関 抗 す 実験的研究 腫瘍活性

金沢大 学十 全 医学 会 雑 誌 第96巻 第3 号

4

9

7

−^{5 0 9 く1 9 8 7}I

偉才g わ乃 ggね 戊gC 戊gg ざC e 乃S の抗腫瘍 活 性に関する実験 的研 究

金沢 大学 医 学 部歯 科

^口

腔外 科 学講座 く主 任

^二

玉井 健三教 授J

八 木 茂 夫

く昭和

6 2

年

³

月

^{1 4}

日受付ン

4 9 7

V 巌朋の 鋸沼b 虚血仏k紀 の 那 T ⁻2株

^の

菌 体超 音 波 処理 上清液の抗 腫瘍 活 性

に つ い

て検 討した． T F 培地で

48 時 間培 養し た菌 体を超 音 波処理 し， そ の遠 心上清 液を 6 0％^エタ

ノ

^ー

ル で

溶 媒抽 出後， 等電 点 沈澱 法

に

よって精 製し た各 分 画

^{に つ い}

^て抗腫瘍洒 性を 1 C R 系マウ

^ス

を 用

^い

て検 討し た．

p

H 2^．0， 4^．0， 6^．0， 8^．0

に

調 整し得ら れ た精 製 物 質を^{エ ー}

ル

リ

ッ ヒ

腹 水が ん

^に

作用 さ せ た と

^こ

ろ，

p

H 8．0 分 画

^に

^TIC く％l を 20 0^．8％以 上 の著し

^い

抗 腫 瘍 活性^を認め た．さ ら

に

_，

p

H 8 ．0 分 画を サ

ル

コ ^ー マ1 80 細 胞

^の

腹 水型 腫 瘍

^に

作 用 さ せ た結 果， 同様

^に

高

^い

抗 腫 瘍 活 性 くTノCく％い^{9 0．2 以 上1 が得ら れ た．}

^{つ い}

^で，

^p

^{H 8 ．0} 分画を サ

^ル

^{コ ー}

マ1 80 細 胞と^{エ ー}

^ル

リ

ッ ヒ

腹水が ん細 胞の固型腫瘍

^に

作用 さ せ， そ の抗腫 瘍 活 性を検 討した．

こ の

さ

^い

，

抗 腫瘍 活 性は in c r e a s e of life s

p

a n く％1 お よ び膿 瘍 重量の増 加

^に

よって検 討し た． In c r e a s e of life s

p

^an は^{エ ー}

^ル

リ

ッ ヒ

腹 水が ん細 胞

^の

固型 腫 瘍で は 7 1．2％以上， サ

^ル

^{コ ー マ} 18 0 細 胞 固型 腫 瘍で は 1 2 8％以 上 を 示 し，

p

H 8^■0 分 画は腹 水型腫 瘍

に

対して と同様 固 型腫瘍

^に

対し て も高

^い

抗 腫瘍 活 性を 示 し た． ま た， 腰 瘍 重量で は^{エ ー}

ル

リ

ッ ヒ

腹 水が ん細 胞の固 型腫 瘍，サ

^ル

^{コ ー マ} 1 80 細 胞の固 型腫 瘍^{と も}移植 後10 日翠^{で は}対 照群と同様

^に

腫 瘍 重量 が増 加す る が，

p

H 8．0分 画投 与 群

^で

は そ れ以 後 腫瘍 重 量は減 少し^，1 5 日日よ り綬や か

に

上昇し た の

に

対し， 対 照 群の腫 瘍 重 量は増 加の ^一 途を た ど り腫 瘍 死し た． 以上

の

結果よ り， 竹 丘加 ゎ^一

s c g 乃ざ

の

菌体か ら調 整し た

p

H 8^，0 分 画

^に

強

^い

抗腫 瘍 活性を有す る

^こ

と が わ かった．

K

e

y

^{w o r}

d

s

V bill

o n e

lk

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l

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lb

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，

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r

li

c

h

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i_t

e s C a r C

i

_{n o m a}

，S

a r c o m a

18 0

微 生物

^に

よ る抗腰瘍 活 性， 制が ん作用

に

つ

い

て

の

研 究は， 従 来か ら数多く み ら れ る が， そ

の

大 部分は好 気 性薗

に

よ る報 告で あ り^{1 ト糊}， 嫌気 性 菌

^に

よ る抗 腫 瘍 晴 性

^の

研 究は，

一 部

の

C 仏

壇

克 施憫1 7 卜 2 5 I

お

よ び嫌 気 性 仇7

ツ

犯e占戊ご

ね

ガ祝 椚 p^{戊rZノ祝 椚2 6 ト 2 9コ}

^お

よ び Cの

ツ

^{乃 e}占d C

ね

−

r才裾椚 戊乃 戊g 和占ブ乙g 椚^{3 0}ト3 2Iの み

で

あ る． 数 年 前よ り 玉井

ら^{3 3舶} ， 渡辺^{3 5 1}， 西脇^{3 6I}ら は グ ラ

ム

陰 性 嫌 気 性 梓 菌

動静転

地

戒抑 用 肌鬼

頭

仰

に

抗腫 瘍 活 性

^の

あ る

^こ

と を 実験が ん

で

証 明し報 告し た． ま た， グ ラ

ム

陰性 嫌 気 性 球菌

の

陥 招 加 扉 払 血加 血彫 那 T−^{2 株}

^の

^{菌 体超 音 波 処}

理 上清 液

^に

強

^い

抗腫瘍 活 性

^の

あ る

こ

と を中川 が報 告

し^{3 7 I}， グ ラ

ム

陽 性妖 気 性 球 菌 瑚

^加

^{0 ビC 猥 椚}

曙

乃 鮎

の

菌体 内 容 物

^に

^も， 抗 腫 瘍 活 性

^の

あ る

^こ

と を 坂下が報 告^晒し て

い

る^．

こ の

よ う

に

，最 近

で

は嫌 気 性 菌

^の

抗 腫 瘍 活性

に

つ い

て の

研 究が盛ん

^に

な り^{つ つ}あ る． さ ら

に

_，

嫌 気性 菌 特

^に

グ ラ

ム

陰 性 菌の菌 体超 音 波処理 上清液

に

は リ ボ多糖 体 く1i

p

o

p

ol

y

s a c cha ri de，L P Sl が含ま れ て

い

る

か

ら，

こ の

L P S

に

よ る抗腫 瘍活 性

^の

研 究も盛ん

で

あ る^{3 9 ト 4 31}

今回， 佑 戊gC 戊由s c e 乃ぶ T⁻2 株の も

^つ

抗腫瘍 物 質を精 製す る 目的

^で

， 等 電点 沈澱 法 を 用

^い

， 各段 階

^で

得ら れ た精 製 物 質

^の

抗 腫瘍 活 性を^{エ ー}

^ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細胞

お

よ び サ

^ル

^{コ ー マ}

1

8 0細胞

^の

担が ん^マウ

ス に

つ

い

て検 討し た．

材 料

^お

よ び方法 I ． 使用菌 棟

1

9 8 0年

に 口

腔 内感 染症

か

ら分 離^．同定し た金 沢 大学 医学 部 歯 科

^口

腔 外 科学 教 室 保 存株^{で あ る V二 ．如b 誠錯−}

C e 乃S T−^{2株を実験}

^に

^{使用 し た． 本 薗株は分離 後A P I}

A b br

e v

i

a

ti

o n s ニ

T F 培 地， 玉井^．福^田の培 地i T_J^Ic く％l^， 処 置 群^の平 均 生存 匹 数l 対 照 群^の平 均生存 匹 数

^X

^{lO O}．

2 0 A a n a e r obic s

y

s

t

e m くLa Balm e le s Gr o

t t

e s，

M o n

t

alie u，Fr a n c el を 用

^い

Co w a n^{4 4}1

お

よ び Be r

g

e

y

^，s m a n u a1^{4 5}り

こ

従^って同 定し た．

工I ． 等 電 点 沈澱 法

^に

よ

る

抗 腫瘍 物 質

^の

精 製 法 抗 腫 瘍 物 質

^の

産 生

お

よ び精 製は 以下

の

方 法

^に

よ^っ た． まず 佑 戊J川上どぶビg 乃5T ⁻2 株を中 試験 管 く

¹

^．5X1 6^．5

c ml

^に

作 製し た 玉井^．福田培 地 くT F 培地l^細 く1 5 mll で 3 7^qC ^．4 8 時 間培 養 後， 玉井^．福田血 液寒 天 平 板 培地 くT F 血 液 寒^天平 板 培 地l^{4 61}

^に

塗抹し た． 塗抹 後， Ga s

Pak くB B L，Co cke

y

^{s v}ille，U S Al

^に

て 3 7^qC ^．

4

8時 間 嫌 気 培 養 後 形 成さ れ て く る^{コ ロ ニ ー} を T F 培 地 く15

mlう

に

釣 菌し， 3 7⁰C ^．4 8時 間培 養し た． 培 養後さ ら

^に

T F培 地 く10 0 mll

^に

5^ml を移 値し，3 7 て

こ

^．4 8時間前培 養し た． 培 養 後， T F 培 地 く1 00 0 mll

^に

5 0 ml 移植し，

3 7^QC^．4 8時 間本 培 養^を

^{お こ}

^なった． 培 養 後， 4，5 0 0

X g

，

2 0 分 間冷 却 遠 心し， 得ら れ た沈 澄

^に

1ハ5 M リ

ン

酸緩 衝 液 く

p

H 7^．Ol くP B S1 5 0 ml を加え， 超 音 波 処理器 くM odel U R⁻2 0 0

p

，2 0 K Hzl くト ミ^ー 精工， 東 京1 を用

い

て 2 0分 間 超 音 波処理後，1 0，00 0

X g に

て 2 0 分 間^一冷 却遠心 し た． 得ら れ た 上浦液

^に

6 0％ア

^ル

^{コ ー}

ル

濃 度

^に

な る よ う

に

エチ

^ル

ア

^ル

^{コ ー}

^ル

を加え， 析 出し た分 画を 冷却 遠 心 く1 0，0 0 0

X g

^．1 2 0 分1 し た^． 得ら れ た沈 溶

^に

P B S を加え，充 分濃 拝し た後， 1規定

^の

NaO B お よ び 1 0規 定の塩 酸

^で

段 階 的

に p

H を調 整 後， 1 0，0 0 0

X g

で 冷 却遠 心し，

p

H 8^．0， 6^．0，4．0， 2．0 の各 沈 溶

^に

P B S l O Oml を加え実 験

^に

供し た．

H l． 実 験動 物

4適 齢

の

王C R 系マウ

^ス

く日本チ

ャ

^ー

ル

ズ^．リ

^バ

^ー 株 式会 社， 厚 木フ を購入後， 腹 水 型 膿瘍

^の

実 験

^に

用

い

る 場 合は 1 週 間 く体 重

^こ

約20 ^旬2 2

g

う， 固 型腫 瘍

の

実 験

に

用

^い

る場 合は 2 週 間 く体 重

こ

2 3^へ2 5

g

I 教 室

^で

飼育 し た の ち実験

^に

供し た．

1 V ． エ ^ー

ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞

^お

よ び サ

^ル

^{コ ー マ} 1 8 0細 胞

^の

調整

教 室で継代 培 養し て

^い

る^{エ ー}

ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞

お

よ び サ

ル

コ ^ー マ 1 80 細 胞を 用

^い

た． 7 日日ご と

に 4

週 齢の I C R 系マ ウ

ス

く体 重こ1 8^句2 0

g

う

の

腹腔 内で継 代 培 養し た^{エ ー}

^ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞

^お

よ び サ

^ル

^{コ ー}

マ 18 0 細 胞を無菌 的

^に

採 取し た^． 採 取後，T bo m a

の

血

球 計 算板を 用

^い

， 白血 球 算 定 基 準

^に

し た が^っ て細 胞 数 を算 定し，適量

の

生理食 塩 水を加え，約1 ．O^x l O⁷ c ellsノ

ml の細 胞浮 遊 液を作 成し各 実験

^に

供し た^． 回型腫 瘍

^の

実 験

^に

は，が ん細 胞 数を約2^．O

X

l O⁷ c ellsl^ml

に

調 整し 実 験

に

供し た．

V ． 担が んマウ

^{ス の}

調 整

腹 水型 腫 瘍の実験

^に

は， 5 適 齢 く体 重こ2 0^へ2 2

g

ン

^の

I C R 系^マ ウ

ス の

腹腔 内

に

_， 至適細 胞 数

^に

調 整し た^{エ ー}

ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞ま た は サ

^ル

^{コ ー マ}

1

8 0細 胞

の

浮 遊 液0．5 ml を移 植し，

4

8 時間 後，調 整し た そ れ ぞ れ

の

精製 物 質

^の

懸 濁 液0^．5 ml を腹 腔 内

^{に 1}

日 1 臥 2 週間 連日投 与し た．

固型 腫瘍

^の

実 験

^に

は， 6 週 齢 く体 重

^こ

2 3^旬2 5

_g

I

の

I C R 系^マ ウ

ス

を使用 し た^． 実 験

に

際し^マウ

ス

の背部_を

電 動 式^バリ

^{カ ン}

げ^{ニ マ}

^{ル ク}

リッ

パ

^ー

，

モ

デ

^ル

9仁明

く大 東 電気K ^．K ， 東 京う で剃毛し，

ヒ ビ テ ン

ア

^ル

^{コ ー}

ル で

消 毒 後， マウ

ス の

皮下

^に

適量

の

細 胞 数

^に

調整し た

エ ^ー

ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞ま た は サ

^ル

^{コ ー マ}

1

8 0細胞 の浮 遊 液0^．2ml を移 植し た^．

⁴

8時 間経 過 後マウ

ス の

前肢上腕

^二

頭 筋

^に

， 調 整し た そ れ ぞ れ

の

精製 物質

^の

懸 濁 液0．5 ml を 1 日 1 回， 2週 間 連日投 与し た．

V 工^． 抗 腫 痔活性

^の

判定

腹 水型腫 瘍

^の

実験

^に

は，3 0 日間

^の

^マ ウ

ス の

生 存匹数 を観 察し， 実験が ん細胞を移 植し た 目 よ り 以後

の

マウ

ス の

生 存目数

に

よ り抗 腫瘍 活 性を判 定す る

こ

と と し，

処 置 群

^の

平 均生存日数 くTっと対照群

の

平 均 生存日数 くCフ

^の

比， す な わ ち， 下 記

^に

示 す TノC

x l

O O

^の

計算式

に

よ^って TノC く％I を求め，1 3 0％以 上

^の

値を 示 す時抗 腫瘍 活 性を有す る と判 定し た^{4 7潮}

TノC く％う^ニ

Su rviv al da

y

^{s o}f

t

r e a

t

m e n

t g

^{r o u} Su rviv al da

y

s of c o n

t

r ol

_g

r o u

p

Xl O O

固型 腫 瘍

^の

場 合は，6 0 日間

^の

マ ウ

ス の

生存日数を観 察し，

一群

の

中 間値

^の

生 存目数

^の

比を現わ す in c r e a s e of life s

p

^alく％l

^に

よっ て抗腫瘍活 性を判 定し た^{4 9 ，}． ま た， 背 部

^に

形 成し た圃型腫 瘍

^の

長 径 くm 血 と 短径 くm mうを ^一 定 期 間ご と

に

測 定す る

^こ

と

^に

よ り， 腫瘍重 量を算 定し， 抗腫瘍 活 性を判 定し た． す な わ ち， つぎ

の

計 算 式

^に

よ^っ

て

腫 瘍 重 量を算 定し た^{4 9 I}．

腫瘍重 量 くm

g

ユ^ニ

庫恕毒 輝

2 VII． 蛋白量

^の

定量測定

抽 出^■精 製 物 質

^の

蛋白量

の

定量は Lo w r

y

法^{5 O l}

^に

従^っ て測 定し た．

成 績

工． エ ^ー

ル

リッ

ヒ

腹水 が ん細胞

^の

腹水 型腫 瘍

^に

対す

る

佑 戌J描ge 5 C e 乃S T⁻2 株

^の

抽 出 ^．精製物 質

^の

抗 腫瘍活性

王C R 系^マ ウ

^{ス に}

5^，O

^{X l}

O⁶個

^の

^{エ ー}

^ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞を腹 腔 内

^に

移 植し実 験

^に

供し た． ま ず け

戊gC 仔Je s c e 乃 5 T ⁻2 株

^の

菌体を超音 波 処理 し， そ

^の

上清液 と沈 漆

^に

^つ

^{い て}

抗 腫 瘍 活性を検 討し た．

怖 紬欺浦 川血 症椚 湖

の

抗 腰 囁 活 性

本実験

^に

は，

一群1 0 匹

^の

^マ ウ

ス

を使用 し た^． 表1

^に

示 す ご と く， 両者 共

^に

抗腫瘍 活性を 示 し， 特

に

超音 波処理 上清 液

^に

，TノC く％1で 1 8 3．0％

^の

高

^い

活 性傾^が認め ら れ た．

つづ

^い

て， 竹 丘血 皮椚 肌 T⁻2株

^の

菌体 超 音 波処^理 上清 液を等電 点 沈澱 法

^に

て精製^{し た}各 沈壇

^に

つ

い

て，

そ の抗 腰瘍 活 性を^{エ ー}

ル

リッ

ヒ

腹 水が ん細 胞を移 植し た担が ん^マウ

^ス

を用

^い

検 討し た．

本実 験

^に

は ^一群1 0 匹

の

マウ

ス

を使用 し た^． 滅菌 生理食塩 水を投 与し た対 照 群

^の

^マ ウ

ス

は

1 1

日 目よ り腫瘍死 し，1

5

日目ま で

に

全て

の

マ ウ

ス

は膿瘍^死 し た． 平均生存日数は

1

3^．0 士1 ．0 日

^で

あ^っ た く表2J．

こ

れ

に

対し て，

p

H 8^．0 分画を投 与し た処 置 群

^の

^マウ

ス

は， 2 0 日日よ り腫瘍 死し 2 0 日日

に

2 匹， 2 2 日目

に

2 匹，27 日 日

^に

1 匹腰 瘍死 し た

^の

み で平均 生 存日数は，

2 6^．1 日 以 上 と高

^い

値を 示 し た^． し か も，3 0 日間の生 存 日数

^の

判 定で は 10 匹中5 匹 が生 存し，生 存^{し たマウ}

^ス

は， 完全 治癒し た． つ

い

で，

p

H 4．0 分画 投 与 群は対 照 群の^マ ウ

^ス

同様

1

0 日目よ り 腫瘍死 し た が， 2 0 日目ま

49 9

で生 存し， 対 照 群

^の

そ れ よ り延命し た^． 平 均生 存日数 は 1 4．7

士

4．

1

日 で あった．

p

H 6^．0 分 画

^お

よ び

p

H 2．0 分 画 投与群

^の

平均生存日数は各

々

1

1

．2 士1．5^，1 0^．6

士

2^．9 日 で あ り対 照 群よ り も低値を 示 し た^． ま た，TノC く％う で は，

p

王i 8．0分画は 2 0 0^．8％ 以上 と極め て高

^い

抗腫 瘍 活性を 示 す値であ^った． ま た，

p

H 6．0，4．0，2^．0

の

Tノ C く％1 は， 各々 8 6．2， 1 1 3．1， 8 1^．5％と低 値を 示 し，

抗 腫 瘍 惰性^は

^い

ずれ の分 画

^で

も認め ら れ な かっ た．

n ^． サ

ル

コ ^ー マ1 8 0 細 胞

^の

腹 水型腫 動こ対す

る

V 加矧紘彫 那 T⁻2株

^の

抽 出^．精 製物 貰

^の

抗 腫 瘍活 性

エ ^ー

ル

リ

ッ ヒ

腹 水が ん細 胞の腹 水塾腫 瘍

^に

対し

て

抗

腫 瘍 活性が高

か

った

p

H 8．0分画

^{に つ い}

て サ

ル

コ ^ー マ

1 8 0細 胞

^の

腹 水 型 腫 瘍

^に

対し て も抗腫 瘍 活 性を検 討し た^．

本 実 験

^に

は， 1群2 0 匹マウ

ス

を使用 し た．

対照群

^の

マ ウ

ス

は

1

0 日目よ り腫瘍死 し， 1 5 日日で 全

て の

マ ウ

ス

が 腰瘍死 し た． 平均 生 存日数は 1 2．2 士

1

．7 日 で あった く表3う．

こ

れ

^に

対し， 処 置 群で は対 照

Tab lel^． An

t

i

t

u m o r a c

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^of

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he s u

p

^{e r n a}

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t

of V． alcale s c e n s s

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C ells

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r a s o nic d is r u

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io n

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u mo r of E hrlich c a r cino ma clls in mi^{c e}

Inj^{e c}

^t

io n^a，

慧芸^b慧 ^{Me a}竃g P ^{iv al TノCく瑚}

Su

p

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io n

Sedim e n

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Wi

t

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t

r a s o nic d is r u

p t

io n

S al in e c o n

t

r ol

2 0^，5 士5^．7 1 8 3^．0

1 6^．8 士5^．6 1 5 0．0

1l^．2 土1^．3

al A half ml of e a ch

p

r e

p

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t

io n w a sinje c

t

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J

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t

io n w a s m ade a

t

4 8 hr af

t

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t

r a

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t

o n e al in o c ula

t

io n Of 5^．O

^x

l O⁶ c ellsノ^ml^．

bl M ic e w e r e obs e r v ed fo r 3 0 da

y

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