博 士 （ 歯 学 ） 大 谷 誠
Involvement of suppressor of cytokine signaling‑l‑mediated degradation of MyD88‑adaptor‑like protein in the suppression of TLR2‑mediated signaling by dendritic cell‑specific ICAIVI3 grabbing nonintegrin‑mediated signaling
(Dendritic cell ― specific ICAM3 grabbing nonlntegrin による TLR2 のシグナルの＃p 制におけるsuppressorofcytokinesignaling ―1 を 介 し た MyD88 ― adaptorllikeprotein の 分 解 の 関 与 ）
学位論文内容の要旨
自然免疫系では，マクロファージ，好中球そして樹状細胞(DC)がToll‑like receptorぐrLRs)のような パターン認識レセプターで微生物の侵入を感知した後，貪食し，細胞内小胞で破壊することによって排 除 され てい る。TLRsは，現在までに10種類以上同定されており，リポ多糖0しPS)，ペプチドグ リカ ン，リポタイコ酸，リポタンパク質，リポペプチドといったpathogen‑associated molecular patterns くPAMPs)を認識する。さらに ，TLRsによる認識シグナルが抗原特異的な獲得免疫の誘導に必須な抗原 提示の際の補助刺激シグナル 分子の発現も制御している。すなわち，TLRsは自然免疫と獲得免疫との 橋渡しを媒介する重要なレセ プターでもある。我々は，これまでにTLR2シグナルが貪食受容体として のMSRl (macrophage scavenger receptor)やCD36な ど の ス カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 や ，DC‑SIGN (dendritic cell‑specific ICAM3 grabbing nonintegrin)やdectin‑lといったC‑type lectinの発現を増強 することにより貪食能を活性 化することを報告している。今回は逆に，貪食レセプタ ーの1っである DC‑SIGNに 注 目 し ，DC‑SIGNを 介す る貪 食シ グナ ルがTLR2の 認識 シグ ナル にど のよ うに 影響 する の か検 証し た。DC‑SIGNは ，主 にDCに発 現し てい る約44kDaのn型 の膜 タン パク 質で カル シウ ム依 存 的に 糖と 結合 するC‑type lectinである。DC‑SIGNは接着分子としての役割を担っており，DCの血 管外遊走の際の足がかりとな り，また，抗原提示の際にDCとT細胞接着においても重要な役割を果た している。
マ ウ スDCと し てA/J mouse由 来のXS106細 胞を 用い た。 ヒ トDCは， 末梢 血よ り単 球を 分離 し，
GM‑CSFお よ びIL‑4に よ り 分 化 さ せ た 樹 状 細 胞(MDDC)を 用 い た 。TLR2リ ガ ン ド と し て は ， Mycopぬ鋤a餾五瑠血ロ刃由来 の合成ジアシルリポペプチドFSL‐1，DC．SIG］吋またはDC‐SIGNのマウ スホモログSIGNR1のりガンドとしてはMannonanose‐di‐（N．acetyl・D―glucosanline）（以下Man9）およ び ， 結 核 菌 （ 碯 シ 勿6acぬ ぬz皿 オuみ 鮒 凵 ぬ おAoyama￣B） の 細 胞 外 壁 の 構 成 成 分 で あ る
‑ 610一
Lipoarabinomannan（ 以 下ManLAM)を 用 い た 。XS106細 胞 をFSL‑1で 刺 激 し た 際 の サ イ ト カ イ ン (TNF‑a，IL‑6，IFN‑y,IL‑10)の 産 生 は り ア ル タ イ ムPCR法 な ら び にELISA法 に て 評 価 し た 。 ま ず ，XS106細 胞 に 機 能 的 なTLR2な ら びにSIGNR1を 発現 して いる こ とを 確認 した 。XS106細胞 をFSL‑1で刺 激し たと ころ ，TNF‑a, IL‑6，IFN‑YならびIL‑10産生は濃度依存的に増加 したが，Man9 あ る い はManLAMと の 共 刺 激 で は ，FSL‑1に よ るTNF‑a，IL‑6な ら ぴ にIFN‑y誘 導活 性は 有意 に抑 制 さ れた 。し かし なが ら， 炎症 抑制 性の サイ トカ インで あるIL‑10誘導活性は抑制さ れなかった。
こ れ ら の サ イ トカ イン の産 生は 転写 因子NF‑KBで制 御さ れて いる ので ，XS106細 胞にNF‑KBル シフ ェ ラ ー ゼ レ ポ ータ ー遺 伝子 を導 入し ，FSL‑1単 独あ るい はFSL‑1とMan9との 共刺 激に よるNF‑KBの 活 性化を調べた。NF‑1くニBはFSL‑1刺激で濃度依存的に活性化されたが，Man9との同時刺激で活性化が 抑 制 さ れ た 。 さ ら に ，SIGNR1をRNAi法 に よ ル ノ ッ ク ダ ウ ン し た と こ ろ，FSL‑1とManLAMの 共刺 激 に よ るTNF‑ぱ とIL‑6産 生 抑 制 活 性 は 有 意に 消失 した 。さ らに ，ヒ トのDCで あるMDDCを用 いて 同 様 な 実 験 を 行 っ た と こ ろ ，XS106細 胞 と同 様な 結果 が得 られ た。DC‑SIGNとTLR2の細 胞表 面で の 存 在 状 態 を 調 べ る た め に ， ヒ ト 胎 児 腎 臓由 来のHEK293細 胞にFLAGタグ をっ けたTLR2を安 定発 現 さ せて ，DC‑SIGN遺 伝子 を導 入 し， 免疫 沈降 法で 確認 した 。そ の結 果，DC‑SIGNは テトラマーを 形 成 し た 状 態 でTLR2と 会合 して いる こと が判 明し た。 また ，XS106細 胞に おい てもTLR2とSIGNR1 は 会 合 し ，MDDCに お い て もTLR2とDC‑SIGNが 会 合 し て い た 。 最 近 ， 結核 菌の 感染 にお いて ，サ イ ト カイ ンシ グナ ルの 調節 因子 であ るsuppressor of cytokine signalingl(SOCS‑1)がDC‑SIGNに よ るTLR2シ グ ナル の抑 制に 関与 して いる こと が報 告さ れた 。そ こで ， 我々 もDC‑SIGNに よるTLR2 を 介したサイトカイン産生の負の調節にはSOCS‑1が関与し ているのではないかと考え，まず，XS106 細 胞 をFSL‑1ある いはManIよAMの 単独 なら びに 同時 に刺激し，SOCS‑1の発現を調べた 。その結果，
単 独 なら びに 同時 刺激 共に 時間 依存 的にSOCS‑1の 発現 が増 強 し， さら に，SIGNR1はSOCS‑1と会合 し て いる こと がわ かっ た。 次に ，SOCS‑1をRNAi法 でノッ クダウンしたところ，ManLAMによるFSL‑1 刺 激 によ るサ イト カイ ン産 生抑 制活 性が 有意 に減 弱した 。TLR4の下流のMyD88依存的 な経路におい てSOCS‑1がTLR4下流のアダプター分子であるMyD88‑adaptor‑like protein (MaDをユビ キチン化し，
プ ロ テア ゾー ムで 分解 するこ とが報告されている。そこで，SIGNR1によるTLR2シグナ ルの抑制にも 同 様 なこ とが 起こ って いる ので はな いか と推 測し ，FSL‑1とMaロLAMの 共刺 激でTLR2下流シグナル Malの分 解を 調べ た。 その 結果 ，FSL‑1とManIよAMの単 独な ら ぴに 同時 刺激 で，SOCS‑1の発現が増 強 し ， さ ら に ， 同 時 刺 激 で は 明 ら か にMalの 分 解 が 起 こ っ て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら ，TLR2シ グ ナ ル のDC‑SIGNシ グ ナ ル に よ る 抑 制 活 性で は，SOCS 1に よるTLR2 下 流 の ア ダ プ タ ー 分 子 で あ るMalの 分 解 が 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
学位論文審査の要旨
Involvement of suppressor of cytokine signaling‑l‑mediated degradation of IVIyD88‑adaptor‑like proteinln the suppression of TLR2‑mediated signaling by dendritic cell‑specific ICAINA[3 grabbing nonintegrin‑mediated signaling
(Dendritic cell −specific ICAM3 grabbing nonlntegrin による TLR2 のシグナ ルの抑制に おける suppressorofcytokinesignaling ー 1 を 介 し た MyD88 − adaptor − likeprotein の 分 解 の 関 与 ）
審査は，審査員全員出席の下に，申請者に対して提出論文とそれに関連した学科目につ い て 口 頭 試 問 に よ り 行 わ れ た ． 審 査 論 文 の 概 要 は 以 下 の 通 り で あ る ．
FSL‑1 刺激で 惹起された TLR2 シグナルは，貪食受容体である MSR1 やDC‑SIGN の発現 を増強し，樹状細胞 (DC) の貪食能を活性化することが知られている．逆に， DC‑SIGN を介 する貪食シグナルは矼,R2 の認識シグナルにどのよう栓影響を与えるのか，本研究はその 点について検討したものである，マウスDC として A/J mouse 由来のXS106 細胞，ヒト DC として末梢血より単球を分離し，GM‑CSF およぴ IL‑4 により分化させた樹状細胞(MDDC) を用いた・
実験に先立ち，XS106 細胞が機能的にTLR2 たらびにSIGNR1 を発現していることを確 認した．FSL‑1 単独刺激では，TNF‑a,IL‑6 ，IFN‑y およびIL‑10 の産生は濃度依存的に増加 したが，Man9 あるいはManLAM との共刺激では，FSL‑1 によるTNF‑a, IL‑6 ， IFN‑ の誘導 活性は有意に抑制された．ただしIL‑10 の誘導瀞陸は抑制きれなかった． 次に，XS106 細 胞にNF‑kB ルシフェラーゼレポーター遺伝子を導入してその活性化を調べると，NF‑kB 活 性は，FSL‑1 単独刺激では濃度依存的に活性化されたが， Man9 との共刺激では活性化は抑 制された．さらに， SIGNR1 を siRNA 法でノックダウンすると，FSL‑1 とManI ーAM の共刺 激によるTNF ．‑a, IL‑6 ， IFN‑Y の産生抑制活性は有意に減弱した．ヒトDC であるMDDC で
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則 郎
人
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靖 健
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塚 田
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授 授
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教 教
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査 査
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主 副
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も同様な結果であった．
ヒ ト 胎 児 腎 臓 由来 のHEK293細 胞 にTIーR2とDC‑SIGNの遺 伝子 を導 入し ，免 疫沈 降法 でDC‑SIGNとTLR2と の 細 胞 表 面 で の 存 在 状 態 を調 べ る と ，DC‑SIGNはり ガン ドを 認識 する 際に オリ ゴマ ーを 形成 し，TLR2と 会合 して いる こと が判明した．同様にXS106細胞 で はTLR2とSIGNR1，MDDCでfrLR2とDC‑SIGNが 会 合 し て い る こ と が 確 認 さ れ た ， 次に，suppressor of cytokine signaling (SOCS‑1)に着目し，XS106細胞でその動きをみる と ，SOCS‑1の発 現はFSL‑1とManI， 」Wの 共刺 激で 時間 依存 的に 増強 し， またSOCS‑1は SIGNR1と会 合し てい た． さら にSOCS‑1をsiRNA法 でノ ック ダウン する と，ManL」｀Mに よる皿唖・叫Iし−6，ロN´の産生抑制は有意に減弱した．次いで，TLR2下流シグナルの MyD88‐証嶼畑卜丗【eprotemQ圧al）に着目し，その動きを見ると，FSL‐1とMam，AMの共刺激 でMalの分解が起こっていることが確認された．これらの結果は，DC−SI（Nシグナルによ るTLR2シグ ナル の瀞 陸抑 制に おいて はSOCS−1が 重要 栓役 割を演 じて おり ，SOCS−1が TLR2下 流 の ア ダ プタ ー 分 子 で あ るM甜を 分解 する こと によ りTLR2シ グナ ルの 活性 が抑 制されることを示している．また，樹状細胞においては，一目，貪食が開始されると皿 R2 による認識は抑制されることを示している．
論文の審査にあたって，論文申請者による研究の要旨の説明後，本研究ならびに関連す る研究について質問が行われた・
主な質問事項は，以下の通りである．
1）共刺激で，FSL‑1によるTNF‑a, IL‑6，IFN‑Yの誘導活性が抑制されたのに，LL‑10の誘 導活性は抑制されなかったのは何故か，
2） MSR1やDC‑SIGNの 発 現 増 強 に よ る 樹 状 細 胞 の 貪 食 能 の 活 性 化 と は ， 3） SIGNR1をノ ック ダウ ンし ても ，FSL‑1とManI，AMの共 刺激 によ るTNF‑a等 の産 生 活性の抑制が完全に取り除かれないのはなぜか，
4）細胞膜における会合とは何か，
5） こ の よ う な 貪 食 とTLRと の ク ロ ス ト ー ク は 好 中 球 な ど で も 起 こ る の か ， 6） FSL‑1以 外 の TLR2リ ガ ン ド で も 同 様 な ク ロ ス ト ー ク が み ら れ る か ， 7） SOCS‑1はE3リガーゼとして働き，Malをユビキチンン化するということだが，ユビ キチンン化を確認したか，
いずれの質問についても，論文申請者から明快な回答が得られ，また将来の研究の方向 性にっいても具体的な回答が得られた．本研究は，樹状細胞においては、一旦貪食が開始 さ れる と貪 食シ グナ ルを 介し てTLR2による認識が抑制されることを明らかにし、さらに そ の 機 序 とし てSOCS‑1によ るTI風2下 流の アダ プタ ー分 子MaIの分 解の 可能 性が 高い こ とを示したことが高く評価された．本研究の業績は，口腔外科の分野はもとより，関連領 域 にも 寄与 する とこ ろ大 であ り， 博士（歯学）の学位授与に値するものと認められた．
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