日本感染症学雑誌第82巻第3号

LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法による

Mycoplasma pneumoniae

の高感度迅速検出

吉野

学

安中 敏光

小島

禎

池戸 正成

Key words : Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Mycoplasma pneumoniae, community-acquired pneumonia, gene diagnosis, rapid

要 旨

マイコプラズマ肺炎の起因菌 Mycoplasma pneumoniae のゲノム内に存在する反復配列 SDC1 を標的とした LAMP プライマーを設計し，臨床検体からの診断法の確立を目的として，特異性および感度に関する検討 を行った．設計した M. pneumoniae用 LAMP は 65℃ の等温条件下で，試験したすべての M. pneumoniaeに 対し，60 分以内に迅速かつ特異的な増幅反応を示した．相同性の高い M. genitaliumをはじめ，他の Myco-plasma属菌や細菌性肺炎起因菌との交差性もないことを確認した．最少検出感度は 6 コピーであり，対照 としたふたつの nested PCR と同等あるいはそれ以上の高い検出感度を示した．喀痰など臨床患者検体から 抽出した DNA サンプルを用いて PCR との相関性を検討したところ，判定結果は完全に一致した（204 例 中 24 例陽性）．LAMP 法は反応から検出までを閉鎖系の中で迅速かつ簡易に遂行できるため，適切な治療 判断を必要とされる臨床現場において極めて有用な診断法であると考えられた． 〔感染症誌 82：168∼176，2008〕 序 文 非定型肺炎の約 30∼40％，流行年には約 60％ 程度 が Mycoplasma pneumoniae によるマイコプラズマ肺炎 であり，クラミジア肺炎とともに高い割合を占めてい る１） ．マイコプラズマ肺炎は，5∼35 歳の年齢層の市 中肺炎の大きな部分を占め，日本での発症頻度は 1,000 人に 4 人程度との報告があり，また米国では毎年 200 万人の患者が発生し，10 万人のマイコプラズマ肺炎 の入院患者が発生していると推計されている２） ．とき に呼吸不全などを呈する重症化や遷延化する症例もあ り，適切な治療を迅速に行う必要がある． マクロライド系薬の投薬など適切な治療が重要とな るため，感染初期からの確定診断の必要性が求められ る．胸部レントゲン写真，咳および発熱などの臨床症 状所見，末梢白血球数や CRP 値の一般検査のほかに， 採取した呼吸器検体からの分離培養法や，PA 法によ る血清抗体価の上昇確認によって確定診断を行ってい る３） ．しかし，これらの診断法は，培養による確認お よび抗体価上昇までに時間を要するため，迅速性に欠 け る．ま た，DNA プ ロ ー ブ 法４） や PCR 法５）∼７） も 開 発 されているが，検出感度，特異性などに問題があり， 最も感度が高いとされる nested PCR 法においても， 依然として操作の煩雑さと迅速性に欠けている点があ り，簡易・迅速でありながら高感度・高特異性の診断 法の開発が望まれていた．

Loop-mediated isothermal amplification（以 下， LAMP）法は，特徴的に設計されたプライマーと鎖 置換活性を有する DNA 合成酵素との組み合わせによ り，65℃ 付近の一定温度において，標的遺伝子配列 を高感度に効率良く増幅する方法である８） ．LAMP 法 で用いるプライマーは，少なくとも 6 領域の塩基配列 を認識するため特異性が高く，一本鎖ループ構造を認 識するプライマーを起点とした DNA 合成と，自己を 鋳型とした 3 末端を起点とした DNA 合成が同時多発 的に進行するため，極めて迅速かつ高感度に標的遺伝 子を検出することが可能である．反応効率が顕著に高 原 著 別刷請求先：（〒329―0114）栃木県下都賀郡野木町大字野木 143 栄研化学株式会社生物化学研究所 吉野 学

いため，副産物のピロリン酸マグネシウムによる白色 沈殿が大量に生成されるので，反応時間に伴う反応液 の濁度の上昇を指標にした増幅反応の有無の確認を， 測定装置，もしくは肉眼で行うことが可能である．ま た一般的な PCR 法と比べて，LAMP 法は遺伝子増幅 反応を阻害する生体成分の影響を受けにくいことが知 られており９） ，簡易な前処理で得られた粗抽出サンプ ルからも増幅反応が速やかに行われる．この特性を利 用して，既に畜産・漁業・環境・臨床など幅広い分野 で応用されている１０）１１） ． このような LAMP 法の特徴を応用して，臨床検体 を対象としたマイコプラズマ肺炎検査においても，検 体処理から増幅，そして判定までの一連の行程が簡易 かつ迅速でありながら，従来の方法よりも高い特異性 と検出感度を有する検査法を構築できる可能性が考え られた．今回，我々は LAMP 法による M. pneumoniae 検出法を確立し，感度および特異性など反応特性，お よび臨床患者検体を用いた PCR 法と本法の相関性を 検討したので報告する． 材料と方法 1．試験菌株 試験した M. pneumoniae株は，臨床株，標準株など 10 株（内 2 株は未同定の臨床分離株）を用いた（Table 1）．また，他の Mycoplasma属として，M. genitalium， M. hominis，M. salvarium，M. fermentans，M. orale の 計 5 菌種 5 株を選択した．PPLO 液体培地を用いた各 培養菌体から，DNeasy Tissue Kit（QIAGEN 社）を 用い，使用方法に沿って genomic DNA を抽出および 精製した．M. pneumoniae（816,394bp，DDBJ!EMBL! GenBank accession No. NC_000912）１２）

，M. genitalium （580,076bp，同 NC_000908）１３） は既知のゲノムサイズ をもとに DNA 濃度からコピー数をそれぞれ決定し た．そ れ 以 外 の Mycoplasma 属 菌 は M. pneumoniaeの ゲノムサイズに換算して，同様にコピー数を決定した． Mycoplasma属以外に，細菌性肺炎起因菌など 28 菌 種 28 株を選択した（Table 1）．培養菌体を生理食塩 水に McFarland No.1（約 2.4×108_{CFU!mL）となる} ように懸濁し，TE 緩衝液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0）で適宜希釈し，95℃，5 分間熱処理 し，急冷後，12,000rpm，5 分間遠心し，その上清を 加熱 DNA 抽出液とした．一部の菌株は，上記と同様 に菌体から genomic DNA を抽出および精製し，既知 のゲノムサイズをもとに DNA 濃度からコピー数をそ れぞれ決定した． 2．プライマー設計 標的遺伝子は M. pneumoniae特異的な塩基配列を持 つ，SDC1 配列（DDBJ!EMBL!GenBank accession No. M35024）１４） を選択した．基本プライマーのインナープ ライマー（FIP および BIP），アウタープライマー（F3 および B3），さらに増幅反応を加速させるループプラ イマー（FL および BL），計 6 つのプライマーを設計 した．なお，LAMP 増幅産物の特異性を確認するた め，F1-B1 間の鋳型由来配列に制限酵素 Hinf I によっ て切断される塩基配列が配置されるようにした．各プ ライマーを構成するドメインの位置および配列を Fig. 1に示した．FIP は F1 の相補配列と F2 の正配列から 構成され，BIP は B1 の正配列と B2 の相補配列から 構成される． 3．LAMP 反応 反応基質の dNTPs と硫酸マグネシウム，および pH 緩衝剤を処方した Reaction Mix に，各 LAMP プライ マーと鎖置換活性を有する Bst DNA Polymerase を 添加した LAMP 反応液を作製した（Table 2）．LAMP 反応液 20µL に加熱 DNA 抽出液 5µL を添加し，リア ルタイム濁度測定装置 LA-320C（テラメックス社）を 使用し，65℃，60 分の測定条件で，LAMP 増幅反応 に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムの白色沈殿 による反応液の濁度上昇をモニターした． 4．PCR 反応 国立感染症研究所作成の「病原体検出マニュアル」３） 中に「マイコプラズマ肺炎」項中の DNA 検査法とし て記載されている 16S rRNA 遺伝子および p1 遺伝子 を標的とした 2 種類の nested PCR を，マニュアルに 従って操作した． 5．感度試験 コピー数を決定した M. pneumoniae M129 株（I 型 菌），FH 株（II 型菌）の精製 genomic DNA を用い た．また，2 株の LAMP 増幅領域を含む塩基配列（310 bp）を挿入した plasmid DNA をそれぞれ作製し，構 築した plasmid DNA も LAMP 法の感度試験に用い た．genomic DNA および plasmid DNA ともに，TE 緩衝液で段階希釈し，95℃，5 分間熱処理し，急冷後， LAMP および PCR に鋳型として添加した（plasmid DNA を用いた感度試験は，LAMP 法のみ）．

6．特異性試験

Table 1に示した M. pneumoniae 10 株，M. pneumo-niae以 外 の Mycoplasma 属 5 菌 種 5 株，Mycoplasma 属 菌以外 28 菌種 28 株の精製 genomic DNA，あるいは 加熱 DNA 抽出液 5µL を，LAMP 反応液に添加した． M. pneumoniae株は反応あたり 60 コピー，M. pneumo-niae株以外の菌株は 600,000 コピー（あるいは 600,000 CFU）を供試し，LAMP 反応を行った（65℃，60 分 間）．ただし，M. pneumoniae株以外については，120 分まで LAMP 反応を継続して行い，非特異反応の有 無を試験した． 7．臨床患者検体を用いた相関性試験

Table 1 Strainstested in thisstudy

Tt(min.)＊

LAMP Contentoftemplate

Reference (Type) Strain Name 25.2 ＋ copies/test 60 ATCC15531 (II) FH

Mycoplasmapneumoniae

25.0 ＋

copies/test 60

Clnicalisolate

Mycoplasmapneumoniae

25.8 ＋

copies/test 60

Clnicalisolate

Mycoplasmapneumoniae

26.2 ＋ copies/test 60 ATCC29342 (I) M129

Mycoplasmapneumoniae

23.5 ＋ copies/test 60 ATCC15492 (II) Mac

Mycoplasmapneumoniae

26.5 ＋ copies/test 60 NBRC14401 (＝ ATCC15531) (II) FH

Mycoplasmapneumoniae

28.0 ＋ copies/test 60 (I) 100

Mycoplasmapneumoniae

26.9 ＋ copies/test 60 (I) 180

Mycoplasmapneumoniae

27.3 ＋ copies/test 60 (II) 6

Mycoplasmapneumoniae

29.2 ＋ copies/test 60 (II) 60

Mycoplasmapneumoniae

－ － copies/test 600,000 ATCC23114 (Type strain) Mycoplasmahominis － － copies/test 600,000 ATCC23064 (Type strain) Mycoplasmasalvarium － － copies/test 600,000 ATCC19989 (Type strain) Mycoplasmafermentans － － copies/test 600,000 ATCC23714 (Type strain) Mycoplasmaorale － － copies/test 600,000 ATCC33530 (Type strain) Mycoplasmagenitalum － － cfu/test 600,000 ATCC19606 (Type strain) Acinetobacterbaumannii － － cfu/test 600,000 ATCC15309 (Type strain) Acinetobacterlwoffi － － cfu/test 600,000 ATCC19209 Alcaligenesfaecalis － － cfu/test 600,000 ATCC27061 (Type strain) Achromobacterxylosoxidans － － copies/test 600,000 KKpn-1

Chlamydiapneumoniae

－ － copies/test 600,000 Bud-1 Chlamydiapsittaci － － copies/test 600,000 L2/434/Bu Chlamydiatrachomatis － － copies/test 600,000 D/UW-3/Cx Chlamydiatrachomatis － － cfu/test 600,000 ATCC29897 (Type strain) Chryseobacterium indologenes － － copies/test 600,000 Nine mile Coxielaburneti － － cfu/test 600,000 ATCC11775 (Type strain) Escherichiacoli － － cfu/test 600,000 ATCC43319 (Type strain) Flavobacterium breve － － cfu/test 600,000 ATCC4651 (Type strain) Flavobacterium odoratum － － cfu/test 600,000 ATCC9795 Haemophlusinfluenzae － － cfu/test 600,000 ATCC13883 (Type strain) Klebsielapneumoniae － － cfu/test 600,000 ATCC33152 (Type strain) Legionelapneumophla － － cfu/test 600,000 ATCC33462 (Type strain) Legionelalongbeachae － － cfu/test 600,000 ATCC33217 (Type strain) Legionelabozemanii － － cfu/test 600,000 ATCC33218 (Type strain) Legionelamicdadei － － cfu/test 600,000 Moraxelacatarrhalis － － cfu/test 600,000 ATCC27853 Pseudomonasaeruginosa － － cfu/test 600,000 ATCC13525 (Type strain) Pseudomonasfluorescens － － cfu/test 600,000 ATCC17588 (Type strain) Pseudomonasstutzeri － － cfu/test 600,000 ATCC8100 Serratiamarcescens － － cfu/test 600,000 ATCC25923 Staphylococcusaureus － － cfu/test 600,000 ATCC14990 (Type strain) Staphylococcusepidermidis － － cfu/test 600,000 ATCC49619 Streptococcuspneumoniae － － cfu/test 600,000 ATCC19615 Streptococcuspyogenes

＊_{Tt(min)denotesthe amplfication time required forthe threshold value (0.07)ofthe velocity ofturbidity increase on}

LA-320C,Loopamp real-time turbidimeterto be exceeded.

東邦大学医学部微生物・感染症学講座にて保存され た肺炎症状を示す臨床患者由来の喀痰（179 例），気 管吸引液（14 例），咽頭ぬぐい液（5 例），胸水（3 例）， 尿（2 例），肺刺（1 例）計 204 例の検体を用いた．Fig. 2Aに示すように，QIAamp DNA mini kit（QIAGEN 社）を用いて，各呼吸器検体試料 100µL から，50µL の抽出 DNA を調製した．95℃，5 分間熱処理し，急 冷後，LAMP および PCR 反応液に加熱 DNA 抽出液 として添加した． また，上記 204 検体のうち，86 検体の保存培養液 を簡易な方法に供した．各保存培養液 500µL を遠心 し，上清を除去後，沈渣に TE 緩衝液 50µL を添加し， 95℃，5 分間熱処理し，急冷後スピンダウンし，LAMP および PCR に加熱 DNA 抽出液として添加した（Fig. 2B）． 成 績 1．感度試験 M129 株から抽出した genomic DNA を段階希釈 し，LAMP 法および二種類の nested PCR の検出感 度 を 比 較 し た．そ の 結 果，LAMP 法 は M129 株 の

Fig. 1 Nucleotide sequence ofM.pneumoniaeSDC1 repetitive element(M35024)used to design the LAMP primers.DNA sequencesused forthe primerdesigning are shown by the solid arrows.The restriction site forHinfI,located between F1 and B1,isindicated by the dotted box.And the oligonucleotide sequence of the LAMP primersforM.pneumoniaeSDC1 detection are shown in the solid-line box.

genomic DNA に対して 6 コピーまで増幅反応を確認 できた（Fig. 3A）．それに対して，16S rRNA 遺伝子 を検出する nested PCR は，1st PCR では 60 コピー， 2nd PCR では 6 コピーまで，p1 遺伝子を検出する nested PCR では，1st PCR では 60,000 コピー，2nd PCR では 60 コピーまで検出された（Fig. 3B）．なお， 成績を示さなかったが，FH 株から抽出した genomic DNA を同様に試験した結果，M129 株と同一の成績 だった． さらに，M129 株由来の LAMP 増幅領域を挿入し た plasmid DNA を段階希釈し，LAMP の検出感度を 試験したところ，6 コピーまでの plasmid DNA に対 して増幅反応が確認できた（Fig. 4）．なお，成績を 示さなかったが，FH 株由来の plasmid DNA を同様 に試験した結果，M129 株と同一の成績だった． 2．特異性試験 M. pneumoniae 10 株からそ れ ぞ れ 抽 出 し た 加 熱 DNA 抽出液（反応あたりの供試鋳型量：60 コピー） を LAMP 法で測定した反応結果を比較したところ， LAMP 反応開始後，すべての株において約 20 分経過 時からの増幅が確認され，陽性と判定された．各株の Tt 値（濁度上昇速度が，一定のしきい値を超え，リ アルタイム濁度測定装置 LA-320C が陽性と判定する 時間）は，23∼30 分の範囲であった．得られた LAMP 増幅産物および制限酵素 Hinf Iによる増幅産物の消化 物の電気泳動パターンは供試株間ですべて同一であっ た（Fig. 5）．また，M. pneumoniae以外の Mycoplasma 属菌 5 菌種 5 株，細菌性肺炎起因菌など 28 菌種 28 株 については，十分量の鋳型量（反応あたりの供試鋳型 量：600,000 コピーあるいは 600,000CFU）を試験して

Fig. 2 ProtocolsforDNA extraction from (A)respiratory specimensand (B)PPLO cultures.

Table 2 Composition ofthe LAMP reaction mix mM (pH8.8) 20 Tris-HCl mM 10 KCl mM 10 (NH4)2SO4 mM 8 MgSO4 % 0.1 Tween 20 M 0.8 Betaine mM each 1.4 dNTPs pmol 40 FIP pmol 40 BIP pmol 10 F3 pmol 10 B3 pmol 20 LoopF pmol 20 LoopB Units 8

BstDNA polymerase

μL 20 Volume も，すべて LAMP 陰性であった．さらに，反応時間 を 120 分まで延長しても増幅反応は確認されなかった （Table 1）． 3．臨床患者検体を用いた相関性試験 前述の感度試験において，検出感度が十分に高かっ た 16S rRNA 遺伝子を標的とした nested PCR の 1st PCR を対照とし，臨床患者から採取された呼吸器由 来 204 検体から QIAamp DNA mini kit を用いて調製 した加熱 DNA 抽出液を用いて，LAMP 法との相関 性を検討した．その結果，24 検体（11.8％，すべて喀 痰検体）が LAMP 陽性と判定され，増幅産物の電気 泳動パターンは 24 検体すべて同一であった．また， 16S rRNA 遺伝子を検出する nested PCR の 1st PCR による結果も 24 検体が陽性と判定され，LAMP 陽性 となった 24 検体と一致し，陰性と判定された検体も 含めて不一致はまったく認められなかった（Table 3）． 一方，86 検体の保存培養液から簡易な方法で抽出 した加熱 DNA 抽出液についても，同様に LAMP 法 と PCR 法の相関性を試験した．その結果，19 例（す べて喀痰検体由来）が LAMP 陽性と判定され，同時 に行った 16S rRNA 遺伝子を検出する nested PCR の 1st PCR による判定と完全に一致した．しかし，86 検体の保存培養液には，LAMP 法および PCR 法で陽

Fig. 3 Comparison ofsensitivity between LAMP (A),16S rRNA nested PCR (B)and p1 nested PCR (C)using serialdil u-tionsofM.pneumoniaeM129 genomicDNA.Lanesand Symbols:Lane1/ ● ;600,000,Lane2/ ■ ;60,000,Lane3/ ▲ ;6,000, Lane4/ ◆ ;600,Lane5/ ○ ;60,Lane6/ □ ;6,Lane7/ △ ;0.6,Lane8/ ◇ ;0 (copies/test),and LaneM1;100bp DNA ladder, LaneM2;λ-Hind IIIdigest

Fig. 4 Sensitivity ofLAMP using serialdilutionsofplas mid DNA including the targetregion from the M.pneu moniaeM129 genomicDNA.

Symbols:● ;600,000,■ ;60,000,▲ ;6,000,◆ ;600,○ ;60, □ ;6,△ ;0.6,◇ ;0 (copies/test)

Fig. 5 Agarose gelelectrophoresisand restriction analy sis of the LAMP products amplified from several M.

pneumoniaestrains.

Lane1;NBRC14401 (FH), Lane2;ATCC15492 (Mac), Lane3;ATCC29342 (M129), Lane4;ATCC15531 (FH), Lane5 and Lane6;clinicalisolates,LaneM;100bp DNA ladder, 性判定だった 24 検体の呼吸器由来検体を培養した保 存培養液がすべて含まれていたにもかかわらず，24 検体中 5 検体の保存培養液（すべて喀痰検体由来）は LAMP 法および PCR 法ともに陰性だった． 考 察 Mycoplasmaは人工培地上で自己増殖能を示す最小 の微生物であり，コレステロール源としてウマ血清を

Table 3 Resultsofdetction forM.pneumoniaefrom clni -calsamplesby LAMP and PCR.

PCR ＊_{(＋ )}

LAMP (＋ ) n

Respiratory specimen

(%) n (%) n (11.8 %) 24 (11.8 %) 24 179 sputum ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 14 trachealaspirate ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 5 pharyngealswab

( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 3 pleuralfluid ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 2 urine ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 1 transthoracicneedle aspirate

(11.8 %) 24 (11.8 %) 24 204 PCR ＊_{(＋ )} LAMP (＋ ) n

PPLO culture from specimen

(%) n (%) n (22.1 %) 19 (22.1 %) 19 78 sputum ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 1 trachealaspirate ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 4 pharyngealswab

( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 1 pleuralfluid ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 1 urine ( 0.0 %) 0 ( 0.0 %) 0 1 transthoracicneedle aspirate

(22.1 %) 19 (22.1 %) 19 86

＊_{1stPCR ofnested-PCR targeting the 16S rRNA gene}

含む PPLO 液体培地などを用いて，患者検体から分 離培養することが可能である．口腔内に常在する M. salvariumや M. oraleなどと鑑別するため，M. pneumo-niaeの特徴的なコロニー形態の確認をはじめ，染色， 血球吸着能，溶血反応，ブドウ糖およびアルギニン分 解能などを試験する必要がある３） ．この分離培養法は 確定診断となる方法であるが，培養のため長期間を要 し，同時に煩雑な操作も必要とされる．M. pneumoniae の表面抗原を検出する直接蛍光抗体法１５） は迅速性に優 れているが，観察に蛍光顕微鏡と試験者の経験が必要 であるため，実施施設が限定される．PA 法（粒子凝 集反応）や CF 法（補体結合反応）など患者血清中の 抗体価を指標とする血清学的検査法が広く行われてい る．しかし，免疫応答まで十分な時間（約 1 週間）を 要することと，急性期と回復期のペア血清での診断が 望ましいが，単一血清での診断を行わざるを得ない場 合も多い．イムノクロマト EIA 法による IgM 抗体検 出法は，操作も簡便で感染初期の診断が可能とされる が，発色反応時間の違いで陽性率に大きく差が生じ る１６） ．遺伝子診断法として，DNA プローブ法から PCR 法へと感度および特異性を高めた方法が開発され，診 断法として現在広く使われている．さらに定量性を求 めたリアルタイム PCR７） も開発されている．しかし， 日本呼吸器学会によって 2007 年に策定された「呼吸 器感染症に関するガイドライン」成人市中肺炎診療ガ イドラインにおいて，上述した従来の方法はすべて， 「手技が煩雑，あるいは特定の機器，施設が必要な検 査」と分類されており，検査法として問題点が指摘さ れていた． 今回我々は M. pneumoniaeを検出するための LAMP プライマーを設計する段階において，検査における特 異性と感度を高めるため，宿主細胞への吸着に関与す る細胞接着器官（attachment organella）１７） を構成する タンパクをコードする遺伝子群に着目した．M. pneu-moniaeの細胞接着器官は，先端に位置する P1 をはじ め，複数のタンパクで構成されており，各タンパクを コードする遺伝子は p1，hmw，crl の 3 つの各オペロ ン上に位置している１８）∼２０） ．M. pneumoniaeには繰り返 し配列が多く，全ゲノムの約 8％ を占めるが，標的遺 伝子とした SDC1 配列も繰り返し配列のひとつであ り，p1 オペロン内にある ORF6 遺伝子上に存在する． この SDC1 に存在する M. pneumoniaeに特異的な塩基 配列を LAMP 法の標的とした． 今回設計した LAMP は，M. pneumoniaeのみに特異 的に反応し，M. pneumoniaeと近縁で相同性が高いこ と が 知 ら れ て い る M. genitaliumを 含 む 他 の Myco-plasma属菌および多くの細菌性肺炎起因菌などに対 しては全く反応を示さなかった．また，M. pneumoniae の p1 遺伝子の塩基配列によって分類される I 型菌お よび II 型菌に対して，いずれも迅速な反応速度と非 常に高い検出感度を示した．これは，特異性が極めて 高いと同時に，M. pneumoniaeの型に左右されない検 査法として，非常に適した標的遺伝子の選択，および プライマーの設計ができたものと考えられた．感度に ついては，標的とした SDC1 は繰り返し配列のひとつ であることから，高い検出感度が実現できるものと当 初期待された．しかし，LAMP 増幅領域を 1 コピー ずつ含む plasmid DNA と比較して，全長の genomic DNA を 用 い た 検 出 感 度 に 差 は な か っ た．こ れ は， SDC1およびその類似配列のコピー数は染色体上に少 なくとも 8 コピーとそれほど多くないこと，またはプ ライマーの特異性が高いため，SDC1 の類似配列には 反応性を示さないことが要因として推測される．迅速 性については，基本となる 4 つのプライマー（FIP， BIP，F3 および B3）に，増幅反応を加速させるルー ププライマー（FL および BL）を追加したことによ り，反応開始後 30 分以内という短時間内に増幅およ び検出することが可能であった．斉藤らによって p1 遺伝子を標的としたプライマーによる M. pneumoniae 迅速検出 LAMP の報告２１） があるが，本法がより反応 時間が速く，検出感度も高かった．これは，本法の基 本となる 4 つのプライマーの有する高い反応性，さら に F 側および B 側の両方にループプライマーを設定 されていることが要因と考えられる． 喀痰など臨床患者から採取した呼吸器検体を用いた 相関性試験では，LAMP 法と PCR 法の結果は 100％

（204 例中 24 例が，LAMP および PCR ともに陽性）一 致し，良好な相関性が認められた．同様に，培養液検 体を用いた相関性も良好な結果が得られた．ただし， 喀痰などもととなる呼吸器検体では陽性であったが， 接種して培養を経過した培養液では陰性化する検体が あった（24 例中 5 例）．データには示さないが，これ ら陰性と判定された 5 例の抽出検体に検出感度付近の 少量の plasmid DNA を添加して LAMP 反応を試験 する方法で，検体そのものによる反応阻害の影響を検 討したが，すべて 60 分以内に良好な反応を示した．こ れは，今回検討した培養液からの簡易抽出法は，LAMP 反応を阻害する物質を除去できていることを示した． このことから，培養液検体で陰性化した例は，もとと なった喀痰などの臨床検体から十分に培養・増殖され なかった，もしくは簡易な抽出法による回収率が低 かったことが考えられた．一般的に喀痰は Mycoplasma 属以外の雑菌を多く含み，喀痰成分の影響もあり，分 離同定を目的とした培養にはスワブ採取による咽頭拭 い液のほうが適しているとされている．今回の検討で は，臨床患者検体のほとんどが喀痰検体であったが， マイコプラズマ肺炎検査の対象として広く用いられて いる咽頭拭い液を中心とした臨床患者検体について検 討を行い，最適な抽出法との組み合わせについて今後 精査していく予定である． LAMP 法は，6 つのプライマーと強力な鎖置換活性 を有する DNA 合成酵素との組み合わせにより，高い 特異性と感度を示す増幅反応と反応液の濁度上昇を指 標とした判定を，ひとつの閉鎖系で行うことを可能と している．しかも 65℃ を維持できる恒温装置だけで も実施可能であり，検査に必要とされるトータルコス トを抑える効果も大きいと考えられる．既に市販され ている LAMP 法によるキットと同様に，あらかじめ プライマー，基質などを含む反応液に DNA 合成酵素 を追加し，抽出検体を添加後，反応を開始できる簡便 な操作性を実現できるため，従来の検査法と比較して 「精度が実施者の経験に左右されにくい」検査法であ ると言える．以上のことから，早急に適切な治療を迫 られる現場において，本法は非常に有用な試験法と考 えられた． 謝辞：貴重な臨床患者検体，菌株の御提供，ならびに御 助言をいただきました学校法人東邦大学医学部 山口惠三 教授，舘田一博助教授，国立感染症研究所 佐々木次雄先 生，KKR 大手前病院中央検査部 山中喜代治先生，神奈 川県衛生研究所 岡崎則男先生に深謝いたします． 文 献

1）Ishida T：Etiology of community-acquired pneumonia among adult patients in Japan. Jpn J Antibiot 2000；53：3―12.

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Sensitive and Rapid Detection of Mycoplasma pneumoniae by Loop-mediated Isothermal Amplification Manabu YOSHINO, Toshimitsu ANNAKA, Tadashi KOJIMA & Masanari IKEDO

Eiken Chemical Co., Ltd. Biochemical Research Laboratory

For establishment of a method for rapid diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens, we designed and evaluated a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay, using a set of primers tar-geting the SDC1 repetitive element of the M. pneumoniae genome.

The method showed rapid and specific amplification for all the strains of M. pneumoniae tested (Type I and II), within 1hour at 65℃.

No cross-reactivity with the most common causative organisms bacterial pneumonia was observed. The detection limit was shown as 6 copies, which was equal to or higher than that of the two nested PCRs used as references.

Two hundred four clinical samples, comprising sputum samples, throat swabs, etc., were tested by both LAMP and PCR, and determination of the correlations revealed complete agreement individually (24 posi-tives).

The LAMP assay, a simple procedure in a closed system, allowed rapid amplification and accurate de-tection consistently ; therefore we considered that it could become an caeasily available diagnostic method suitable for clinical situations requiring quick and appropriate decisions for treatments and care.