第 1編
6
0
0
全文
(2) 前. 576. 田. 正. 利. 着 実 験)次 に 経 時 的 に感 染 細 胞 及 び 維 持培 養 液 を 別. 実. 々に 集 め,そ れぞ れ の含 有 す る ウ イ ル スの 感染 価 を TCID50で. 算 定 し,細 胞 内 ウ イ ル ス(Cell. Virus)細. 胞 外 ウ イル ス(Free. associabed. Virus)の. 量的変化を. のCS細. 胞(細 胞 数. 吸着 実 験. は5×106bottle)を. 培 養2〜3日. 感 染 に 用 い た.ウ イ ル ス接 種 す. 成. 績. Coxsackie B5 VirusのCS細. 先 づCS細. 胞 にCoxsackie. 般 に 特 有 のC. P. E.を. 測 定 した. a). 1). 験. 胞 に よ る増殖. B5を 培 養 す ると,一. 起 し て 増 殖 す る.若 い時 期. の 累代 で は通 常C. P. E.を 惹 起 す る に3〜4日 した が, CS細. を要. 胞 に馴 化 す る に 伴 な い, 2〜3日. で. るに 際 し,予 め陳 旧 培 養 液 を 除 き,細 胞 層 を 数回. 著 明 なC. P. E.を. PBSで. る.従 つ て 馴 化 に よ り,細 胞 変 性 も高 度 とな り,感. 洗 滌 した.続 い て 維 持 培 養 液 で適 宜 に稀 釈. し た ウ イ ル ス液 を 接 種 す る.37℃. で1時 間 孵 卵器. 内 に 保 存 放 置 して 充 分 に 吸 着 せ しめ た る後,接 種 ウ イ ル スを 除 き,更 に残 存 す る未 吸 着 ウ イル スを 除 く た め に,冷 却 したPBSで し て 行 な い,そ 12.0ml/bottleを. 細 胞 洗 滌 を4〜5回. 反覆. の 後 に 新 し い 維 持 培 地10.0〜 添 加 して培 養 を 続 け た.従 つ て ウ. イル ス接 種 時 が 感 染 時 間0で あ り,洗 滌 に要 し た時 間 は感 染 時 間 に 含 ま な い.. 発 現 し,細 胞 は 管 壁 よ り脱 離 す. 染 価 も上 昇 す る傾 向 が あ る.こ の 事 実 は, CS細. 胞. の適 応 と一 応 推 測 出 来 る. 又C. P. E.に. 就 い て は既 に他 の細 胞 を用 い た実. 験 成 績 と良 く類 似 す る.即 ち試 験 管 で 培 養 した もの を 弱 拡 大 で 観 察 す る に,先 づ細 胞 の 円形,又 は類 円 形 に変 化 す るが,培 養後48時 間 で大 部 の細 胞 が扁 平 な 印 象 を受 け る様 にな り,そ れ ぞ れ の細 胞 の周 囲 に 細 胞 の 破片 を 思 はす 小 体 を 多 数 附 着 し,ポ リオ と比 較 して 非 常 に 汚 く見 え る も のが尠 くない.是 等 の変. 増 殖 実験 で は,大 量 の細 胞 を用 い て 同時 感 染 に よ る1回 増 殖 実 験 を 行 な うた め に,ウ イル スの 大 量 接. 性 細 胞 は 徐 々に 管 壁 よ り脱 離 して 来 る. 尚CS細. 胞 に 累 代 を 重 ね に従 い,前. に 認 めた. 種 が必 要 で あ るが,こ の 実験 で は, 5×106.0の 細 胞. C. P. E.の. に 対 し, 106.0TCID50/bottleの. な り円形 化 した細 胞 が次 第 に増 加 す るが,細 胞 周辺. ウ イル ス を接 種 した. か ら, Multiplicity 5で あ る. b). の細 胞質 の破 片 と推 測 され た小 体 の附 着 が尠 くな る. ウ イ ル ス の感 染 価 測定 ウ イ ル ス の感 染 後 時 間. を お き,得 られ た感 染 細 胞 を 集 め,凍 結 融解 を再 三 行 な い,ウ イ ル ス の遊 出 に努 め, 1 bottleの 内 容 を 1.0mlの 5Minの. ウ イ ル ス浮 游 液 と し て, 1,500r.p.m.. 釈 毎 に1.0ml宛 して, 37℃. を4本 の試 験 管 内培 養 細 胞 に接 種. で 静 置培 養 を 行 な つ た.ウ イ ル ス接 種. 後 毎 日細 胞 変性 効 果(C. P. E.)の 感 染 価 はTGID50に 日後 のC. P. E.に. 出現 を 記 載 し,. よ り表 示 して,最 後 の 判定 は7 拠 つ た.. 培 養 液 内 ウ イル スのTCID50は 細 胞 維 持培 養 液 の1,500r.p.m.. 各 時 間 如 の感 染 5Minの. 遠 心上 清. り稀 釈 し,以 下 は 時 間 を 追 つ て細 胞 内 ウ. イル ズ の定 量 と同 様 に実 施 した. 尚, Virus Yieldは 上記 の 方 法 に よ り各 時 間毎 に, 培 養 液 内 又 は細 胞 内 ウ イル ス を定 量 して そ れ ぞ れ の 場 合 のTCID50を 均 値 を得per 示 し た.. か,又 は認 め られ な くな る傾 向 が あ る. これ 等 のC. P. E.を 感 染 標 識 として,累 代 毎 に感 染 価 を測 定 し比 較 した.(第1表) この成 績 で はCS細. 胞 初 代 に於 い て104.5と 感 染. 遠 心上 清 を原 液 と定 め た.次 で維 持 培 養 液. で ウイ ル ス原 液 の10倍 階段 稀 釈 の系 列 を作 り,各 稀. 1.0mlよ. 所 見 が 多少 変 り,細 胞 の間 隙 を生 じ疎 と. 求 め て お き,そ れ ぞ れ の総 和 の平. cell当 りのVirusのyieldと. して 表. Table. Ⅰ. Infective. titer. Virus. strain. on. of CS. Coxsackie celle. B5.
(3) 組 織 培 養 に よ るCoxsackie. 価 を示 し, C. P. E.は. 尚4〜5日. を要 す る も,次 第. B5. Virusに. Fig.. Ⅰ. Growth. に累代 を重 ね る に従 い,感 染 価 の 上昇 を 辿 り而 も. strain. C. P. E.発. ml). 来 日数 も短 縮 され る. 15〜20代 の累 代 に. 577. 関 す る研究. curve CS. of. cells. Coxsackie. B5. (lnoculum. dosis:. virus. on. 104.0/. よ り,全 く感 染 価 は 安 定 し, 106.0程 度 を保 持 し, C. P. E.も. 従 つ て2〜3日. す るにCS細. で著 明 に認 め られ る.要. 胞 は,従 来 用 い られ た 既 知細 胞 株 と比. 較 して,い さ さ か も遜 色 の な い 感受 性 を示 す こ とが 示 唆 さ れ た. 2). 光学 顕 微 鏡 上 の所 見 と ウイ ル ス増 殖. 予 め短 冊 状 に裁 つ た カバ ー硝 子 を培 養 管 に用 意 し, Coxsackie B5を 感 染 せ しめ て,細 胞 変 化 を窺 つ た. 累 代10代 以 上 の場 合 は早 く細 胞 変化 が 発来 し,細 胞 の離 脱 を 招 くの で,詳 細 に観 察 す る こと が 困難 で あ. Remarks:. 1.・. ― ・― ・― ・C―A―V.. る.よ つて 比 較 的 長 時 間細 胞 を維 持 す る 目的 で,接 種 ウイ ル ス量 を 加減 し, 100TCID50/mlの. (Cell. Associated. ウ イル ス. 2.……F.. V (Free. Virus) Virus). を感染 させ て,検 討 を 行 な つ た.と 同時 に 同時 期 の ウ イル ス量 の 量 的変 化 と消 長 を知 る意 味 か ら,そ れ ぞ れの 時 間毎 に感 染 価 の 測定 を 行 な い,表 示 比 較 し. ウ イル ス の増 殖 形 式 を 窺 うに, CS細. 胞 に感 染 後 ウ. イル ス の 増殖 は概 ね8.10時 間 を 経 て始 り, 12〜16時. た(Fig. Ⅰ).先 づ 光 学 顕 微 鏡 上 の所 見 であ るが,. 間 で 激 しい増 加 が細 胞 内で 惹 起 す る.こ の時 間で は. H‑E染. 細 胞 の変 性 が多 少 と も認 め た 時 期 で あ り,細 胞 外 え. 色 標 本 で は,細 胞 の ウ イ ル ス 感 染 後10時 間. 迄 に於 い て は,細 胞 の配 列 が や や不 明 と な り,稀 に 間 隙を 生 ず る程 度 で あ るが, 14〜16時 間 を経 過 す る と俄 か に細 胞 の収 縮 に伴 な う細 胞 間 層 の 間 隙 が著 明 と な り,配 列 は乱 れ る に至 る.細 胞 の シ ー トの端 に 位 置す る細胞 は 円形 若 し くは 類 円形 の細 胞 が 出現 す る.而 も斯 る細 胞 群 に あつ て は 細胞 質 内 に エ オヂ ン に好 染 す る封 入 体 の 出現 が 認 め られ る. 75時 間 に至 ると,細 胞 の脱 落 は可 成 り激 し くな り,細 胞 間 は激 し く疎 とな り,残 存 す る細 胞 そ れ ぞ れ は,次 第 に形 状 を変 え,核 周 辺 の エ オヂ ン濃 染部 が 明 瞭 とな る も のが 増加 の気 配 を示 す.エ オ ジ ン濃 染 部(小 体)の 存在 位 置 は核 に近 接 して い て,明. らか に 円形 又 は類. 円形 の 小体 と して認 め られ,漸 次 そ の 部分 が エ オヂ ン染 色 の 濃度 を増 す 傾 向 が あ る.こ の 傾 向 は時 間 の 経過 と共 に増 々強 くな り,封 入 体 の存 在 す る部 分 と 細 胞 質 の 間 が生 ず る もの が 認 め られ た.こ の所 見 は 100時 間 を経 る と,次 第 に 波 及 して,視 野 全 般 に亘 り観 察 され る に至 つ た.而. し乍 ら細 胞 の全 部 の離 脱. に は時 間 を要 し,漸 次 細 胞 の脱 落 を惹 起 しつ つ も, 全般 の脱 離 に は3〜4日 としたHela細. 胞, FL細. を要 す る.こ の所 見 は対 照 胞 と も に殆 ど同 様 な 変 化. を認 め た.. の 游 出 も当然 認 め られ る. 次 の20〜24時 間 では ウ イル スの量 的 変化 は余 り見 られ な い が,細 胞 の変 性 は募 り,封 入 体 の散 見 せ ら れ る時 期 に該 当 す る. 72時 間 に至 れ ば,ウ. イル ス の. 増 量 は ピー ク に 達 し,そ れ ぞ れ106.0, 105.2と 示 さ れ,細 胞 の 脱 落 は著 し く,エ オ ジ ン濃 染 部(小 体) の著 明 な 増 加 を誘 発す る.こ の時 期 を 過 る と ウ イル ス の量 は 次 第 に減 量 の一 途 を辿 るか の如 くに,曲 線 は下 降 す る.細 胞 変 化 の上 で は,細 胞 の脱 落 な甚 し く,細 胞 の 変 性 の 程 度 も亦 激 しい も のが あ る.残 存 した細 胞 の形 態 は 変 化 し,エ オ ヂ ン に濃 染 し た部 分 に細 胞 核 が 浮 き 出た 感 が あ る もの,核 は濃 縮 され 圧 迫 され て エオ ヂ ン濃 染 部 の み に 占 め られ て い る も の, 等 の所 見 が 広 い視 野 に拡 が つ て 認 め られ た.こ れ ら ウ イル ス の量 的 変 化 に つ い て は 次 に検 討 され るが, 一 般 に ウ イル スの 増殖 様 式 は,略. 々細 胞変 性 の程 度. に応 じて 惹 起 す る こ とが 推 測 され た. 3). 増 殖 曲 線 に認 め る細 胞 内 ウ イル ス量 の 消長. 多 量 のCS細 染 せ しめ て,ウ. 胞 に比 軟 的 ウイ ル スの 大 量 を 同時 感 イル スの 細 胞 内 ウ イル ス量 の 消長 を. 窺 つ た 成 績 で あ る.ウ イル スの 細 胞 え の 吸 着 後一 定 の ウ イル ス増 殖 休 止 時 期(2〜4時. 間)を 経 て,増. 次 に これ らの 所 見 と,平 行 して行 つ た ウイ ル ス増. 加 す る.そ の 際 の増 殖 曲線 は,先 の 感 染 実験 と比 較. 殖 実験 に於 け る所 見 と は,相 関 連 し て ウ イ ル ス の. し て急 激 で あ り,時 間 を 経 る に従 い上 昇 の 程 度 は 著. CS細 胞 に於 け る増 殖 過 程 を も窺 い 得 られ た(Fig. Ⅰ). し い事 実 が認 め られ た(Fig.. Ⅰ).
(4) 578. 前 Fig. Ⅱ.. Growth strain. curve CS. of. Coxsackie. B5. Virus. 田 on. 正. 利. 間 で は ウ イル ス吸着 時 期 か ら2〜6時. 間で は,ウ イ. ル スの増 量 は極 めて 緩 慢 な 経過 で あ り,全 くウイル. cells. ス量 の上 昇 が 認 め られ な い 時 期 で あ るが,細 胞 内増 殖 時期 か ら見 て, 8〜10時 間 で 急激 に増 加 した ウ イ ル ス は感 染 性 新 ウイル スで あ る こと は理 解 し得.る. そ の後 に於 い て は6〜10時. 間 に お け る急 激 な ウイル. ス量 の増 加12時 間 か らの 緩 い 曲 線, 20時 間 か らのや や 緩 い下 降 の 曲線 等 を 考 慮 して ウ イル ス増 殖 の第 一 周 期 は10時 間で あつ て,次 の12時 間 よ り,第 二周 期, 更 に第 三 の周 期 が 反 覆 して 繰 返 され る もの と判 断 さ れ た(Fig.. Ⅱ).. これ ら の所見 に よ り,各 時 間 毎 に 細 胞 内外 の ウイ ル ス感 染 価 を そ れ ぞ れ に表 示 し,そ の 感染 価 の平 均 Fig.. Ⅲ. Growth strain. curve CS. of. Coxsackie. B5. Virus. on. cells. 値 を求 め てper. cell当 りの ウ イ ル ス のYieldを. 出す る と, 5,500〜6,000TCID50と. な り, CS細. で は可 成 り高 いVirusのYieldを. 算 胞. 示 す もので あ る. ことが 認 め られ た. こ の実 験 は繰 返 し3回 全 様 な条 件 を 行 な つ たが, 殆 ど 同様 な成 績 を 得 た.只. ウイル スの 吸 着 よ り6〜. 8時 間 に至 る第1周 期 ま で に,ウ イル ス量 の上 昇 の 緩 慢 な時 期 が あ り,接 種 ウイ ル スの 末 吸 着 の残 存 が 考 え られ る ので,こ. の 時 期 を選 び, PBSで. 滌 した後 に, B5家 37℃1時. 兎 抗 血 清10倍. 反覆洗. 稀 釈 を 用 いて,. 間処 理 し,あ とで 同様 な 感染 価 の 測定 を. 行 な い確 め た(Fig. Ⅳ). Fig. Ⅳ.. Growth strain. curve CS. cells. of. Coxsackie. (Inaculum. B5 dosis. Virve. on. 106.0/ml). この実 験成 績 で も,殆 ど同 様 な感 染 曲線 が 得 られ た.そ の結 果 残 存 ウイ ル スを1.0/bottle以. 内に まで. 抑 え られ る こ とが証 明 され た. 総 括 及 び 考 按 Coxsackie B5とCS細. 胞 系 の レベ ル に於 いて,感. 染 とそ の 過 程,同 時 感染 に よ る一 段 増殖 実 験 を 試 み, CS細. 胞 を特 に 用 い た 意 義 を 明 らか に した.既 に. Coxsackie B5に 対 して 特有 な感 受 性 を有 し,特 異 な C. P. E.を. 発 現 し て 来 る事 実 は俵 等(1964)9)の. 載 に 詳 しい が, CS細 代 され,而. 記. 胞 が 分 離 以 来 比 軟 的 容易 に 累. も安 定 した 細 胞 系 で あ る ことを 認 めて い. たの で,実 験 が 円 滑 に 進 行 した こ とも,指 摘 され る Remerka:. 1・ ― ・― ・― ・C―A―V. (Cell. associated. virue) 2……(Free. 4). 形 態 学 的 変 化 と,そ れ に 附 髄 す る ウイ ル ス増殖 の過 virue). 細 胞 外 に 游 出す る ウ イル ス量 の 消 長. 培 養 液 中 に 游 出 す る フ リー ウ イル ス(以 下F‑V と記 す)の 増 加 は8〜10時. 利 点 で あ つ た.又 感 染 細 胞 の経 時 的 な る観 察 に よ る. 間 の間 に あ り, 10時 間 で. は 著 し く104.0と 急 激 に増 加 す る.そ の間 に至 る時. 程 が 比 較 的 良 く一 致 した 形 で 捉 え られ た.即 ちCS 細 胞 に累 代 さ れ たCoxsackie. B5は 約20代 の 累 代 に. よ り安 定 した 感 染 価 を 示 す に 至 り, 106.0と 表示 さ れ る.そ の後 の 累代 に よ り感 染 価 の動 揺 は殆 ど認 め られ な い.と. 同時 にC. P. E.の. 発 現 が 著 し く迅 く.
(5) 組 織 培 養 に よ るCoxsackie. B5 Virusに. 579. 関 す る研 究. な り,詳 細 に 形 態学 的所 見 を窺 い得 な い の で,ウ イ. し,特 異 な 細 胞変 性 作 用 を 発 揮 して 増 殖 す る こ とが. ル ス使 用量 を100TCID50と. 注 目 され た,そ の大 要 を要 約 す れ ば 次 の 如 くで あ る.. 定 めて 感 染 を 行 な い,. 感 染過 程 を追 跡 し た.そ の所 見 で は一定 の潜 伏 期 を. 1). Goxsackie B5 Virus対CS細. 胞 の感 染 形 式 に. 経 て,細 胞 の軽 度 の変 性 の発 来 が 窺 い得 られ,細 胞. よ り,強 い 感受 性 を示 して 増 殖 し細 胞 の形 態学 的 変. 変 性 作 用 は72時 間迄 に 著 明 に進 行 を続 け る.ウ イ ル. 化 と ウ イル ス増 殖 の過 程 は比 較 的 一 致 した 成 績 を 発. スの増 殖 も亦 これ に平 行 てて 増 量 し,ピ ー クに 達 す. 揮 した.と もに ウイ ル ス感 染 後72時 間 に して 細 胞 変. る.こ の間 のCoxsackie. 性 と感 染 価 は 高 度 とな り,細 胞の 漸 次 脱 離 と共 に ウ. B5の 発育 の場 は 明 瞭 に,宿. 主 細 胞質 に限 定 され る.即 ち エオ ヂ ン濃 染 部(小 体). イ ル スの 感 染 価 は減 少 した.. は初 め薄 い エ オ ヂ ン好 染 性 部 分 の次 第 に 発展 し,核 の周 辺 に エオ ヂ ン濃 染 小 体 と して 発 現 す る.こ の小 体 は 細 胞質 内 に限 局 した形 で,明. らか に 細 胞質 と 区. 2). CS細 胞 の大 量 を 用 い,ウ. イル ス量 を増 量 し. て 同時 感 染 を 成 立 せ しめ て 行 な つ た一 段 増 殖 実 験 で は,一 定 の エ ク リ ップ ス の時 期(4〜6時. 間)を 経. 別 され る もの で あ る.こ れ らの 所見 は 明 らが に ウ イ. て,一 段 増殖 の周 期 は約16時 間,爾 後反 覆 して 感染. ル スの増 殖 を 推 測 され る もの で あ る.. に伴 な う周 期 が あ る もの と推 定 せ られ た.新 生 ウ イ. 次 に大 量 の細 胞 に,ウ イル スを 同 時感 染 させ て 行. ル スの 液 層 内え の游 出 は, 7時 間 で始 り,細 胞 内新. なつ た 一段 増 殖 実 験 で は,増 殖 曲線 の示 す 如 く,エ. 生 ウ イル ス の 増加 と前 後 し,非 常 に早 く進 行 す る も. ク リップ ス期 は約6時 間 一 段 増殖 周 期 は 約16時 間で. の と判 断 され た.. あつ て,液 層 内 に ウ イル ス の游 出 は,細 胞 内新 生 ウ. 稿 を 終 るに 当 り,始 終 御 教 導 と御 鞭 撻 を 受 け,而. イル スの 出現 時 間 と殆 ど 同時 に増 量 す る点 か ら見 て,. も御 校 閲 の労 を給 つ た 村 上 教授 並 び に御 支 援 を頂. 新生 ウ イル ス の 細 胞 外 え の游 出 は可 成 り早 い もの と. い た藤 原 博 士 に 厚 く感 謝 の 意 を表 す 次第 で あ る.. 推定 され た. 結 CS細. 論. 胞 を 用 いて, Coxsackie B5 Virusの 増 殖 機 構. を検 討 した.そ の結 果CS細. 胞 は 高 い感受性を示. 参 1). Sickles.. G.. Med. 2). 3). 95. Duncan. D,. 1〜8. 1955.. Wiet.. J.. Dunean 〜63. et.. al.:. et.. Proc.. soc.. exp.. Biol.. D, et. 献 5). al.:. al.:. al.:. Canad.. J.. Canad.. Canad.. Weller. 97. J.. Pub.. pub.. Hlth. Hlth. 46. 47. 1956.. 1954. 文. 1957'. C. et.. 433〜437 4). M.. 637〜639. 考. J.. pub.. Hlth. 45. 55. T.. H. et. al:. J.. Immunol.. 71:. 92〜. 1953. 6). 甲 野 他:第. 八 回 日 本 ウ イ ル ス 学 会 演 説 要 旨.. 7). 日 沼 他:第. 九 回 日 本 ウ イ ル ス 学 会 演 説 要 旨.. 8). 坪 崎 他:第. 九 回 日 本 ウ イ ル ス 学 会 演 説 要 旨.. 9). 俵.内. 海.水. 第2号1964.. 原.山. 本.:医. 学 と 生 物 学 第68巻.
(6) 580. 前. Studies Part. 1.. A. on. Study. Coxsackie on. 田. 正. 利. B5. Virus. by. the Infection. B5 Virus. in Dog. and. Tissue. Cultures. Multiplication. Kidney. of Coxsackie. Cells. By Masatoshi Department. of Microbiology,. Okayama. MAEDA University Medical School, Okayema. (Director: Prof. Sakae Murakami) Author's. Abstract. The mechanism of infection and of multiplication of Coxsackie B5 virus was studied using dog kidney cells (to be abbreviated CS cells). As the result it has been found that Coxsackie B5 virus has a high susceptibility to CS cells and proliferates by demonstrating a specific cytopathic effect. The results may be summarized as follows. 1. In the infection pattern of Coxsackie B5 virus to CS cells, the virus is found to proliferate with a high susceptibilityto thecells. In addition, morphologioal changes of the cell and the course of virus multiplication parallel relatively well with each other. Namely, both cell degeneration and the virus infectivityreach to their peak on 72 hours after infection, and the infectivity decreases along with gradual detachment of the cells in cultures. 2. In one‑step growth experiment conducted after simultaneous infection of a large number of CS cells with increasing amounts of virus, the cycle of the one‑step multiplication after a eclipse phase (4‑6hr) is found to be about 16 hours and it is assumed that the cycle is repeated following the infection. Furthermore, it is presumed that the release of regene ratad virus into liquid layer commences within 7 hours and it proceeds very rapidly along with the proliferation of the intracellularregenerated virus..
(7)
関連したドキュメント
It is said that one of the popular band member stayed at the hotel.. = One of the popular band member is said
The ethnic past was effectively used for shaping identities in the USSR where ethnicity was politicized due to ethnic discrimination embedded in the asymmetrical Soviet
動脈系化学受容器（頚動脈小体）の低酸素暴露
Over the lat 20 year before hi recent death, Derrida had become more and more identified a the thinker of the “to-come,” the thinker whoe thou#ht i preciely an attempt to think
lattice とは , Kauffman が証明した定理から得られるグラフであり , Alexander 多項式 を定義する state を全て書き出すために使用されているものである..
モーター（薬剤誘導性プロモーター）配列を挿入した（F ベクター） 。また、ウイルス RNA の合成に用
・224 氏名（生年月日） 本 籍 学位の種類 学位授与の番号 学位授与の日付 学位授与の要件 学位論文題目 論文審査委員
Abstract In recent years, agriculture has been attracting the attention of many Japanese people and some groups have been striving to develop nationwide initiatives
