大豆の少糖炉は主にショ糖，ラフィノ・−・ス，スタキオースと微量のベルパスコースからなり，ショ糖以外はそ れぞれモノ・一，ジ・−，十り−α−ガラクナシルサッカロ・一スであり，畳的にはガラクトシルサッカロースが・ンヨ 糖とはぼ同畳あるいはそれ以上存在することに．なる（6）．このガラクトンルサッカロースの加水分解酵素α−・ガラ クトンダ1−ゼ（α−Galactside galactohydrolase，EC3・2・1・22）がヒトの消化酵素として存在しないので，
このようなα−ガラクトシルサッカロースは消化されないことになる小 しかし腸内微生物がα−ガラクトンダ・−
ゼをもつとすれは，このような少糖煩は加水分解され吸収利用されることになる．
第3章においての実験で且cogiのすべてが大なり小なりガラクトシルサッカロースを分解利用すること，一時 的ではあるが単糖類を遊離し，また有機酸など生成することを確認した．本実験では．腸内微生物のα−ガラクト
シダ・−ゼを検索し精製して性質などを調べた．
4・1 実験方法
4・1・1亡．co〟4株の細胞外および細胞内α−ガラクトシダーゼ作用（70）
4・1・1・1菌珠 ガラクトシドを比較的よく消費する菌株としてTable3−4からNo．13，14，15，16
（Table3−1）を選び使用したい
4・1・1・2 培養 川村ら（71）の方法で0．．2％KH2PO4，0い05％MgSO47H20，0一．05％KCl，2％ペプト ソ，0い6％糖を蒸溜水に溶かし，NaOHでpH7い0に調整したものを120℃，10分間オートクレープで殺菌し静犀 培養した‖培養は種培養と本培養に分けた∴種培養は上記培地から糖を除いたものに菌を1白金耳接種し370c，
15時間静置培養する‖ 本培養はこの種培養液を2％加え37℃で静置培養した．．
4・1・1・3 糖の定量 培養液中の糖の分別定丑はペーパ・−クロマトグラフィ1一によった…n−ブタノ・−
ルービリジンー水（6：4：3）で2回展開し，塩酸パラアニシジン試薬で発色，デソシトメ、一夕・−（440nmの吸 光度）で測定した．全糖盈はアソトロン法（46）によって定意した．
4・1・1・4 酵素液の調整と酵素活性の測定 細胞外酵素については培養墟液をそのまま酵素液とした．
ー29−
細胞内酵素は，培養液を遠沈し，得た沈澱（菌体細胞）を一度遠沈して水洗し，超音波処理して細胞を破壊し・
同盈の1／15Mリソ酸緩衝液（pH7uO）に懸濁し，00c，15分間遠沈（10，000rpm）してその上清を酵素液として用
いた．
酵素活性の測定は川村（71）らの方法に準じ2mlの酵素液，2mlのS6rensen緩衝液（0…4m11／15MNaH2 PO4＋6…Om11／15MNa2HPO4，PH6・98），1mlの2・・5％メリビオースを加え，37℃24時間反応させる…この 反応液に無水ユタノ・一ル15m㌃を加えて反応を停止させ，その一億爵をペ・−／く・−クロマトグラフィーによって分 別定量し，反応液中のメリビオ−スの分解率を算出するい活性ほこの分解率（％）で表した・・
4・1・1・5 酸の測定 培養液のpHほガラス電極pHメーターによった・酸滴定値は培養液10mJに蒸
溜水100mほ加えてフェノ・−′レフクレイソを指示薬として0．1ⅣNaOHで中和するmg量で表した‖揮発性酸は 培養液10mいに蒸溜水100mJを加え水蒸気蒸溜したもの（200mg）を中和する0．．1ⅣNaOHのmJ数で表した・
不揮発性酸は蒸溜残物を中和する0リ1∧rNaOHのmヱ数で表した・
4・1・2 E‖CO〟subsp COmmuniorJAM1272（No・13）α一ガラクトシダpゼの精製と性質（72）
4・1・2・1培養 3＝ト2・1の培地の糖液を以下のように変えたものを用い，37℃で振とう培養したけ この酵素ほ4小2‖1・2の結果から誘導酵素と考えられ，予備実験としてラクトース，ラフィノー・ス，スタキオー スのいずれか0．5％濃度としたもの，または，この予備実験の結果（4・2・2 1）からラフィノ・−スを0．．5％（またほ 0．．2％）濃度とした培地での培養により得た酵素を精製し，性質を調べたハ
4・1・2・2 酵素活性の測定
（a）基質としての糖がラフィ／1−スまたはスタキオースのような非還元性の糖の場合1mlの糖液（10mg／ml）
3mlの1／15Mリソ酸緩衝液（pH6．8），1mlの酵素液の混合液を37℃，20分間イソキュべ−rする小5％ZnSQl
lmlと0．．25NBa（OH）21mlを加えて酵素反応を止め，その遠沈上清についてSomogyi法で還元糖を定量
する‖
73）
ぬ）基質とLてメリビオ−ス（またはラクトス）を用いる場合（a）と同様酵素反応させると同時にBart。
のグルコ・−スオキシダ・−ゼ・パーオヰシダ・−ゼ法によって遊離グルコースを定温した．
（C）合成基質としてp−Nitropheny卜α−D−gaIactopyranoside（PNPG，Pierce Chemica［CoIP）を用い
た場合 0．．01NPNPGO．1ml，0 2Mリソ酸緩衝液（pH6．8）0．3mlKO…1mlの酵素液を加えて37℃，20
分間イソキュベ1−卜する．0．1NNa2CO39。5mlを加えて反応を止め，400nmの吸光度を測定する‖酵素活性 はこの条件で1分間に遊離するp−ニトロフェノールの1n（ナノ）モルを1単位とする・・4・1・2・3 細胞内酵素の調整 この酵素は細胞を超音波処理することにより強力な酵素活性がみられ る（4．2．1．1）ことから超音波処理条件について検討した4・1・1・4の方法に準じて，菌体を乾燥室盈として 9．2，22小9，35‥8，58．．7mg／10m〜緩衝液（pH6．8）の懸濁液について種々の時間（10〜30分）超音波処理し，
酵素活性とタソバク質鼻を測定したい
4・1・2・4 酵素の精製 酵素やタソバク質の一・般的精製法（硫安塩析，カラムクロマトグラフィー など）を試みたが成功せず，硫酸ナトリウムの塩析とSinger・and Kearney（74）の方法のリソ酸カルシウムゲル
（CPG）処理を組み合わせたFig，．4−1に示す方法で精製できた（7叶糖をラフィノース0．．5％（あるいは0・・2％）
濃度とした3・1・2・1と同じ培地に4〜8時間370cで振とう培養する，以下掛こ記さない限り0〜5℃で操作する・
遠沈（8000rpm）で菌体を集め水洗して，20mMリソ酸緩衝液（pH6一．8，もとの培養液の1／50の丑）に懸濁し て15分間超音波処理する‖この超音波処理液の遠沈（12，000rpm）により上活を得，これを粗酵素液（Fig．．4−1
−30−
の（A））とする‖この粗酵素液（A）のα−ガラクトシダー ゼはこのままの状態ではCPGに吸着しないので（A）のタ
／くク盈の4〜5倍量のCPGを加えて撹拝遠沈し上清を得る
（B）．この上清（B）50mlK14gの割合でNa2SO4を加え加 湿（350c）溶解し塩析する。．遠沈（25℃，12，000Ⅰ・pm，10
Crude ex†rcc†（A）
Cqphospho座gel Supernq†qn†（B）
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。。る（Cト この塩析，透析により酵素液の緩衝液濃度を20m Mから5mMにl＝げたことになる．．透析した液（C）に再び CPGを加えて酵素を吸着させる。酵素を吸着したCPGを 遠沈で集め20mM緩衝液で溶出する（D）‖ 以上塩析，透析，
CPG吸着，溶出を繰り返す（E）．タンパク質の定量ほ紫外 部吸収によるKalckaI▲（76）法によった．
4・1・2・5 酵素反応の最適pHおよび温度の測定
三二 20m
ご
M bu††er
（D）．（E）
Fig…4−1Pur・ificationoftheenzyme・
最適pHは100mMリソ酸緩衝液で370c20分間の酵素 反応で基質としてPNPGを用いた∴最適温度は同様にしてpH6。8において求めた・
4・1・2・6 酵素の熟安定性の測定 これは3つの方法によって行った1・
（叫 種々のpHのリソ酸緩衝液の酵素液を35℃，あるいは400cに15分間保ったときの残存活性をpH6・・8で測定 定した巾
㈲ 酵素液（リソ酸緩衝液pH6．8）を種々の温度（20〜500c）に15分間保ったときの残存活性を測定した1・
￠）種々の濃度（5〜124mM）のリソ酸緩衝液で37℃に5，15，30分間保ったときの残存活性を測定した・・
4・1・2・7 種々のPHで0〜50Cに保ったときの安定性の検討 異なったpH（6．．55〜8．90）のリソ酸緩 衝液の低濃度酵素液（48Units／mg）を0〜5℃に保ったときの活性変化（残存活性）を調べた小また高濃度の酵 素液（2，365Units／mg）についても調べ比較した小
4・1・2・8 酵素活性に対する緩衝液の影響 酵素反応におけるリソ酸およびトリス緩衝液について調
べた．
（如 40mMリソ酸緩衝液に種々の濃度（0〜40mM）のトリス一塩酸またはトリスー酢酸緩衝液を加えた場合り
㈲ 40mM†リス一塩酸（または酢酸）経衝液に種々の濃度（0〜200mM）のリソ酸緩衝液を加えた場合の酵 素活性を測定した，．
4・1・2・9 酵素活性に対する塩類の影響 リソ酸緩衝液またはtリス緩衝液忙25〜200mMの各種塩類 を加えたときの酵素活性を測定した小
4・1・2・10 酵素の基質特異性 2mM基質（PNPG，メリビオ、−ス，ラフィノ1−ス，スタキオース，ク ーニトロフユニルーβ−D−ガラクトピラノシド（β−PNPG），ラクトース，ショ糖，マルトースのいずれか），
酵素液，50mMリソ酸緩衝液（pH6…8）で37℃20分間反応させ，各基質の加水分解割合を測定した・・
4・1・2・11酵素の基質に対するMichae（is定数（Km）および最大速度定数（Vmax）の測定 一億濃度 の酵素液と種々の濃度の基質（PNPG：0．01〜2．．OmM，メリビオース：1．25〜100mM，ラフィ／−ス：1．67〜
100mM），100mMリソ酸緩衝液（pH6．8）を37℃でインキエペ−ト（PNPGでは1分間，メリビオースでは10 分間，ラフィノースでは5分間）して反応速度（それぞれ遊離p−ニトロフェノ・−ルの吸光度，遊離グルコース をグルコースオキシダーゼ法，還元糖の増加をSomogyi法で測定した）からLineweaver−Burkのプロット
（1934）を作図し，それぞれの基質に対するKmおよびVmaxを算出した・
−31−
4・1・2・12 メリビオースおよびラフィノ1−スを基質とLた場合の酵素反応生成物 250mMメリビオ・−
スおよびラフィノ・−・スを基質として最適pH（6小8）最適温度（370c）で10分〜24時間酵素反応させたときの反応 液を，n−ブタノールービリジンー0．．1N∵HCl（5：3：2）の溶媒で2回展開したペー／く・−クロマヤグラフィー で調べた
4・1・3 己CO〟 以外の二三の他の腸内細菌のα−ガラクトシダーゼ作用（77）
4・1・3・1腸内細菌 且coJ〜以外の腸内細菌としてTable4−1に示した4殊について調べた。これら の菌株はHaenelら（79）の報告を参考として選び，東京大学応用微生物研究所より分与された
Table4−1Str・ainsofintestinalbacteriaotherthanE．coliusedinthisinvestigation
No、in this
report＊ species
No・OfIAM OtherIdescriptiorlS（78）21 丹0￡e㍑S mirαむi〜怨 IFO3849；fr・OmOUT8141，f工Om
AKU；fromNCTC6197 22 Lac10bacillus acidqphilus lO43 fromATU；fromESAH
23 〝 1084 f■romNARI
24 Slrq）tOCOCCuS jdecalis 1262 fromATCC8043；E．Snell，
S．〜αCぬR （Univ．．ofTexas）
Notes：（78）ThestrainNo。21wasdonatedbyIFO（InstituteforFermentation，Osaka）and the other strains Nos．22−24byIAM（Institute ofApplied Microbiology，The University ofTokyo），thr・OugrhthecourtesyofProf．．H．．ⅠIZUKA．．The other abbreviations of the OT・ganizationsare as f01lows：
AKU：Faculty ofAgriculture，Kyoto University，Kyoto ATCC：AmericanTypeCulture Collection，Rockville，Maryland ATU：Faculty of Agr・iculture，The University of Tokyo
ESAH：NationalInstitute of AnimalHealth，Tokyo
NARI：NationalAgriculturalResearIChInstitute，Ministry of Agriculture and For−
estry，Tokyo
NCTC：NationalCo11ection of Type Cultur・e，London，Engrland OUT：Faculty of Technology，Osaka Univer・Sity，Osaka
＊Nos．1−20 are E．colistrains describedin3・1・1
これらの菌株の保存について，P．mirαわ〟誌（No‖21）ほ鼠coZiの場合（3・・ト1）と同じ培地で保存した、他の
3株，エ．αCidqpん昆びg（No〃22，23）とS．ノbecαgね（No．24）は1％酵母エキス，1％ペプトン，1％酢酸ナト リウム（1 7％CH3COONal・3H20），0巾02％MgSO4・7H20とそれぞれ0．．001％のMnSO4 4H20，NaCl，FeSO4・
7H20に1％グルコース，1．7％寒天，0．03％CaCO3を脱塩水に溶かした培地に培養保存した′′各菌株は1か月毎 に梅香えした‖菌株が保存中に若干の性質が変わることがあるので保存1週間以内のものについて以下の実験を
した．
4・1・3・2 培地と糖類の消費
（Ⅰ）培地と培養法 菌株No．21は且cogiの場合（3＝ト4）と同じ方法で種々の糖0い5％で37。C振とう培養した，．
菌株No．22〜24は保存培地と類似の0．2％（NH4）2SO4，0い7％K2HPO4，0い3％KH2PO4，0一．3％ペプトン，0．2％酵 母エキス，1．．0％酢酸ナトリウム，01・02％MgSO．・7H20，0．001％MnSO。 4H20，0り001％NaCl，0．001％FeSO．・・
7H20，0・03％CaCO3に糖0．．5％を加えた培地で37℃で静匿培養した．単糖類としてグルコース，ガラクトース，