り これは腸内微 生物が関与しているものと推測される．本研究では腸内微生物として大腸菌，励cゐeric揖αCOgiが大豆の少糖類 およびそれらの標品をどの凝度分解消費するか，また分解物，生成物についても調べたぃ 3・1 実験方法 3・1・1 占‘ぶC血汀ノと鋸∂ CO〟 本実験で使用した且coヱiほ東京大学応用微生物研究所より分与されたでable3−1に示す20株である・・これら の菌株は水道水に対して1％肉エキス，1％ペプトン，0…5％食塩，2％寒天からなる培地（pH7．0）に憤斜培養 し10℃に保存，3か月毎に植え．替えられたTable3−1Strains of励cherichia coliexamined
No…in this No…Of
Paper IAM Other・descriptions
1016 B−151−1；COli−2；董romIID 1062 B−151−2；COli−5；from Chissoken
1101 B−151−3；COli−6；rrOmIID，Strain TakiNo．2． 1132 B−151−4；COli−7；fromIID，Strain Shoku No巾2． 1159 B−1511・5；COli−8；fromIID，interImediate type。 1182 B−151−6；2−7；from antibiotic test strain．
1204 B−15l−7；ML−3；frIOm paSteur・Institute，COlicinog■enic strains・
1222 B−15ト8；Bor・det；from pasteurInstitute，COlicinogenic（sensitive）str・ainル
1239 B−151−9；from ATCC，11246；from V．A…Najjar，pr・Oduceslysine，g1utamine， histidine，and arginine decarboxylasses。
1253 B−15ト10；from ATCC，3655，antifungaltest strain
1264 B−152−1；fr・OmIAM，K−12；fromATCC，10798；fromC，EりClifton，K−12 1268 B−152−2；fromIAM，B直OmATCC，11303；fr・OmS．．EりLuria，B． 1272 B−152−3；fromATCC，7009（E。COTnTnunior）；fromF．S”Orcutt，StrainF，Vir・ginia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 O 1 2 3 1 1 1 1 Polytech．Instい B−152−4；fromATCC，745（E。COmmunior）。 B−152−5；fromATCC，206（BacteTiumcoli−COmTnunior）． B−152−6；fromlAM，nitricaciddeterminativestrain．． B−152−a；ML308 B−152−b；HrT・2252 B−152−C；W677 B−152−d；IFO3366
for Nos．13，14，and15is E。COlisubsp．coTnmunior（TopLEYetWILSON）Vale， 14 1518 15 1519 16 1137 17 18 19 20 Thescientific name
andthat for・the r・eStis E．coli（MIGULA）CASTELLANIet CHALMERS．
ATCC：AmericanType Culture Collection，12301Park Lawn Drive，Rockville，Maryland20852，
U．．S．A“
IAM：Institute of Applied Microbiology，University of Tokyou IID ：Institute forInfectious Diesases，University of Tokyoい IFO ：Institute for Fermentation，Osaka．
−14− 3・1・2 五種類の培地での培養 3・1・2・1脱脂大豆抽出糖液を炭素源とする培地 これには次の組成のものを用いた・ （NH4）2SO4
KH2PO4
K2HPO4
ペプト ソ MgSO4・7H20 糖液 0．2g 0．3g O．7g O．．5g O．02g 20mg（約2．．Ogの糖類） 水道水で100mヱとする この培地の糖液は2・1・7の方法で脱脂大豆（Hampton）100gから抽出して100m＝こ浪縮したものであるlこの 糖液の中には約10g・の糖類（ショ糖，ラフィノース，スタキオ・−スが約6．．4：1い1：3・・7の割合）を含むことにな る（54） 3・1・2・2 脱脂大豆粉の噂地 脱脂大豆粉に25倍塵の水道水を加え，これに消泡のため0．1％相当の大 豆油を加えたものを培地とする． 3・1・2・3 丸大豆熱水抽出物の培地 丸大豆に10倍量の水を加え，1夜浸潰してつぶし，30分間加熱 煮沸し，布濾過して得た濾液を培地とする． 3・1・2・4 大豆抽出濃縮液の培地 上記の3・ト2・3の抽出液を2倍に濃縮したもの． 3・1・2・5 脱脂大豆粉にリン酸カリウムを加えた培地 脱脂大豆粉6g・とK2HPO41．914g濫水150mヱ を加えたもの 以上（3・ト2仙1∼5）のそれぞれの培地（100mJx2）を培養フラスコ（500mJ）に入れ，120℃10分間殺菌し た．．それぞれの培地の1つに且cogiNo．20を1白金耳接種し，もう1っは接種せずブランクとした。30℃振と う培養し，経時的に各培養フラスコから殺菌ピペットで5mgずつ取り静匿し上清について620nmの吸光度を測 定して，菌の生育を調べた 3・1・3 大豆抽出糖液を含む培地での培養 培地組成はさきの3・1・2・1と同じであるが糖液の最を1／2に減盈（1％となる）したものを用いた．種培養と して上記培地組成から糖液を除いた培地にそれぞれの菌株を1白金耳接種して37℃，18時間振とう培養した小 こ の種培養液0一5mgを，糖液を含む本培養液5mいに加え37℃，20∼60時間振とう培養した… 各菌株の培養液ほ3 本ずつ用意し，20，40，60時間培養後順次とり99％エタノール15mgを加えて授絆遠沈して上清を得る．．、この10 m「を0い5mJに濃縮して20Jりを波紋にスポットし，n−ブタノールー酢酸一水（4：1：2）で3回展開，塩酸パ ラアニシジソ試薬で発色させ，デソシトメーターで測定して糖畳を算出した 3・1・4 各種糖標晶を単独に含む培地での培養 さきの3・1・2・1の培地の糖液の代わりに糖濃度2％となるようにショ糖，メリビオ・−ス，ラフィノ・−ス，スタ キオース，グルコース，ガテクトース，フルクトースなどの1つを単独に加えた培地（5mg）で3・1・3と同様 に種培養液を加え37℃，12∼48時間培養したい単糖類を含む培養液については0，4，8，12時間の培養後，少 糖類を含む培養液については12，24，48時間培養後の残糖盈を測定した∴陪の定量は培養液を殺菌ピペットで0り1 mg取り，10mgの水を加えて遠沈し，その上清1mJにつきフェノールー硫酸法で測定した．．菌の生育は12時間−15− （単糖顆を含む培養液），または48時間（少糖類を含む培養液）培養後，培養液2m‖こ水2mgを加えて620nm の吸光度から測定した 3・1・5 大豆抽出糖液を含む培地での培養による有機酸（糖）の生成 川村ら（67）の実験から特にラフィノ・−スを速やかに消費する菌株No．13∼15，17を選んだ・これらの菌株を3，・1・ 2．1と同じ培地（ただし，糖濃度はNoけ13の生育試験については，0．5，1．0，1．．5，2．0％とし，その他では1・5％ とした）で37℃振とう培養し経時的に糖，有機酸を定量した．菌の生育皮は620nmの吸光度によった・ 3・1・5・1糖の定量 培養液中の全糖はフェノール硫酸法によった・個々の糖は培養液50／上gを東洋 濾紙No．50にスポットし，n−ブタノ・−ルー酢酸一水（4：1：2）で展開，塩酸／ミラアニシジン試薬で発色，デソ シトメ、一夕・−で分別定盈した 3・1・5・2 有機酸の定量 全有機酸は培養液10mgを100mレに蒸潜水で頑釈し，フェノ−ルフクレイ ソを指示薬として0．1NNaOHで滴定した．揮発性酸は培養液10mlK蒸溜水100mlを加えて水蒸気蒸溜し，蒸 溜物を0．1ⅣNaOHで滴定したル蒸溜残物を0．1〃NaOHで滴定して不揮発性酸とした 3・1・5・3 No．13菌株の有機酸の分画，同定 No．13菌株の24時間培養液についてFig．3−1に示す 方法でA∼Eに分画し，これらはさらに東洋濾紙No．． 50を用い上昇法によるペ・−′く− タロマナグラフィー（55） で分離確認した．． h）揮発性軌Fr・aCtionB）はKennedyandBarker（56） C8n†州u9eO†9000rpmfo「10雨n M（Ikodtk（IしInowけh（】u††lo〟N（】OH Add20m1日20 β慮描（〃〃○〝 の方法の95％ユタノ、−ルー・浪アソモニア水（100：1）で 展開，0．1％プロモフェノールプル・−（BPB）による発 色によった． 03）不揮発性鞍（FractionCあるいほFractionD とE）はLuggandOverell（57）の方法のn−ブタノ・−ル ーギ酸一水（4：1．5：1または4．2：1．6：4．2）で展開， BPBあるいは塩酸′ミラアニシジン試薬により発色した ￠）ケト鞍はCa，alliniら（58）の方法でヒドラゾン儲 導体としてペー／く・−クロマトグラフィ・一により分離確 認した．．除タンパクした培養液液に等盈のヒドラジン 試薬（2，4−ジニトロフユニルヒドラジン1gを濃
」＿
「
Ros柑u（ll「
Dl＄†托しq†○ （Fr（】C†ねnA） 叫Uid AcldけywけhH之SOヰ（rodwけh †hymot飢uo） 〃 5ねα訂鮨〃 RestduqしuquId （Fr（】州OnC） （F「8e†bnB） ￠ ふ l〟J竹飢仙〝 凸由■〃．ns。し
駄
（Frqc†bnD） ， Fig．3−1Fractionation of cultur・eliquid to examine or・ganic acid．硫酸2mgに溶かし15m∼のエタノールを加えたもの） を加えてよく舵拝する．．沈澱を墟集しユタノ・−ルで洗う．．得られたヒドラゾソを0．．01Mリソ酸緩衝液（pH7u2）に 溶かすい これを東洋濾紙No小50にスポットし，n−ブタノールーエタノールー水（5：1：4）で展開する巾 スポy †は黄色に見える．0小1〃NaOHを噴霧すると，鮮明なスポットとなる．． 3・1・5・4 酸（とエタノール）の定性確認 揮発性酸としてギ酸，酢酸，不揮発性酸として乳酸，2 −オキソグルクル酸，グルコソ酸，2−オキソグルコソ酸，ケト酸としてビルピソ酸，2−オキソダルクル酸の 存在が考えられ，またクエン酸の存在も考えられる．有依酸ではないがFr・aCtionAにはエタノールが含まれるい これらは次の方法により確認した．． 匝）ギ醸 銀塩の生成（59）：FractionBをNaOHで中和して小量のAgNO3溶液を加え，灰色の沈澱を生
−16一 ずればギ酸が存在する．加熱すると黒変し金属銀を遊離する・ ㈲ 酢酸 硫酸銅法（59）：FractionBを中和してェ・−テルを加えた後2％CuSO4を滴下する．ェ、−テル層 が透明になれば酢酸（あるいほプロビオン酸）が存在する．． 塩化鉄法（59）：酢酸エチールを加えて5％FeC13・6H20を滴下する・ ￠）乳酸 Uffelmann反応（60）：1％フェノール10mlに希FeC13溶液数滴加える．．これにFractionEを加 え，黄色になれば乳酸が存在する．． 仙 ゲルコン醍 高橋，坂口反応（61）：小量の2−ナフトールと約5mlの濃硫酸をFractionDに加える． この混合物を加熱して暗緑色になればグルコソ酸が存在する．．他のヒドロキシ酸でも種々の色を生ずるので注意 を要する． （e）クエン鞍 Denige反応（61a）：遠沈により除タン′くクした培養液5mlにDenige試薬（濃硫酸200ml， 水1J，酸化第二水銀50gを加熱して溶かす）を加え煮沸してから2％KMnO4を加える．白色の沈澱を生ずれ ばクエン酸が存在する．． （f）エタノール Davy反応（62）：FractionAlmlKモリブデソ酸一硫酸溶液（2gの・モリブデン酸を20g の濃硫酸に溶かす）2∼3mgを加える．加熱して青色に変わればエタノールが存在する．． 3・1・5・5 有機酸（その他）の定食 （叫 ピルビン醸，2−オキソゲルクル酸：Shimizu（63，瑚の方法によった．．培養液を10％トリクPル酢酸で除 タンパクする，2，4−ジニトロフェ．ニルヒドラジソを加えてケト酸をヒドラゾソとする．キシレンを加えて掟搾， 遠沈分離する…上層にピルピソ酸のヒドラゾソを含み，下層に2−ケトグルクル酸のヒドラゾソを含む… （al）ピルビン酸 上層を水で洗い，10％Na2CO3を加え，遠沈する．ここでの水屑（下層）にはピルビン 酸のヒドラゾソを含むので，4〟NaOHを加えて250nmの吸光度を測定する．． （a2）2−オキソゲルクル醸 初めのキシレンを加えて遠心分離したときの水屑（下層）には酢酸エチルを 加え空気を吹き込んで控拝する‖ 2−オキソダルクル酸誘導体は酢酸エチル層に・溶ける．水で洗い10％Na2CO3 を加えて遠心分離，水層（下層）にはNaOHを加えて470nmの吸光度を測る‖ ㈲ 乳酸 Barker・ら（65）の比色法により定盈した．．除タソ′くクした培養液匿20％CuSO。を加え，さらに， Ca（OH）2を加えて激しく撹拝する・・糖その他の妨害物質がCu（OH）2やCa（OH）2とともに沈澱するのでその上 滑の青色透明液（乳酸を含む）に冷やしながら濃硫酸を加え，5分間煮沸するり20℃に冷却後4％CuSO4と1．5 ％♪−ヒドロキシジフェニル（アルカリ試薬）を加えて560nmの吸光度を測る一． ￠）ゲルコン醸 Ca（OH）2とCaCO3を加えてグルコソ酸カルシウムとして測定する小 （dクエン鞍 CaC12を加えてカルシウム塩として測定する（61） 桓）エタノール 0．．1ⅣKMnO。と4ⅣH2SO。での酸化による方法で定慶する（66） （f）エステル 滴定法によるい培養液を希釈（10mJを100mトに）して0．1〟NaOHで滴定する（amJ）．． 次にエステルをケソ化するため0．．1NNaOH（50−a）mほ加える・ケン化後これを0．1NH2SO4で滴定する（b mり，さらに過剰の酸を中和するため0．1〟NaOHで3回目の滴定をする（cmg）．0．1〟（50＋c−a−b）mJがエ ステルに相当する‖ 鹿）残糖 フェノールー硫酸法によった．．
−17− 3・2 実験結果および考察 3・2・1各種培地での培養（67） 五種顆の培地で培養したNo一．20菌株の生育状態を620nmの吸光度としてTable3−2に示す 3．1．2．1∼3・1・2・5の培地を（1）∼（5）で 示したが，（1）以外の培養液では浮遊沈降 の激しい懸濁液で測定困難であり，最初 の最も大きい値を示した“（1）での生育は 吸光度が菌の増殖に比例したが他では不 明確であった。Table3−2でみられるよ うにこの菌株では3・1・2巾1の培地に・最も Table3−2 Gr・OWthofbacteriaonsoybeanmedia 0 5 0 3 5 8 引 5 9 0 0 2 1 0 0 1十 1⊥ ■l 1 0 4 3 5 7 0 射 9 9 6 9 9 9 0 0 0 0 0 0 8 0 6 8 2 2 引 5 7 6 7 6 1 0 ∩︶ 0 0 0 1⊥ 0 7 4 4 3 0 釘 8 7 6 6 8 7 0 0 0 0 0 0 3 2 5 5 ‖ 0 0 7 4 ︵ nW O O l▲ Medium Cultivated ror・6hr． 12 24 48 72 160 96 155
よく生育した巾3．1．2．2の培地よりは3心2・3の培地が少し良く生育することから，大豆水抽出物中にはこの
菌株の生育のための栄養素を含むものと思われる．しかし3・1・2‖2の培地より3・・ト2・5の培地でよく生育する
ことから，大豆だけの培地ではカリウムとリソ酸塩が不足しているとも考えられるいこのようなことから次の実
験から3・1・2・1の培地を使用することとした 3・2・2 大豆抽出糖液を含む培地での培養による20菌珠の比較（67）結果はTable3−3およびFig．3−2a，3−2bに示す・Fig・・3−2のグラフ横軸は培養時間を示す・培糞20・40，60
時間後の培養液中の残糖を定盈したが，20時間の培養でスタキか−スを完全に消費する菌株（Noい4，7，11∼17）
Table3−3 AmountsofremainlngSugarSfr・OmSugarmixtureextractedfrom
defattedsoybean，Whenincubatedwith20strainsofE・COli
（densitometerreading） Stachyose20 40 60hr
Raffinose SucrOSe ‖− ．・いい ‥− No．or str・ain 20 404 ＋ 3 1 ＋ 4一一一一一一一一一一一＋一一
7 ± 3一＋ 5一一6一一6一一一一一6 7一
597一75一101713 t−−■一■ ■ 11107
622 1一
1 7＋12 ■ 410−1 10 ■ ■ ■ ■−−■ ■ 88 ■15911062−■ 122−︼一−■ ■ ■ 7183
7072830530 ■ 473385118393−−65 ︻ 8566 ■ 25 1111112 298 2 20 11 1111111112 3072‖67264829545607102717 ︻ 67 ■ 08356886 1 1 1 1 1 2 2 1 2 2 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 218 ▲10−1●
101＼代柏
r 一・0／ ﹄
罠
ゝ丁＝
Tlmo（hr） S†「dn No．4． ＿＿⊥＿、＿．．．．⊥．．．．．．．．．．．．一 之○ ヰ0 60 Tlmo（hr） S†「cIin No∴ 0 之○ ヰ0 6 TImo（hr〉 S†「（】inNo。5． 0 20 40 60 Tlmoくhr） S†「qin No．2．○ 虹
Tlmo（hr） S†「（】lnNo．8． ＝＼＝＝二 且
虹≡
0 20 40 60 Tlmoくhr） S†「dn No．6．一一
0 20 40 60 Tlmo（hr） S†rく】‡n No．7． 0㌻￣壱0 茹「二玩 Tlmo（h「） S†「（】！n No．5．＼
／／
− − 0−1−● 0 0こニ、
o---o SucrOSe ●−● SねChyose ▲∴▲ R（汗fino＄e題
50 0 20 40 60 Tlmo（hr） 0 20 40 60 Tlmo（hr） S†rqinNo．9． S†r（封nNo．10． Fig．，3−2a Compar・isonofstrainsNos．1−】00fonsugarmixturefromsoybean．Seethetextforexplanation．
については別に2．．5，5，10時間培養液について測定したい グラフ縦軸は残糖の相対量（培地中に∴含まれるショ糖を 100とした）を示す．Table3−3の数値は各糖の相対量としてデソシトメ、一夕ーの読み値を示したので，この数 値を直接別の糖との比較はできない例えば各100J‘gのショ糖，ラフィノース，スタキオ・−スのデソシトメータ の読み値の比は1．．00：0．531：0．266となるので実際の糖畳はTable3−3の数値にショ糖で1，ラフィ／・−スで 1．88，スタキオースで3．76倍する必要がある Figr。3−2のグラフ縦軸はHamptonのショ糖，ラフィノ1−ス，スタキオースの含有急が6。4：1．1：3．．7とされ ている（54）のでこの割合でショ糖を100として培養0時間の値を示してある培養後の糖盈はTable3→3の数値 から算出したものである ペーパークロマトグラフィーではショ糖，ラフィノース，スタキオース以外の糖スポッtはみられなかった−19−
＼
／／
・′∵∴、一
三
虹＿品
も。L −
・．＿」もー−−・⊥一 20 40 60 「tmo（hr） 0 20 40 60 Tlme（hr） S什qin No．12． （B）． 0 20 40 60 Time（hr） S†「（】in No．11． （K−12）．S什qirlNo．15． S†「（】in No．14．
（SUbsp．communjor）．（Subsp．communior’）． ー01、l、N⋮ Y
−O
A
∵二
＼
二
20 40 60 0 20 40 60 40 60 0 0 20 40 60 Tlm8（h「） S†「q行1No．15． （SUbsp．com爪〟〃ノ0バ． Tlmo（h「） S†「dn No．18． T‡moくh「） S†「（】in No．17． Tlmo（hr） S廿dn No．16．．ニl∵墓
∵・
＝ 抑5
01−−O Sucrose O−● S†qchyose ▲＿▲ R（】††inose㌔山
20 40 60 ∫lm￠（h「） T血相幻 S†rqinNo．19． S†rdnNo．20． Fig．3−2b ComparisonofstrainsNos”1卜200nSugarImixturefr・OmSOybean・ Seethetextforexplanation． これは他の糖（単糖煩など）が存在しても量的に少なかったものと思われるこれら且cogiの培糞でラフィノ・− スとスタキオ・−スは同様の傾向にあるがショ糖は少し変わったものもある． 大豆の少糖煩をショ糖とガラクトシドに分けて，その消費状態から20菌株を分類するとTable3−4のようにな る．急速にショ糖あるいはガラクトシドを利用する株はそれぞれ強力なインベルクーゼあるいほα−ガラクトン クーゼ活性を有するものと考えられる． 3・2・3 各種糖標晶を単附こ含む培地での培養（68） No‖9，18菌株は貯蔵中に死滅し欠けたがその他の18殊についでショ糖，メリビオース，ラフィノース，スタ キオ・−スでの培養結果（残糖）をTable3−5およびFig‖3−3a，3−3bに示す」グラフの横軸は培養時間，縦軸は−20− Table3−4 Classificationof20strainsofE．coliaccordingtOCOnSumption ofsucr・OSeandgalactsides（raf丘noseandstachyose）（TheNol
Ofstrainsareshow）
Sucr・OSe Galactosides Consume 1， 3 9，18，19 6 8 2 1 3 5 7 ▲1 2 4 Slowly（or scarcely） 2， 5， 8 10，20 intermediately 6 1 4 1 6一13 rapidlyThisclassificationis only tentative and not so strict．
Table3−5Amountsoftotalsugar・remainingbycultivationof18strainof
E．coli（r・elativeamountsinabsorbance）
Sucr・OSe Melibiose Raffinose Stachyose
No…Of strains 12 24 48 12 24 48 12 24 48 12 24 48hr 0 7 6 5 6 ︵H﹀ 6 7 4 9 5 5 4 3 5 9 2 3 1 0 4 4 4 0 4 0 4 0 0 0 4 3 4 3 3 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 4 3 6 7 4 6 5 6 5 5 7 5 7 5 4 8 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 4 3 4 4 3 4 nW O O O O O O α 0 ∩︶ nW O nい 0 0 0 0 0 5 3 4 4 5 5 4 5 6 6 4 5 5 5 3 5 4 6 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 ∩＞ 0 α 0 ∩﹀ ∩︶ 0 0 ∩︶ ∩︶ 0 0 0 0 3 5 8 5 8 ︵×U 5 1 10 ︵バ﹀ 6 2 3 2 2 3 3 0 4 4 3 4 4 3 4 4 2 0 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 0 0 α 0 ∩︶ ∩い ∩︶ ∩︶ nW n＞ ∩﹀ ∩︶ ∩ひ 0 α 5 5 8 5 8 8 4 5 7 1 6 7 6 3 7 00 7 8 4 4 4 3 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 4 4 0
000000∩︶00000000000
48亜483448484545484548130710094848100 0 0 0 0 0 0 0 0 α 0 0 0 0 0 0 0 0
7 6 3 6 8 6 0U 6 7 6 7 7 7 7 7 7 1 7 4 4 1 1 0 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 6 0 0 5 7 7 8 0 9 6 7 5 7 7 0 5 8 4 4 2 2 1 4 4 0 1 0 4 0 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ∩︶ 7 7 7 5 5 7 7 8 8 5 6 7 8 5 5 8 8 7 4 4 2 3 4 4 4 3 3 3 4 0 0 0 0 4 4 0 0 ∩﹀ ∩︶ 0 ∩︶ ∩︶ ∩︶ ∩︶ 0 ∩︶ 0 0 0 0 0 0 0 0 9 0 0 9 9 3 2 1 5 0 0 7 3 5 5 4 6 5 4 5 5 4 4 0 5 4 0 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ∩︶ 0 ∩︶ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 ＜U O 6 1 5 1 1 1 5 00 0 0 4 1 5 昆V 5 5 5 5 0 5 4 3 5 5 0 0 5 1 1 3 0 ∩︶ 0 ∩﹀ 0 ∩︶ 0 ∩﹀ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 1 9 1 4 9 0 9 9 0 7 7 9 5 9 7 3 4 4 5 4 5 0 4 5 4 4 5 0 2 4 0 4 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 9 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 糖畳をフェノールー硫酸法による定盈時の480nmの吸光度を示した ガラクトシド（メリビか一ス，ラフィノ・−ス，スタキオース）のこれら18菌株による消費は同様でない・少糖 類の消費によって18株を分類すればTable3−6のようになる．これらの結果は3・・2・2の結果とほ層卜十致するが 単独の糖として急が比較的多いので48時間では完全に消費されなかった−21− 「 ○・・・・・・・・・・・○・−−−○・・・・・・・・・・・・・・−一○ 〒 O 12 24 Tlmo（hr） S†「q‡n No．2． O 12 24 ヰ8 Ttmo（hr） S†roln No．6． 48 O 12 24 ¶momr） T加○（hr〉
S†r（】in No．4． S†「く】in No．5．
転
O 12 24 ¶momr） S†「qin No．10．転
Tlmo（h「） S†「dn No．8． 0．6賢
Tlmo（hr） 0．4 0．之 S†「（】in No．7． 0−OSucrose ▲− ▲R（】ffinose ▲− AMeしibiose 4−・＋S†dChyose Fig．3−3a Decompositionof401ig・OSaCCharidesbystr・ainsNos・卜8andNo．100f E．coli．Seethetextforexplanation．22 〇． 〇 樗い﹂ ぺ■
∴﹁
0 12 24 48 ■T加e（h「） S†r■qin No．12（B）．O 12 24
48 S†「（】in No．13 （Subsp．communjor）．十
O 12 24 48 Timo（hr） S†rqin No．11（K−12）．訂
S†「qin No．14 （SUbsp、COmmunior）． d l云 1『 一ね Tlme（hr） S†「qin No．15 （Sしjbsp．co爪m〟〃／0∩． 「 12 24 4 丁血相（h「） S†「qin No．16．ト呈
0 ほ 24 4 TImo（h「） 12 24 48 T血○（hr） S†「（】in No．19． 0 ほT一山弘「） 48 S†「（】in No．20． S†r■qin No．17． OSucrose ▲− ▲RQ†finose ムMeしibiose ●−●S†QChyose Fig．3−3b Decompositionof401igosacchar・idesbystrainsNos．1卜17and19−200f E．coli．Seethetextforexplanation．ー23−
Table3−6 ClassificationofE．colistrainsaccordingtOCOnSumption OfoligOSaCCharides小
Sucr・OSe Melibiose Raffinose Stachyose
2，3，4，5，6，7， 3，4，5，7，10，14 8，10，17，19 15，16，17，19，20 （1）NotatalloI・Only l，2，3，4，5， 1，2，6，7 slightlyconsumed 7，8，11，12 in48hours （2）Almostcompletely lO，14，15，19 3，12，17，19 1，11，12 1，2，6，8，11・12 con＄umedin48hours 13 4，5，8，10，11 （3）Considerablycon− 17 sumedin24hourIS （4）Almostcompletely 6，13，16，20 13，14，15，16， 13，14，15，16， consumedin12hours 20 20 単糖類の結果はTable3−7に示す．No．．19株を除いて，これらの糖のすべてが速やかに（12時間）消費された このように少糖炉よりも単糖類が急速に消費される．少糖煩が加水分解されて単糖類ができたとしてもすぐに消 費されるので，少糖煩培養液中には単糖類がみられないものと考えられる． 少糖類で48時間培毒したときの培養液の620nmにおける吸光度（生育）をTable3−8に示す。Table3−9は単 糖類で12時間培毒したときの培養液の620nmにおける吸光度を示す 菌株No．2，3，4，19の低い値を除けば他の菌株では糖類による大きな差ほないい単糖類は少糖炉の1／4時間の培 養でほぼそれに近い増殖を示すことになる Table3−7 Amountsofsugrarremainlng・bycultivationof18strainsofE．．coli （relativeamountsinabsorbance） 釣uCtOSe Galactose Glucose 7 6 4 9 4 5 5 5 5 4 4 5 0 4 5 3 4 00 5 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 ∩︶ 0 0 ∩︶ 0 0 0 0 0 0 0 0 8 7 4 4 7 5 6 6 6 5 5 5 0 5 5 2 1 5 8 3 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ∩︶ ∩︶ 0 0 0 0 4 0 7 1 2 5 00 3 0 3 2 7 0 4 3 3 5 8 7 4 4 3 4 3 3 3 3 4 3 3 3 4 3 4 3 3 3 1 0 0 0 0 ∩︶ 0 0 ∩︶ 0 0 ∩︶ 0 0 ∩︶ nW O O O O 1 7 8 6 8 8 0 5 5 8 7 8 7 7 7 6 9 4 7 4 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 7 3 8 7 7 1 3 5 0 9 5 6 6 9 6 9 0 4 4 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 5 1 ∩︶ ∩い ∩︶ nW n︶ ハレ n﹀ 0 0 ∩ひ ∩︶ ∩＞ ∩︶ ∩ひ 0 0 0 ∩︶ ∩ひ 9 5 00 3 3 4 0 2 8 1 2 5 9 0 0 0 2 6 9 4 4 4 4 4 4 4 4 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1 0 0 ハリ O O O O O ハリ O ハリ ハU ∧U O O ハリ O O O 8 5 7 7 5 8 4 7 4 6 7 4 6 5 4 3 5 1 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 6 8 7 4 8 0 7 7 9 ︵︶U O 9 9 0 9 5 0 8 5 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 7 5 9 2 1 00 5 3 7 9 7 5 3 2 2 5 2 5 4 4 4 3 4 4 3 3 4 3 4 3 3 3 3 3 5 1 0 0 0 0 0 0 0 ∩︶ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 k an123456780123456790 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 B
−24−
Table3−8 Growthofbacteriaonolig・OSaCCharidesin48hourS
（absorbanceat620nm）
No．of strain Blank Sucrose Melibiose Raffinose Stachyose
0 5 5 0 8 5 5 6 1 0 3 0 0 2 7 2 2 9 5 4 3 5 4 5 1 1 2 3 3 5 5 2 5 5 1 5 −1 1 0 0 0 1▲ O 1 0 1 1 1▲ 0 0 0 0 0 0 9 3 9 4 5 4 0 7 5 5 9 7 2 8 5 1 2 5 6 3 5 1 9 4 ︵H︶ 6 3 4 3 5 7 6 5 0 8 7 1］ 0 0 ■⊥ 0 0 ■1 0 0 0 ■l ■l ■l l⊥ ■l ■1 0 1﹂ 6 3 0 4 0 9 5 2 8 8 0 00 0 0U O O 7 0 1 1 1 8 5 2 2 4 0 0 4 3 4 1 3 4 1 3 0 ∩︶ ∩︶ ∩﹀ ■1∩︶ ∩︶ 1⊥ ■l ↓⊥ ↓⊥ 1⊥ l l▲ ■1 1⊥ l⊥ l⊥ 2 7 6 5 ︵︶U O 8 4 4 4 1 0 0 0 0 0 0 8 0 1 1 〇．5 5 3 1 1 1 1 8 7 5 8 5 8 1 ∩︶ 0 0 0 0 1︺ 0 0 0 0 0 ■⊥ lト l⊥ ■l ■l l⊥ 0 2 1 0 5 6 00＋00 8 7 00 7 2 5 7 0 5 3 8 3 0 1 0 4 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 ∩︶ ∩︶ ∩﹀ 0 ∩︶ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 23 4 5 6 7 9 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 Table3−9 Growthofbacteriaonmonosaccharides in12hours（absorbanceat620nm）
No”Of strain Glucose Galactose Fr・uCtOSe
5 5 6 8 3 0 4 5 0 9 4 5 5 0 1 0 5 2 9 4 6 5 9 0 0 0 0 8 9 0 9 9 9 9 4 1 0 0 0 ∩︶ O l十 1⊥ 1 1︺ 0 0 1十 0 0 0 0 0 1⊥ 8 00 3 4 6 8 1 8 4 2 8 0 7 4 7 0 5 5 9 3 6 6 00 6 0 9 0 9 9 0 9 9 9 9 4 1 ∩︶ ∩︶ ∩︶ 0 0 0 1 0 1︺ 0 0 ■⊥ 0 0 0 0 0 1 8 6 2 4 8 5 7 2 6 7 4 2 2 4 0 7 9 nO 9 9 5 9 8 7 0 9 8 6 9 9 6 7 9 8 4 9 0 0 0 0 0 0 ■⊥ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 9 0 1 ■l l l l l l l 1 2 3・2・4 大豆抽出糖液を含む培地での培養 による有機酸（糖）の生成（69） 3・2・4・1 種々の糖濃度での菌の生育 No．13株を糖0“5∼2．．0％含む培地での菌の生育を Figり3−4に示す。グラフ横軸は培養時間，縦軸は 2倍に．希釈した培養液の620nmでの吸光度である．．糖濃度を0．5％から1．5％にあげたとき生育は増加したがさら に2％にあげたときは減少した．．この理由は不明だが菌−こ対して栄養的アソバラソスとなるのかも知れない．こ のことから以後の実験には糖濃度を1．5％とした． 3・2・4・2 ど．．co〟4蛛の培養による大豆抽出糖類（濃度1．5％の場合）の消費 3・・2・2と3・2‖3の結 果からガラクシドを良く（短時間で）消費する菌株Nol．13∼15，17について培養液中の糖の変化をさらに詳細に
−25・− Table3−10 CourseofdegT・adationofsugarsby β．coJiNo．13 調べた．．その結果をTable3−10∼3−13に示す．． 糖定免償は元のショ糖を10とした場合の相対値 で示した．いずれの菌株も少糖類が急速に加水 分解され，これらの産物であるメリビオースや 単糖類が−・時的ではあるが現れている（培養10 ∼20時間のとき）い 少糖類（スタキフトース，ラ フィノ・−ス，ショ糖）はα−ガラクトシダ・−ゼ やβ−フルクトシダ1一ゼによって，まず加水分 解されてから利用される∩還元糖であるメリビ オースはラフィノ・−スがβ−フルクトシダーゼ によって加水分解された結果生じたものである，． メリビオースはα−ガラクトシダ・−ゼ，ショ糖 はβ−フルクーシダ・−ゼまたはα−グルコシダ ーゼによって加水分解されるものと考える”培 養20時間以後で単糖炉はみられない．単糖類は 速やかに．利用され−・部はさらに有機酸へと変わ るものと考えられる． 3・2・4・3 g．co〟 の培養による酸の 生成 No．13∼15，17菌株を1．5％の大豆抽出液 を含む培地に培養した場合の有機酸の生成の結 果をFig．3−5∼3−8に示す．全酸，揮発性酸， 不揮発性酸はその等価な0．．1〃NaOHの塵mg で示し，菌の生育は同じスケールの吸光度で示 した．揮発性酸と不揮発性酸の合計が全酸であ るが3一・1・5・・2で述べた方法の分別滴定では誤 差があり，0．．1〃酸で表したとき不揮発性酸が 全酸よりも大きくなることがあった．No．．15株 を除けは単糖類の現れる培養10時間から全酸が 増加した．No．15株で生成した酸は，培養10時 間から急速に減少し，Noい14株で培養20時間か ら減少している…40時間の培養で糖は1．／勺ほど 残っているがNo．13株を除けば酸は少なくなっ ている・Figu3−5∼3−8にみられるように・糖の 分解や酸の生成は菌殊によって様々であるい 3・2・4・4 培養液中の酸の同定確認 ペー／く・− クロマトグラフィー（3・1・5・・3（a）） でFig”3−1のFractionB（揮発性酸）での分 離は充分でなく，Rf■0．10∼0．12に広■がった一・ Time of cultivation Oムr 5 10 15 20 25 30 40 C r u F C Gl a G e M u S 轟●▲ a R
ta 65443221 S
1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 ±±00 000 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 7 6 5 4 3 2 1 5 2 2 2 1 1 0 0 0 Table3−11CourSeOfdegradationofsugarsby 且eoZiNo．．14 Time of cultivation Oh・ 5 10 15 20 25 30 40 C ℃ r F C G a G e M u S f a R 2 10 00000 ta 65433210 S 1 士±000 00 0 ± 士 士 0 0 0 0 0 9 8 7 5 3 2 1 1 5 1 0 0 0 1 0 0 0 Table3−12 CourseofdegradationofsugarSby 且cogiNo．15 Time of cultivation Ohr 5 10 15 20 25 30 40 u r O O O O O O O O F IC O O O O O O O O G a O O 士 士 士 000 G眈 00000000
uC 10 S r 51 aR 21α〇
a 士 St642111 Table3−13 CourISeOfdegradationofsugrarISby 且．co∼王 No．17 Time of cultivation Ohr 5 10 15 20 25 30 40 e γ▲ u l lF Oα︰仇00000
C IG O O〇〇〇〇〇O
l l l l a G O O 5 32 1 M O O l O O O O O uC 10 S t S 65432110 a Raf 5 5 3 2 1 2 ■l 1 0 ∩︶ ∩︶ ∩︶ 026 ︵〓○ロN−≧1．〇盲苫︶○∈n一〇＞ HOロN−≧1．〇−〇〇∈︶む∈⊃一〇＞ tO 20 50 40 一Tl鵬OInhou「S 0 5 10 15 20 25 30 40 time In hours Fig・．3−5 Acidformations，r・emainingSugar andgr・OWthofthestrainNo．13． Fig。3−6 Acidformations，remainingSugar・， andgrowthofthestrain No．14． To†れq￠id 冥盲亭i〓d−〇〇∈︶○∈n一〇＞ 2 4 〓00N−≧﹁○−○︵一∈︶￠∈⊃一〇＞ O 10 20 Tlmeinhours 50 40 0 10 20 30 40 TimoInhou「S Fig．3−7 Acidformations，remainingSugar， andgrOWthofthestr・ain No…15． Fig・．3−8 Acidformations，remalnlngSugar， andgrowthofthestrain No．17． Table3−14 Nonvolatileacidsonpaperchromatogram（1）， BuOH−HCOOH−H20（4：1．．5：1） Rf Colors
Standard Sample BPB Anisidine FrIaCtion Acid
CulturIeliquid Gluconic Ol04 003−004 Yellow
C 2−0ⅩOglutaric O158 056−058 Yellow
E Lactic O‖67 065−0．66 Yellow
Table3−15 Nonvolatileacids on paper chromatogram（2）， BuOH−HCOOH−H20（4．2：1．6：4い2）
Rf Colors
Standard Sample BPB Anisidlne Fraction Acid
C Gluconic O08 0，07−008 Yellow
