（
丑1…・一 軒 旧 蚤茎←0㌘三言∝
＼
／● 0 ︵邑喜⁝00ヂ主中∝ ＼11ゝ／● ︑＼〜＼ ／
」
8 9 20 50 40 50 Temperc†ure（OC）60
7 6
5
6 7 8 9
pH PH
Fig…4−4 0ptimumpHof a−galacto−
Sidase from E．colisubsp．．
COmmu7110r■．
Fig．4−50ptimumtemper・atur・e Fig 4−6Stability oftheα ーgalactosidase at Var・iouspHvalues，
Whenkeptat350C oI−400C roT・15min．
Or α−galactosidase from 且colisubsp COmm乙 7110J【■．
−36−
un汁′ml Phosphく汁ebu††e「
100
84un汁′mt
打
Fig・L．4−7Thermalstabilityofthe α−galactosidase，When keptatvarioustempera−
tur・eS rOr・15min．
0 5 ︵芭そ王■OD盲コP扇0∝
2
Time（dqy）
4 6
Fig．4−9Stabilityoftheα−gralactosidaseatO〜50Cat variouspHvalues（1arger・figure）andatdiff−
erentconcentration（uppersmal1erfigur・e）
550 − 3
︵芭き三も〇一ロnP−笠∝
25 50 100 pH6…8Phosphq†￠bu††e「（mM）
Fig．4−8 Ther・malstabilityofα−
galactosidaseat370Cin relationto the concen−
tration of phosphate buffeT、．
Fig小4−10Theeffectsofbuffersontheactivityof theα−gala（豆OSidase．
4・2・2・9 緩衝液の影響 実験4＝ト2・8（a）の結果Fig．4−10の上部に示す・40mMリソ酸緩衝液酵 素液忙トリス一塩酸緩衝液を加えることによって酵素活性は直線的に減少したlトリスー酢酸綬衝液の添加は5
〜10mMで変わらず，それ以上で直線的に減少した。実験4・・1 2 8（b）の結果はFig小4−10の下部に示したlこ の場合トリス緩衝液にリソ酸緩衝液の添加は酵素活性を増大させたこのトリス緩衝液の酵素液はリソ酸緩衝液 酵素をトリス緩衝液に対して透析して調整したものであるが，このとき若干の失活があった
4・2・2・10 塩類の影響 Fig‖4−11に実験4・1・2・9の結果を示す・左部は50mMリソ酸緩衝液酵素液 に塩塀を加えた場合の活性である．図では示さなかったがNa3As0。はNa2SO4と同じく影響しなかった・KCl，
NaCl，（NH4）2SO4の添加は阻害的効果があり，このこ とから予備実験のときこれらの塩による塩析が不成功で あったことの説明ができるい石部は50mMトリス緩衝液 に塩類を添加したときの結果を示すい これは先のリソ酸 緩衝液添加（4l・1・2・・8（b））と同様Na3AsO4の添加で 活性が増加する．．このことは，この酵素がPO書￣やAsO宮￣
のような3価の陰イオンで活性が賦活されるものと考え られる．またKClやNaClの負の効果がトリス一塩酸緩
50汀IMPh05pl叩†8餌†ねr◆Soけ 50爪MTrlsbu††or◆Sqけ
＜＞
0 0 0
︵塑と≦−00ぎーーP一〇∝
SoけCOn肌（mM） Sロー†￠OnCnい（mM）
Fig．4，11TheEffectsofsaltsontheactivity Oftheα，galactosidase．
ー37一 衝液の場合よりも少ないことから，この酵素はCl￣によって阻害されるものと思われる・これはFig■い4−10のト
リス一塩酸とトリスー酢酸緩衝液の差からも説明できる‖その他EDTA（ethylene−diamine−tetraaCetate）や MnSO4の添加の影響はみられなかった
4・2・2・11基質特異性 実験4・ト2‖10の結果をTable4−8に示す，表中の右端の欄は4・ト2一・10に 示す条件で各基質の単位酵素当たりの加水分解割合を示す．この精製酵素はβ−ガラクトシダ・一ゼ，スクラーゼ，
マルク・−ゼを全く含まないことを示す
Table4−8 Substratespecificity（II）
Substrate Enzyme Incubation Relativeretioof
（2mM） （unit／ml） （min） hydrolysis（％）
0 0 0 0
2 2 2 2 9 8 0 9 4 1⊥ 06 1
α一PNPG Melibiose Rarfinose Stachyose
l 1 0 0
3 3 2 2
6 6
β−PNPG Lactose Sucr・OSe Maltose
0 0 0 0
6 6 6 6
0 0 0 0 4 4 4 4 7 7 7 7
50
1／S（mM）一■1
Fig…4−12 TheLineweaver−Burkplots Oftheα−gralactosidasewith P−Nitrophenyトα−galacto−
side
∴
／ 101
4
T︵u盲＼￠ぢ∈∈︶＞＼︻
0．2 0．4 0．6
1／S（mM）￣l
0．4 0．8
1′S（mM）￣1
−0．4
Fig小4−14 TheLineweaver−Burkplotsofthe α−galactosidasewithRaffinose．
Fig‖4−13 TheLineweaver・−Burkplotsofthe α−galactosidasewithMelibiose．
4・2・2・12 KmおよびVmax PNPG（Figい4−12），メリビフトース（Fig．4−13），ラフィノース
（Fig．．4−14）を基質としたときのLineweaver−Burkのプロットを示すlFigり4−13において高濃度基質（1／S の小さい値）では直線から逸脱した．これはこの酵素の高濃度基質における転移作用によるものと考える（4〃2
・2・・14のFig・．．4−15でのマンニノトリオ・−スあるいはスタキオースの存在も同様）・上記プロットから得られた Km，VmaxをTable4−9に示すい
4・2・2・13 酵素反応の生成物 Fig…4−15（左部）はメリビオースを10分〜24時間酵素反応させた場 合の反応生成物のペーパー クロマトグラムである α−ガラクトシダーゼ作用でメリビオース（α−galactosyl glucose）はガラクトースとグルコ・−スに加水分解される。しかしながら0．5〜1時間でトリサッカリドらしきも
ー38一
Table4−9 Kinetics of α−Galactosidase
Rarrinose
（1．67〜100）
353
5
Somog・yimethod 3．．65×10−2 2い04×10−5 Melibiose
（1．．25〜100）
68…6
10 Glucose oxidase
2．32×10−3 2一．67×10−5 αTPNPG
（0．01〜2．．00）
70．6 1．O クーNitrOphenol
liberated l．07×10−4 2．72×10−5 Substrate
（mM）
Enzyme
（unit／mり Incubation
（min）
Determined by gm（M）
Vmax（mole／min／
mgprOtein）
の（たぶんdi（α−g・alactosyl）−glucose）がα−ガ ラクトンダt−ゼの転移作用によって現れた…Fig＼．4
−15（石部）はラフィノスの0．．5〜24時間反応生成 物のペ・−パークロマトグラムである．ラフィノ・−ス
（α−g・alactosylsucr・OSe）ほこの酵素に．よってガ ラクトースと・ンヨ糖に加水分解される−．クロマトグ ラムからは徐々にラフィノ・−スが減少しショ糖，ガ ラクーースが増加している小 この場合も反応1〜4 時間でスタキオ・−ス（di（g・alactosyl）sucr・OSe）ら
しきかすかなスポッ†がみられ，転移作用によるも のと思われた
R（】††inos0 250mM
馳絆†○描冨諸ヲ諾㍗
・
†eb Meしtblose
◎ ◎ ◎＠⑳⑳−GしC−
⑳◎◎◎⑳軌蝕一
一Suc・・
0．5 0．4 0．3 0．2 0．1 0
〈診◎◎ ⑳ ⑳◎ −Me卜
0 0 0■ ・和一−⑳⑳⑳◎◎。
0000 ■
増給 。。。−Ver一
24 01′2l
11mす（h）Ol′61′215．58 2 4 8 24
Fig．．4−15 PaperchromatogT・amShowingthe COurSeOfenzymaticreactionwith theα−galactosidaseonMelibinse
（1eft）andRaffinose（right）asthe substrate．
4・2・3 E．co〟以外のニ〜三の他の腸内細菌のα−ガラクトシダーゼ作用（77）
4・2・3・1菌株No…オ〜24の培養と糖類の消費 4∴ト3・・2の方法でによる培養のときの菌の生育を620 nmの吸光度で測定した．その結果をTable4−10に示す．48時間振とう培養したNo。21菌株の場合，試験した4 つの少糖類では生育しなかったがフルクトースで少し，グルコ・−スとガラクトースでやや生育した・他の3株
Table4−10 GrowthofbacteriaNos．21−24after48hours ofcultivationon themediacontaining7differentsug・arS（valuesofOD620）
SugarS Blank（b） GIc Gal Fru Suc Mel Raf Sta
Blank（a）
0 003 0003 0010 0035 0002 0002 0174
No〃21 0り203 0309 0．310 0205 0166 0168 0160 0182
0004 0003 0．060 0001 0．120 0020 0008 0．013 0006 0‖005 0120 0013 0010 0。017 0005 0030 0067 0．115 0 007 0058 Blank（a） 0・064 0・002
Noい22 0．006 0．029 0082 No．．23 0．053 0．202 0182
No−．24 0．007 0067 0．104
Notes：Blank（a）：miⅩtui・eSOfcultureliquidcontainingeaChsugar・butwithoutbacteria Blank（b）：mixturesofcultureliquidwithoutsugar・but containing−reSpeCtive bacteria．．
ー39−
24 48 72 120 168 hT
Fig 4−19 DecompositionofsugarSby 鼠ノdecαgね（No。．24）．
Fig・．．4−18 Decompositonofsugrarsby エ．αCidop九血β（No．23）．．
くNo．22〜24）も少糖頬に対してあまり生育しないがS．ノdecα〜ね（Noh24）がショ糖とメリビオースで生育した・
これらの菌による糖の消費はFig．4−16〜4−19に示した各グラフの7つの曲線は試験した7つの糖：グルコ・−
ス（GIc），ガラクトース（Gal），フルクトHス（Fru），lンヨ糖（Suc），メリビオース（Mel），ラフィノー ス（Raf），スタキオース（Sta）である
4・2・3・2 菌株No．．22〜24のα−ガラクトシダーゼ作用 4・・ト3・・3の実験結果をTable4−11〜4−13 に示す．菌の生育，pH，残糖（4・・ト3・・3（Ⅱ）），細胞外，細胞内α−ガラクトシダ・−ゼ（4」ト31・3（Ⅲ））と超音 波処理抽出液（細胞内酵素液）のタン′くク質丑（4・1・・3一・3）を示す・No．24株についてさらに120時間まで培養
したその結果をFig．4−20に示す．
−40−
Table4−11α−GalactosidaseforImationinLactobacillusacidophilus（No．22）
48 96
Timeofcultivation（hr） 0 15 24
0235 O 082 0い024 0，032
680 690 6 95 0．810 0．765 0。735
BacterialgTOWth（OD620）
圃‡
Residualsugar（OD480）
α−Galactosidaseactivity
Extracellular（nmole／ml／min）
Intr・aCellular（nmole／ml／min）
Proteininsonicate（mg／ml）
6 80 0．718 001 0．346 6 80
O 713
0．114 0，204 0．314
Table4−12 α−GalactosidaseformationinL．acidqphilus（No．23）
Timeofcultivation（hTう 0 15 24 48 96
0，142 0164 0．144 O 147 680 688 6．85 680 6 81 0．810 0680 0680 0．728 0．728
0002 0．01 0，004 0．004 001 0．004 0800 1004 0．680 0．680 Bacteriagrowth（OD620）
pH
Residualsugar（OD480）α−Galactosidase activity Extrace11ular（nmole／ml／min）
Intracellular・（nmole／ml／min）
Proteininsonicate（mg／ml）
Table4−13 α一Galactosidaseformationin Str・eptOCOCCuSjaecalis（No．24）
Timeofcultivation（hr） 0 15 24 48 96
0．285 6．62 0518 O 61 12 6
0．514 0095 0 100 0．164
6．85 6．82 6 80 0670 0673 0．698 009 025 0．46 011 042 18 2 0498 0967 0 496
Bacteriagrowth（OD620）
pH
Residualsugar（OD480）
α一Galactosidase activity
6．80 0，810 Extracellular（nmole／ml／min） 003 Intracellular（nmole／ml／min）
Proteininsonicate（mg／ml）
Fig．4−20 Bacterialgrowth，pr・Oteincontent，andintracellular（in ）andextr・aCe11ular（exい）
α−galactosidaseactivityofStrqptococcus．faecalis（No．24）．．
−41−
4・2・4 （付）ネズミ小腸のα−ガラクトシダーゼ
哺乳動物の消化系にほα−ガラクトシドを水解するα−ガラクトシダーゼが存在しないか（13）あるいは微量に
存在する（14）との報告があり，これを確認するためネズミ小腸についてα一ガラクトシダーゼ活性を調べた＝
4・2・4・1生後のα−およびβ−ガラクトシダ爛ゼ活性の変化（15） 正常飼育によるウイスター系自
ネズミの出生直後から離乳期および成熟期について小腸を摘出し，腸管内外をよく洗い全長を3等分して，胃に
A（P岨5） 打OXim血†柑d 8くP岨5）
4 量
15 20Aduu 10
Fig．4−21Postnatalchangesofβ−g・alactocidaseactivity
Theenzymeassaywasperformedwiththereactionmixture（2lOml）containingOl1M acetatebufferpH3．5（A）or5・5（B），0…15Mlactose，andhomogenateSup・OnlO5G AfterincubationforlOminat3rC，themixturewasheatedbyboiling・for2min，neut−
r・alizedwithMK2CO3，andfilter・ed・・Theamountofg1ucoselibratedinthefiltratedwas measuredwith Glucostat，，（Wor・thingtonBiochemicalCo．）lTheresultsare expressed
withdotsforindividualanimalsandwithacurveshowingaverage
Pr・OXim8し†川「d
● ● ● ● ＿
︵u盲01＼・d冨＼雲0∈亡；l写壱く
Fig．4−22 Postnatalchangesofα，galactosidase activity
Theestimationofα−galactosidaseactivityisthesameasthat of β−galactosidase
activityexceptthatO・、1Mmelibioseinsteadoflactosewasusedasthesubstrateincu−
batedatpH46for30minat600C
ー42一
近い部位から近位部，中位部，遠位部とし，それぞれをホモジナイズし，その105G，60分の遠沈の上清について 酵素活性を・測定した．．その結果をFigい4−21，4−22に示す・β−ガラクトンダー・ゼ（ラククーゼ）活性の測定ほ 比較のために行ったものである 生後の発育による両酵素活性変化は非常によく似ている・しかしながらα−ガ
ラクトシダーゼ活性は非常に弱い．
β−ガラクトシダーゼ活性ほ測定pHが3り5と5．5の場合はぼ同じ備になったが，α−ガラクトシダ・−ゼはFig1・
4−23に示したように鋭いピ1−クとなってpH4‖5〜4．8に最適pHがあった また最適温度は600Cとかなり高い値 であった（Fig一．4−24）．
100
ノ
100
㍗占′′P′d′／
80 ︵芭ごち芋UD空事D﹂￠∝
︵芭ご≡−UD警吏D一む∝ 0 0 2 4 6
60
40
40 50 60 70
Temperc†ureO†r・eOC†ion（ C）
4 5 6 7 PH
Fig小4−24 EffectoftemperIatureOnα−ga−
1actosidaseactivity．
Thereactionmixtur・eCOntained as ShowninFig。4−23いItwasincubated for・30minatpH4．6
Fig＼．4−23EffectofpHonα−galactosidase activity小
ThereactionmixturecontainedOい1M sodiumacetatebuffer，0．，1Mmelibiose，
andhomogenateSup，．（105G）of distal thirdfromthesmallintestineof15day
oldratandincubatedfor30minat60℃
4・2・4・2 食餌，抗生物質などが酵素活性におよぼす影響（16） ネズミ小腸のα−ガラクトシダ・−ゼ
活性の摂取食餌による影響をみるため，この酵素の基質の一つであるラフィノースを含むTable4−14に示す飼 料を離乳直前に5日間与えて活性測定した結
果がTable4−15である．．ラフィノースを含 む飼料の場合わずかに増加したが大きな差は なく酵素誘導ほ考えられなかったまたこれ らの活性が微生物によることも考えられるの で抗生物質を与えたときの活性も測定した．．
生後14日目から4日間と生後7日目から5日 間クロロマイセチソパルミテート液（力価：
クロラムフユニコ・−ルとして31い25mgノmJ，三 共KK）を約0い03m〝匹，4〜6時間おきに継続
して経口投与した生後12日目と18日目につい て活性測定した．その結果はTable4−16に
Table4，14 Compositionofexperimentaldiets
（％）
Raffinosegroup Contr・01group Rarrinose
SucrOSe Galactose Glucose Casein Ebios Soybean oil CodliveTOil
Saltsmix．（JoNES−FosTER）
21 3
2 1 7 0 0 0 0 0 4 7 2 0 ⊂U 5 つか ■4
1 4 2
700000 ︻ 4220L＝L2一礼
−43−
示す‖いずれの場合も有意差ほなく，微生物の影響はないものと考えられた
Table4嶋15 Effect of diet containlngraffinose
（Activity：nmOle／mgP．），10min）
Central third Distalt，hird PrJOXimalthird
135（±017） 401（±206）
Contr01 0，89（±067）
19（14）−day−01d
r・atS（3） Raffinose l76（±0−76） 453（±251） 395（±111）
ユ02（士045） 191（±0 90）
Control O34（±020）
21（16トday−01d
ⅠatS（4） RaHinose l77（±021） 505（±189） 426（±1−29）
groups on the fourteenth or sixteenth were fed with the dietsdescribedin Tab王e
y
areindicated as means（±standarderr・Or）
Experimentalanimals weredividedintotwo
postnatalday fromlitter−mateS．，The groups 4−14，and water was glVen adlibituTn．Assa asdescribedin Fig．4−22andresulting valuesTable4−16 Effect of antibiotics
（Activity：nmOle／mg P…／10min）
Proximalthrid Central thrid Distal thrid
ContI・01 659（±195） 1484（±145） 4825（±8 01）
12（7）−day−01d
r・atS（4） Antibiotics 225（±252） 1905（±7。19） 5105（士3．．54）
Contr01 3 71 503 15 41
18（1、て）−day−01d
r・at Antibiotics O．23 570 1607
The oraladministrationof Pediatic chloromycetin palmitate （Sankyo Co．，，Ltd．，To−
kyo）was performedcontinuallyto70r14day old rates at doselevelof Ol03mlper animalatintervals of4−6hoursn
4・3 考 察
バクテリアによって酵素が誘導的に生成されることが知られている‖ g．COJ￡のα−ガラクトシダーゼに関して Crockerら（80，81），SheininandMcQuillen（82），Pardee（83）はα−ガラクトシドによるだけでなくβ−ガラク
トシドによる誘導の可能性を報告しているい しかし本実験ではα−ガラクトシダーゼの誘導はα−ガラクトシド のみであったい Buttin（84）は且coた：K−12（本実験のNoい11）のα−ガラクトシダーゼは誘導酵素であるとし
ている．
本実験の途中でHaenel，Buttlorrら（79，85，86）の微生物のα−ガラクトンダーゼの報告を知った．・彼らは且 coヱiの二つの菌殊についてα−ガラクトシダーゼは検出されなかったとしている（86）．またA汀ら（87）によると試
験した風cogiの56菌株のうち，その大半がショ糖とラフィノ・−スのどちらか，あるいはその両方を利用すると している．彼らはこのうちいくつかのα−ガラクトシダーゼ酒性をもつ菌株をみつけ，それが適応酵素で細胞内 に局在すると報告している．
Dey and Pridhamの総説（88）7α−ガラクトシターゼの生化学で，Buttin（89）はE．coliの同種の酵素，特に