biomapping 組み換えタンパク質の発現 抽出 精製 検出 1 ベクター ( コンストラクト ) 作成 ( サブクローニング ) 大腸菌を形質転換 ( トランスフォーメーション ) 大腸菌の培養 ( 少量 ) ベクターの選択 プライマーのデザイン インサートの PCR プラスミドの制限酵素によ

組み換えタンパク質発現ガイド

2014

・これ一冊で組み換えタンパク質発現・抽出・精製・

検出がわかる！

・便利なプロトコールつき

・巻末：

FLAG®

システム特集

SAJ1783

組み換えタンパク質の発現・抽出・精製・検出

組み換えタンパク質を作製する手法は、対象の遺伝子を適当な宿主細胞に発現させ大量に得ることによって、 生体内でわずかにしか存在していないタンパク質でも構造解析や機能解析を可能にした有用な技術です。 いまや組み換えタンパク質の発現や調整方法は色々な方法が試されていますが、タンパク質の検出と精製には、 通常、特異的抗体が利用されます。しかし全てのタンパク質に対する抗体が販売されているわけではありません。 ポリクローナル抗体の作成には時間もコストもかかり、モノクローナル抗体を作成する場合は尚更です。そこで 融合タグ又は親和性タグとしても知られているエピトープタグを付けてタンパクを発現させる方法は、融合する タンパク質の構造を乱すことなく、その検出と精製のための普遍的エピトープとして働くことで、このような問 題に対する便利な解決法となります。 選択の際に重要な点の

1

つは、その発現の目的がタンパク質の検出か、精製か、ということです。 目的タンパク質の下流解析の方法、コストなどを考慮して最終的に選択するのが良い方法です。

組み換えタンパク質の

実験フロー

ベクター_{（サブクローニング）} (コンストラクト) 作成 大腸菌を形質転換 （トランスフォーメーション） 大腸菌の培養（少量） プラスミド精製（ミニプレップ） 発現用の大腸菌を形質転換 （トランスフォーメーション） 哺乳動物細胞にプラスミドを導入（トランスフェクション） 大腸菌の培養（大量） 細胞の培養 （ディッシュ） 細胞の培養 （プレート） タンパク質発現・抽出 タンパク質発現・抽出 タンパク質発現・抽出 発現の確認 （電気泳動 or ウェスタンブロット） 発現の確認 （ウェスタンブロット） 発現の確認 （ウェスタンブロット） タンパク質精製 （アフィニティ精製） タンパク質精製 （アフィニティ精製） 免疫染色 （免疫蛍光染色・免疫組織化学） 機能解析 構造解析など • ベクターの選択 •プライマーのデザイン •インサートのPCR •プラスミドの制限酵素による切断 •インサートとライゲーション •シークエンス確認

目次

-

組み換えタンパク質の発現

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

₄

-

タンパク質の抽出

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

12

  

_-

超音波破砕

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

₁₂

  

_-

凍結融解

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

₁₃

  

-

界面活性剤抽出

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

14

  

-

タンパク質抽出関連製品紹介

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

15

-

タンパク質の精製

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

19

  

-

ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製例

‥‥‥‥‥‥‥

19

  

_-

免疫沈降法（

_IP

）

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

₂₁

  

_-

直接免疫沈降法

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

₂₂

  

-

間接免疫沈降法

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

24

  

-

精製関連製品紹介

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

25

-

タンパク質の確認・検出

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

29

  

-

ウェスタンブロッティング（

WB

）

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

30

  

_-

免疫組織化学

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

₃₃

  

-

免疫蛍光法

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

38

  

-ELISA

法

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

41

  

-

検出関連製品紹介

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

43

-

巻末特集：

FLAG®

発現システム

‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥

48

組み換えタンパク質の発現

まず組み換えタンパク質のデザインを考える際には実験の目的やタンパク質の性質に応じて、ベクターの種類、 プロモーター、発現したタンパク質に輸送シグナルを付けるか、タグは

N

末端に付けるか

C

末端に付けるかなど を検討して適した発現用ベクターを選択します。 例えば抗原に用いる組み換えタンパクを発現させる場合には糖鎖修飾が起こらない大腸菌などを宿主として選 択するのがよいでしょう。発現用宿主として大腸菌を選ぶ場合、

DH5

α

®

と

BL21

（

DE3

）は最も広く使用されて いる宿主で、

FLAG®

融合タンパク質を発現させる場合にも有用な菌株です。ただし、宿主株を使用したデータ がない場合、タンパク質と宿主の組み合わせは実験的に決定する必要があります。 ベクターの種類としては

tac

プロモーターを用いたベクターや、

T7

プロモーターなどを用いたベクターなどがあ ります。

tac

プロモーターを用いたベクターはほとんどの一般的な大腸菌宿主に使用することができます。 大腸菌用

FLAG

タグ融合タンパク質発現ベクターには、

lacI

リプレッサータンパク質をコードする配列が含まれ ています。このベクターは

IPTG

によって

FLAG

タグ融合タンパク質の発現を誘導することができます。

T7

プロモーターを用いたベクターは極めて強力で、

tac

プロモーターを用いたベクターに比べ高い収量が期待 されます。しかし、

T7

プロモーターは発現のリークが起こることが知られており、発現タンパク質が宿主に毒性 がある場合には欠点となり得ます。そのため

Sigma®

のベクターは

lac

オペレーター（

lacO

）の配列をプロモー ターのすぐ下流に持たせることで、リークによる発現を低減させています。

T7

プロモーターを用いた

FLAG

タ グ融合タンパク質発現ベクターは、

T7 RNA

ポリメラーゼを産生できる

BL21

（

DE3

）株などの大腸菌株（

DE3

溶原菌）を宿主として発現させる必要があります。このベクターも

lacI

配列があり、

IPTG

によって

FLAG

タグ 融合タンパク質の発現が誘導されます。 大腸菌での発現系は簡便でまた迅速・安価に使用できるため、上手く発現できれば非常に効率的な発現方法で すが、翻訳後の修飾がないために機能発現に必須なタンパク質では使用できません。その場合には酵母や、哺 乳類細胞での発現系を検討します。 弊社でご用意している発現ベクターは次ページをご覧ください。 また、トランスフェクション試薬・詳しいプロトコールは製品データシート、各種ウェブサイトなどでご紹介してい ます。

発

 

現

大腸菌用発現ベクター選択チャート

N

末端 分泌（ペリプラズム） 細胞質内発現 分泌（ペリプラズム） 細胞質内発現

FLAG®

FLAG

MAT

FLAG

FLAG

FLAG

amp

r

_/kan

r

amp

r

_/kan

r

MAT

デュアルタグ

FLAG

MAT

デュアルタグ デュアルタグ

MAT

E8158 , pFLAG-ATS™

E8033, pFLAG-MAC™

E9533, pFLAG-Shift™12C

E5530, pTAC-MAT™-Tag-1

E8283, pFLAG-CTS™

E8408, pFLAG-CTC™

E5405, pTAC-MAT-Tag-2

P9618 , pT7-FLAG™ -3

P1118, pT7-FLAG -1

E5780 , pT7-MAT™-Tag-1

E5155, pT7-MAT-Tag-FLAG™ -1

P9743, pT7-FLAG -4

P1243, pT7-FLAG -2

E5655, pT7-MAT-Tag-2

E5030, pT7-FLAG -MAT™-Tag-2

E5280, pT7-FLAG -MAT-Tag-1

(N

末端

FLAG, C

末端

MAT)

E4905, pT7-MAT-Tag-FLAG -2

(N

末端

MAT, C

末端

FLAG)

P3871, pT7-FLAG-SBP™-1

(N

末端

FLAG, C

末端

SBP)

C

末端

N

末端

C

末端

N,C

末端

T7

プロモーターシステム（すべて細胞質内発現）

tac

プロモーターシステム 各種ベクターマップはこちらをご覧ください：sigma.com/vectors

tac

プロモーター系

製品名 製品番号Promoter FLAG® MAT OmpA Ek Site ampr _kanr _{容量 CAT.NO. 価格} pFLAG-ATS™ E8158 tac N

P

P

P

10µg E8158-10UG ¥30,000 pFLAG-MAC™ E8033 tac N

P

P

10µg E8033-10UG ¥30,000 pFLAG-CTS™ E8283 tac C

P

P

10µg E8283-10UG ¥40,400 pFLAG-CTC™ E8408 tac C

P

10µg E8408-10UG ¥40,400 pFLAG-Shift™12C E9533 tac N

P

P

10µg E9533-10UG ¥44,700 pTAC-MAT™-Tag-1 E5530 tac N

P

10µg E5530-10UG ¥45,300 pTAC-MAT-Tag-2 E5405 tac C

P

10µg E5405-10UG ¥47,500

T7

プロモーター系

製品名 製品番号Promoter FLAG MAT OmpA Ek Site ampr _kanr _{容量 CAT.NO. 価格} pT7-FLAG™ -1 P1118 T7/lacO N

P

P

10µg P1118-10UG ¥42,500 pT7-FLAG -2 P1243 T7/lacO C

P

10µg P1243-10UG ¥42,500 pT7-MAT-™Tag-1 E5780 T7/lacO N

P

10µg E5780-10UG ¥41,600 pT7-MAT-Tag-2 E5655 T7/lacO C

P

10µg E5655-10UG ¥47,500 pT7-FLAG -MAT™-Tag-1 E5280 T7/lacO N C

P

P

10µg E5280-10UG ¥45,300 pT7-MAT-Tag-FLAG™ -2 E4905 T7/lacO C N

P

10µg E4905-10UG ¥47,500 pT7-FLAG-SBP™-1 P3871 T7/lacO N 注 10µg P3871-10UG ¥45,900 pT7-MAT-Tag-FLAG -1 E5155 T7/lacO N N

P

P

10µg E5155-10UG ¥47,500 pT7-FLAG -MAT-Tag-2 E5030 T7/lacO C C

P

10µg E5030-10UG ¥45,300 pT7-FLAG -3 P9618 T7/lacO N

P

P

P

10µg P9618-10UG ¥47,200 pT7-FLAG -4 P9743 T7/lacO C

P

P

10µg P9743-10UG ¥47,200 N：N 末端タグ　　C：C 末端タグ　　ompA：periplasmic localization Ek：エンテロキナーゼ切断部位

ampr _{= アンピシリン耐性遺伝子 kan}r _{= カナマイシン耐性遺伝子}

注: C末端はSBP（ストレプトアビジン結合ペプチド）タグ

大腸菌用発現ベクター価格表

発

 

現

哺乳動物用発現ベクター選択チャート

N

末端 分泌 細胞質内発現

3xFLAG™

3xFLAG

デュアルタグ バイシストロン性発現

E9908, p3xFLAG-CMV ™ -8

E7408, p3XFLAG-CMV-7

E7533, p3xFLAG-CMV-7.1

C5989, pCMV-MAT-Tag-FLAG™ -1

E7029, pBICEP-CMV ™ -3

N

末端

FLAG+

タグなし（同時発現）

E5905, pCMV-BICEP™ -4

N

末端

FLAG+N

末端

c-Myc

（同時発現） 一過性発現

C

末端 細胞質内発現

FLAG®

FLAG

デュアルタグ

E6908, pFLAG-CMV -5.1

E3762, pFLAG-CMV -5a,b,c

C6114, pCMV-FLAG-MAT™-Tag-2

E7033, pFLAG-CMV2™

E2275, pFLAG-CMV ™ -6a,b,c

N,C

末端 分泌 細胞質内発現 デュアルタグ デュアルタグ

E9283, p3xFLAG-Myc-CMV -24

(N

末端

3xFLAG, C

末端

c-Myc)

E8783, pFLAG-Myc-CMV -20

(N

末端

FLAG, C

末端

c-Myc)

C5864, pCMV-FLAG-MAT-Tag-1

(N

末端

FLAG,C

末端

MAT)

E8658, pFLAG-Myc-CMV ™ -19

（

N

末端

FLAG, C

末端

c-Myc )

E9158, p3xFLAG-Myc-CMV ™ -23

(N

末端

3xFLAG, C

末端

c-Myc)

各種ベクターマップはこちらをご覧ください：sigma.com/vectors

哺乳動物用発現ベクター選択チャート

N

末端 分泌 細胞質内発現

3xFLAG™

FLAG®

3xFLAG

FLAG

バイシストロン性発現

E7658, p3xFLAG-CMV-10

E7158, pFLAG-CMV™-4

E0904, pBICEP™-CMV™-2 N (MCS1)

(N

末端

3xFLAG)

E0779, pBICEP™-CMV™-1 N (MCS1)

(N

末端

FLAG)

E9783, p3xFLAG-CMV™-9

E6783, pFLAG-CMV™-3

安定発現

C

末端 分泌 細胞質内発現

3xFLAG

3xFLAG

E7908, p3xFLAG-CMV-14

E7783, p3xFLAG-CMV-13

N,C

末端 分泌 細胞質内発現 デュアルタグ デュアルタグ

E9408, p3xFLAG-Myc-CMV™-25

(N

末端

3xFLAG,C

末端

c-Myc)

E7283, p3xFLAG-Myc-CMV-26

(N

末端

3xFLAG,C

末端

c-Myc)

E9033, pFLAG-Myc-CMV™-22

(N

末端

FLAG,C

末端

c-Myc)

各種ベクターマップはこちらをご覧ください：sigma.com/vectors

発

 

現

一過性発現

製品名 製品番号 PPT FLAG® 3x FLAG™ c-Myc MAT Ek Site ampr _{容量 CAT.NO. 価格} pFLAG-CMV2™ E7033 N

P

P

20µg E7033-20UG ¥80,300 pFLAG-CMV ™ -5.1 E6908 C

P

20µg E6908-20UG ¥74,600 pFLAG-CMV-5a,b,c E3762 C

P

1set E3762-1SET ¥104,100 pFLAG-CMV-6a,b,c E2275 N

P

P

1set E2275-1SET ¥115,500 p3XFLAG-CMV™-7 E7408 N

P

P

20µg E7408-20UG ¥86,300 p3xFLAG-CMV-7.1 E7533 N

P

P

20µg E7533-20UG ¥82,100 p3xFLAG-CMV-8 E9908

P

N

P

P

20µg E9908-20UG ¥82,200 pFLAG-Myc-CMV ™

-19 E8658

P

N C

P

P

20µg E8658-20UG ¥100,300 pFLAG-Myc-CMV-20 E8783 N C

P

P

20µg E8783-20UG ¥96,100 p3xFLAG-Myc-CMV ™ -23 E9158

P

N C

P

P

20µg E9158-20UG ¥78,500 p3xFLAG-Myc-CMV -24 E9283 N C

P

P

20µg E9283-20UG ¥78,400 pCMV-FLAG®-MAT-Tag®-1 C5864 N C

P

P

20µg C5864-20UG ¥100,500 pCMV-MAT-Tag-FLAG™ -1 C5989 N N

P

P

20µg C5989-20UG ¥109,900 pCMV-FLAG-MAT™-Tag-2 C6114 C C

P

20µg C6114-20UG ¥107,100

pBICEP-CMV ™ -3 E7029 N(MCS1)

P

P

20µg E7029-20UG ¥113,600 pCMV-BICEP™ -4 E5905 N(MCS1) N(MCS2)

P

P

20µg E5905-20UG ¥109,900 N ＝ N 末端タグ　　C＝ C 末端タグ　　PPT ＝直接分泌に関するプレプロトリプシンリーダー（細胞外分泌シグナル）

c-Myc ＝ c-Myc エピトープ　　MAT ＝金属アフィニティタグ　　ampr _{＝アンピシリン耐性遺伝子}

Ek ＝エンテロキナーゼ切断部位

安定発現

製品名 製品番号 PPT FLAG 3x FLAG c-Myc Ek Site ampr _neor _{容量 CAT.NO. 価格} pFLAG-CMV3™ E6783

P

N

P

P

P

20µg E6783-20UG ¥72,500 pFLAG-CMV4™ E7158 N

P

P

P

20µg E7158-20UG ¥77,800 p3xFLAG-CMV-9 E9783

P

N

P

P

P

20µg E9783-20UG ¥78,400 p3xFLAG-CMV-10 E7658 N

P

P

P

20µg E7658-20UG ¥82,200 p3xFLAG-CMV-13 E7783

P

C

P

P

20µg E7783-20UG ¥82,100 p3xFLAG-CMV-14 E7908 C

P

P

20µg E7908-20UG ¥80,000 pFLAG-Myc-CMV-22 E9033 N C

P

P

P

20µg E9033-20UG ¥100,500 p3xFLAG-Myc-CMV™ -25 E9408

P

N C

P

P

P

20µg E9408-20UG ¥91,300 p3xFLAG-Myc-CMV -26 E7283 N C

P

P

P

20µg E7283-20UG ¥78,400 pBICEP-CMV-1 N (MCS1) E0779 N(MCS1)

P

P

P

20µg E0779-20UG ¥103,700 pBICEP-CMV-2 N (MCS1) E0904 N(MCS1)

P

P

P

20µg E0904-20UG ¥108,200 N ＝ N 末端タグ　C ＝ C 末端タグ　neor_{＝安定発現に関するネオマイシン耐性（G418 でセレクション可能）}

PPT ＝直接分泌に関するプレプロトリプシンリーダー　c-Myc ＝ c-Myc エピトープ　ampr _{＝アンピシリン耐性遺伝子}

Ek ＝エンテロキナーゼ切断部位

哺乳類用発現ベクター一覧表

発現ベクター　キット紹介

哺乳動物用

N

末端

FLAG®

安定発現キット

Mammalian Amino-terminal FLAG Stable Expression Kit

哺乳動物用 N末端FLAG安定発現キットには、哺乳動物細胞中でリコンビナントN末端FLAG融合タンパク質を発現させるために

必 要 な 専 用 のFLAGコ ン ポ ー ネ ントが 用 意 さ れ て い ま す。pFLAG-CMV3™（CAT.NO.E8770）、pFLAG-CMV4™（CAT. NO.E1775）発現ベクターにより、融合タンパク質を分泌性、あるいは細胞質で一過性または安定発現させることができます。安定

発現はネオマイシン選択（G 418）です。また、キットには発現、検出やアフィニティー精製用のコントロールが付属します。

キット構成

ANTI-FLAG® M2 monoclonal antibody ANTI-FLAG M5 monoclonal antibody C-CMV-24 sequencing primer N-CMV-30 sequencing primer FLAG Peptide

Met-FLAG-BAP™ control protein pFLAG-CMV-3-BAP control plasmid pFLAG-CMV-4-BAP control plasmid pFLAG-CMV-4 expression vector (no leader) pFLAG-CMV-3 expression vector (preprotrysin leader)

製品名 CAT.NO. 価格(¥) 哺乳動物用 N末端FLAG安定発現キット FLMAS-1KT 145,400 キット同梱発現ベクター Hin d III Not I Eco R I Bgl II Eco R V Kpn I Xba I Bam H I

発

 

現

関連製品

CAT.NO.

価格

LB

培地　（

1x

溶液）

L2542

L2542-500ML

3,500

LB

培地（錠剤）

1

錠

50mL

用

L7275-100TAB

12,200

LB

ブロス

EZMix ™

粉末

L7658-6X500ML

4,900

LB

アガー培地（錠剤）

1

錠

50mL

用

L7025

L7025-100TAB

12,900

アガー（寒天）

A1296

A1296-100G

7,300

LB

アガー

EZMix

粉末

L7533-6X500ML

6,500

アンピシリン（アンピシリンナトリウム塩）

A0166-25G

34,300

カナマイシン（カナマイシン硫酸塩）

K1377-1G

4,500

G 418

（

G418

二硫酸塩）

A1720-1G

17,400

D-

グルコース

G7021

G7021-100G

5,600

IPTG

（

Isopropyl

β

-D-1-thiogalactopyranoside) I5502

I5502-1G

9,600

X-gal (5- Bromo- 4- chloro- 3- indolyl

β

-D-galactopyranoside)

B9146-100MG

19,400

プラスミド精製ミニプレップキット（

10

回分）

PLN10

PLN10-1KT

3,700

プラスミド精製ミニプレップキット（

70

回分）

PLN70

PLN70-1KT

7,800

プラスミド精製ミニプレップキット（

350

回分）

PLN350

PLN350-1KT

37,800

その他発現関連製品

タンパク質抽出

タンパク質を精製するためには、用いるサンプル（大腸菌、動物由来細胞など）や目的タンパク質の局在（細 胞質、細胞壁、培養上清など）に応じて、最適な方法で抽出する必要があります。また、プロテアーゼによる 分解の懸念も考慮しなければならずプロテアーゼ阻害剤などを添加する必要もあります。一般的なタンパク質 抽出法には、温和な方法（凍結融解、界面活性剤抽出など）やより強力な抽出法（超音波破砕など）がありま すが、代表的な方法をいくつかご紹介します。 タンパク質抽出関連製品リストは詳しくは

P.15

をご覧ください。 超音波破砕（大腸菌） 超音波破砕は、細胞懸濁液に高周波数の音波を送ることで行われます。音波により生じるせん断力が固形物を 破壊し、組織と細胞を分解します。大量の細胞を処理することができますが、手作業によるところが多いため、 少量の溶媒を使う場合などに適しています。 使用する試薬 超音波破砕用バッファー（Sonication buffer） Tris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl 50–200 mM 還元剤 5–10 mM プロテアーゼインヒビターカクテル 手順

1

．遠心（

3,000g

で

15

分間）して細胞を回収する。

2

．

1

∼

4

倍容積（質量：容積）の氷冷した超音波破砕用バッファー（

Sonication

buffer

）で再懸濁する。

3

．

10

分間氷冷する。プロテアーゼインヒビターカクテルを添加し、十分に混和す る。注意：プロテアーゼインヒビターには水溶液中の半減期が短いものもある ため（

PMSF

など）、調製後すぐに添加することが重要です。

4

．細胞懸濁液を氷冷したまま

10

秒間超音波処理し、

20

秒間冷却してから次の処理 を行う。

10

回程度繰り返す。注意：気泡が入るとタンパク質が変性することが あるため、できるだけ避けてください。また、超音波ホーンがガラスに直接接 触するとガラスが割れるおそれがあります。

5

．遠心（

20,000g

で

20

分間）して細胞残屑を沈殿させる。可溶性分画を回収して 保存する。 注意：タンパク質が封入体内で発現している場合は、不溶性分画を保存し、変性バッ ファー内で溶解する必要があります（ヒスチジン精製用の変性平衡バッファー は後述します）。

プロテアーゼインヒビターカクテルのラインアップは

P.17

をご覧ください

4˚C

抽

 

出

凍結融解（培養細胞）

凍結融解法では、氷の結晶を成長させて細胞に穴をあける方法です。サンプルが高濃度であるため、少量の タンパク質の研究に理想的な方法です。

1999

年に

Rudolph

らによって初めて発表されました（

Anal Biochem

269, 66–71

）。 使用する試薬 溶解用バッファー（Lysis buffer） Tris-HCl, pH 7.8 20 mM KCl 600 mM Glycerol 20% 手順

1

．培地を吸引し、氷冷

PBS

で洗浄する

 

。

2

．少量の氷冷

PBS

から細胞をかき集め、微量遠心チューブに移す。

3

．遠心（

10,000g

で

30

秒間）して細胞を沈殿させ、上清を慎重に取り除く。

4

．溶解用バッファー（

Lysis buffer

）に再懸濁する （

10cm

のプレートあたり

50

µ

L

）。

5

．液体窒素中で急速凍結する。

6

．融解するまで氷冷し、これを

2

回繰り返す。

7

．ベンゾナーゼ

®

（

CAT.NO.E1014

）

250

単位を添加し、 室温で

10

分間インキュベートする。 注意：ベンゾナーゼはゲノム

DNA

の消化によりライセートの粘度を下げることから、 サンプルはピペッティングしやすくなり、クロマトグラフィー溶液に移しやすく なります。

4˚C

関連製品

CAT.NO.

価格 トリス塩酸塩（

Trizma®

塩酸塩）

T5941-100G

3,700

トリス塩基（

Trizma

塩基）

T6791-100G

8,300

Trizma Pre-set crystals BioPerformance Certified, pH 7.8

T8193-100G

19,100

グリセロール

G5516-100ML

5,600

界面活性剤抽出（酵母）の場合 界面活性剤抽出はあらゆるスケールの抽出に適し、特に

Saccharomyces cerevisiae

と合わせて使用したときは 酵素的溶解の必要がありません。全てのステップは

4

℃で行います。

 

使用する試薬 抽出試薬 CAT.NO.

CelLytic™ Y Cell Lysis Reagent C4482 インヒビターカクテル

Yeast Protease Inhibitor Cocktail, DMSO solution P8215

手順

1

．遠心（

3,000g 

で

5

分間）して細胞を回収し、溶解用バッファーで再懸濁する（細 胞ペースト

1

グラムあたり

2.5

∼

5mL

）。

2

．穏やかに振り混ぜながら

15

∼

30

分間インキュベートする。

3

．遠心（

12,000g 

で

20

分間）して細胞残屑を沈殿させる、上清を保存する。 注意：

5

∼

10mM

の

DTT

を添加すると、タンパク質の収量が増加します（細胞を 対数増殖期の後に回収した場合は特に増加します）。

大腸菌（バクテリア）・哺乳動物細胞用　抽出試薬は

次のページをご覧ください。

抽

 

出

タンパク質抽出関連試薬

セルリティックシリーズ：タンパク質を効率的にかつ失活させずに抽出できる界面活性剤

CelLytic™

は各発現系に合わせて細胞を溶解し、タンパク質を抽出するために調製された試薬です。 プロトコールに従って操作するだけで簡単に細胞を溶解できます。

CelLytic

は数々のプロテアーゼインヒビター、 キレート剤、カオトロピック塩などと共に用いることが可能です。

CelLytic

を除去せずにアフィニティー精製やウ ェスタンブロット、ゲルシフトアッセイ、リポーター検出などを行えます。従来の凍結融解法や超音波破砕よりも 簡単・高収率で抽出できる試薬です。

【大腸菌（バクテリア）サンプル用】

サンプルタイプ 大腸菌（バクテリア）用

製品名 CelLytic B CelLytic B 2X CelLytic B 10X

CAT.NO./価格（¥） B7435-50ML B7435-500ML ¥ 47,500¥ 9,200 B7310-50ML B7310-250ML ¥ 17,500¥ 60,200 C8740-10ML C8740-50ML C8740-100ML ¥ 14,600 ¥ 48,200 ¥ 83,400 製品特徴 独自の両性イオン界面活性剤を配合した 40ｍM Trizma® HCl溶液。 CelLytic B全体の液量を減らしたい場合やタンパクの2倍濃縮タイプ。 濃度を高くしたい場合に適しています。 CelLytic Bの10倍濃縮タイプ。 バッファー成分不含のため、抽出試薬のカ スタマイズが可能です。 用法 バクテリア培養液を遠心して得た細胞ペ レットにCelLytic Bを添加して溶解します。 小スケール：1.5 mL培養からのペレットあ たり0.4 mL 大スケール：ペレット湿重量１gあたり10 ～20mL バクテリア培養液を遠心して得た細胞ペ レットにCelLytic Bを添加して溶解します。 小スケール：1.5 mL培養からのペレットあ たり0.2 mL 大スケール：ペレット湿重量１gあたり 5mL ご希望のバッファーで5、10、20倍希釈 でご使用下さい。バクテリア培養液を遠 心して得た細胞ペレットにCelLytic Bを添 加して溶解します。 小スケール：1.5 mL培養からのペレットあ たり希釈したCelLytic 0.4 mL 大スケール：ペレット湿重量1gあたり希釈 したCelLytic 10～20mL 菌株/細胞株 BL21 DH5α® JM109等 BL21 DH5α JM109等 BL21 DH5α JM109等 界面活性剤のタイプ 両性イオン 両性イオン 両性イオン サンプルタイプ 大腸菌（バクテリア）用

製品名 CelLytic B Express CelLytic B Express Tablet CelLytic B plus kit

CAT.NO./価格（¥） C1990-25ML C1990-10X25ML C1990-6X500ML ¥ 4,800 ¥ 25,200 ¥ 165,100 C5491-25EA C5491-100EA ¥ 13,600¥ 41,500 CB0050-1KT CB0500-1KT ¥ 113,100¥ 33,900 製品特徴 培養液を遠心せずにワンステップでタンパ ク質を抽出できます。 CelLytic Expressは、界面活性剤や酵素 などを独自配合した粉末です。CelLytic Expressにより得られた細胞ライセートも そのままアフィニティー精製することが可 能です。 CelLytic B Expressの錠剤タイプです。 25個入り、100個サイズがあります。 しいグラム陽性菌の溶解に必要な試薬が本キットにはグラム陰性菌および溶解が難 揃っています（CelLytic B、Lysozyme、 Benzonase®、Protease inhibitor Cocktail）。FLAG®、ポリヒスチジン、 GSTなどのタグ融合タンパク質精製に適 用可能。CB0050は少量サイズ（5gのサ ンプル）、CB0500は50gサンプルサイズ です。 適用サンプル 培養液中のバクテリア（大腸菌） （遠心不要） （遠心不要）培養液中のバクテリア（大腸菌） グラム陰性・陽性菌 用法 小スケール：25mL培地に対し1パック （25mLサイズ） 大スケール：500mL培地に対し1パック （500mLサイズ） 培地1mLに対し、1錠使用。 ペレット湿重量１gあたり10mL（CB0050 は50mL、CB0500は500mLのCelLytic Bが付属） 菌株 BL21 DH5α JM109等 BL21 DH5α JM109等 BL21 DH5α JM109等

【哺乳動物細胞用】

サンプルタイプ 哺乳動物細胞用

製品名 CelLytic™ M RIPA Buffer Mammalian Cell Lysis Kit

CAT.NO./価格（¥） C2978-50ML _C2978-250ML ¥ 12,500_{¥ 42,900} R0278-50ML _R0278-500ML ¥ 10,900_{¥ 65,800} MCL1-1KT ¥ 64,400 製品特徴 培養哺乳類細胞から効果的に全細胞タン パク質を抽出するためにデザインされた、 マイルドな界面活性剤を含む Ready-to-use試薬です。浮遊細胞、付着細胞のど ちらからでも効果的で迅速な細胞溶解と タンパク質可溶化が可能です。 一般的な細胞溶解用のReady-to-use溶 液。 50mM Tris-HCl （pH8.0）、150mM NaCl、1% IGEPAL® CA-630、0.5%　デ オキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS含 有。 免疫沈降やウェスタンブロット用のタンパ ク質溶解に適しています。 哺乳類細胞と組織溶解用に必要な全ての 試薬が揃っています（5×バッファー（ Tris-EDTA）、5×NaCl、5×SDS、5×デオキシコー ル酸、5×IGEPAL CA-630、Protease Inhibitor Cocktail）。

1キットでリシスバッファー250mL分 （100mmプレート250枚の抽出可能）

適用サンプル 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効。 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効。 付着細胞と浮遊細胞の両方に有効。

細胞株例 ・HeLa・Jurkat・HL-60・COS・PC-12・ A431・CHO

・Bovine Aorta Endothelial Cells（BAEC） など

哺乳類細胞株 ・ HeLa・CHO・Jurkat・PC-12・COS・ Bovine Aorta Endothelial Cells（BAEC） など 用法 浮遊細胞：125 µL/106_～107_個 付着細胞：500～1,000µL/100mmプレー トあるいは200～400µL/35mmプレー ト RIPAバッファー　1mLで100mmプレー トの細胞（0.5～5×107_{個）溶解。} リシスバッファーは付着細胞または浮遊細_胞106_～107_{個につき1mL使用。} 組織5～20mgにつき1mL使用。 界面活性剤のタイプ マイルドな界面活性剤（非公開）/透析可 能 非イオン性および陰イオン性 非イオン性および陰イオン性

【その他】

サンプルタイプ 酵母用

製品名 CelLytic Y CelLytic Y PLUS KIT

CAT.NO./価格（¥） C4482-50ML C4482-500ML ¥ 58,200¥ 9,700 CYP1-1KT ¥ 117,100 製品特徴 効果的な酵母細胞溶解およびタンパク質 可溶化のためのリン酸フリーな溶液です。 タンパク質を変性させず抽出します。 酵母細胞の溶解・タンパク質抽出に必要 な試薬が揃っています（反応バッファー、 DTT、Lyticase、抽出バッファー、Triton™ X-100、Protease Inhibitor Cocktail）。

適用サンプル 酵母細胞 酵母細胞 用法 酵母細胞1gあたり2.5～5mL 1キットで酵母細胞10～40gからスフェロ プラスト形成とタンパク質抽出可能 細胞株 ・様々なSaccharomyces cerevisiae[Y187,Y190,W303（a）、 S288C、SP1、Σ1278b、BJ2168、 cdc25] ・Schizosaccharomyces pombe ・Saccharomyces cerevisiae ・Pichia pastoris ・Schizosaccharomyces pombe 界面活性剤のタイプ マイルドな界面活性剤（非公開） （非公開） その他の溶解試薬は以下をご参照下さい http://www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/recombinant-protein-expression/cell-lysis.html

抽

 

出

プロテアーゼ

&

ホスファターゼインヒビターカクテル

サンプルタイプ 一般用 大腸菌（バクテリア）用

CAT.NO./ 価格（¥） P2714-1BTL ¥ 8,700 I3911-1BO ¥ 13,000 S8820-2TAB ¥ 8,700 P8465-5ML ¥ 11,700 S8820-20TAB ¥ 80,100 P8465-25ML ¥ 43,800 阻害特異性 セリンプロテアーゼ ○ ○ ○ ○ システインプロテアーゼ ○ ○ ○ ○ アスパラギン酸プロテアーゼ ○ メタロプロテアーゼ ○ ○ ○ ○ アミノペプチダーゼ ○ 形状 凍結乾燥粉末（水溶性） （100mL分） （凍結乾燥粉末（水溶性）100mL分） 錠剤（水溶性）個包装 凍結乾燥粉末　+DMSO（別バイアル） 調製方法 容器に10mLのバッファーを 入れて粉末を溶かし、別の 容器に移して100mLに希釈 （=1x 濃度） ※ 10mL に溶解後（10x濃度 の状態）、分注して-20℃で1ヶ 月保存可能 容器に10mLのバッファーを 入れて粉末を溶かし、別の 容器に移して100mLに希釈 （=1x 濃度） ※ 10mL に溶解後（10x濃度 の状態）、分注して-20℃で1ヶ 月保存可能 1 錠で100 mLの1x カクテ ル （10 mLに溶解して10ｘ濃度 でも調製可能） ・5MLサイズ…1mLの DMSO で溶解後、4mLの水 で希釈 ・25MLサイズ…5mLの DMSOで溶解後、20mLの 水で希釈 使用量目安 細胞溶解液100mLあたり1 本（1BTL） 細胞溶解液本（1BO）100mLあたり1 り各種細胞溶解液1錠（1TAB）100mL あた 細胞溶解液液1mL 20mL あたり本溶 組成（調製後の濃度） AEBSF ○(2mM) ○ ○(2mM) ○(23mM) アプロチニン ○(0.3µM) ○ ○(0.3µM) ベスタチン ○(130µM) ○ ○(130µM) ○(2mM) EDTA ○(1mM) ○ ○(1mM) ○(100mM) E-64 ○(14µM) ○ ○(14µM) ○(0.3mM) ロイペプチン ○(1µM) ○ ○(1µM) ペプスタチンA ○(0.3mM) 特長 ・動物由来原料不使用 ・タブレット型 保存温度（未開封時） -20℃ -20℃ 2-8℃ -20℃ サンプルタイプ 哺乳動物用 培地添加用（分泌タンパク質） CAT.NO./ 価格（¥） P8340-1ML ¥ 9,800 I3786-1ML ¥ 17,900 P1860-1ML ¥ 21,100 P8340-5ML ¥ 33,900 I3786-5ML ¥ 60,800 阻害特異性 セリンプロテアーゼ ○ ○ ○ システインプロテアーゼ ○ ○ ○ アスパラギン酸プロテアーゼ ○ ○ ○ メタロプロテアーゼ アミノペプチダーゼ ○ ○ ○

形状 DMSO溶液 DMSO溶液 DMSO溶液

調製方法 そのまま使用可能 そのまま使用可能 そのまま使用可能

使用量目安 細胞または組織溶解液10-100mLあた

り1mL り細胞または組織溶解液1mL 10-100mLあた 培地に対してるように添加200倍以上の希釈率にな A431, COS細胞 = 1/200 CHO, HeLa, HepG2, Jurkat, HL-60細胞 = 1/800 組成（調製後の濃度） AEBSF ○(104mM) ○ アプロチニン ○(80µM) ○ ○ ベスタチン ○(4mM) ○ ○ EDTA E-64 ○(1.4mM) ○ ○ ロイペプチン ○(2mM) ○ ○ ペプスタチンA ○(1.5mM) ○ ○ 特長 ・動物由来原料不使用 保存温度（未開封時） -20℃ -20℃ -20℃

プロテアーゼインヒビターカクテル

ホスファターゼインヒビターカクテル ホスファターゼインヒビターカクテル2 ホスファターゼインヒビターカクテル3 CAT.NO./ 価格（¥） P5726-1ML ¥ 14,900 P0044-1ML ¥ 14,400 P5726-5ML ¥ 50,700 P0044-5ML ¥ 48,200 阻害特異性 ・チロシンホスファターゼ ・酸性ホスファターゼ ・アルカリホスファターゼ ・セリン/スレオニンホスファターゼ ・アルカリホスファターゼ（L-アイソザイム） 形状 水溶液 DMSO溶液 調製方法 そのまま使用可能 そのまま使用可能 使用量目安 各種の細胞・組織溶解液100mLあたり1mL 各種の細胞・組織溶解液100mLあたり1mL 組成 ・オルトバナジン酸ナトリウム ・モリブデン酸ナトリウム ・酒石酸ナトリウム ・イミダゾール ・カンタリジン ・(-)- ブロモレバミゾール ・カリクリンA 特長 ・2種類添加で幅広くホスファターゼを阻害可能 ・ウシ肝臓、ヒト胎盤、ウサギ筋肉など様々な動物組織およびA431 やJurkat細胞で試験済み 保存温度（未開封時） 2-8℃ 2-8℃

ホスファターゼインヒビターカクテル

サンプルタイプ His タグ融合タンパク質用 酵母・真菌用 植物用 CAT.NO./ 価格（¥） P8849-1ML ¥ 11,100 S8830-2TAB ¥ 8,700 P8215-1ML ¥ 11,700 P9599-1ML ¥ 11,100 P8849-5ML ¥ 38,300 S8830-20TAB ¥ 77,100 P8215-5ML ¥ 42,300 P9599-5ML ¥ 38,300 阻害特異性 セリンプロテアーゼ ○ ○ ○ ○ システインプロテアーゼ ○ ○ ○ ○ アスパラギン酸プロテアーゼ ○ ○ ○ ○ メタロプロテアーゼ ○ ○ ○ アミノペプチダーゼ ○ ○ サーモリシン様プロテアーゼ ○

形状 DMSO溶液 錠剤（水溶性）個包装 DMSO溶液 DMSO溶液

調製方法 そのまま使用可能 1錠で100 mLの1xカクテル （10 mLに溶解して10ｘ濃度 でも調製可能） そのまま使用可能 そのまま使用可能 使用量目安 各種細胞溶解液100mL あた り1mL り各種細胞溶解液1錠（1TAB）100mL あた たり酵母細胞の溶解液1mL 100mL あ 植物組織の溶解液たり1mL 100mL あ 組成（調製後の濃度） AEBSF ○ ○ (2mM) ○ (100mM) ○ アプロチニン ○ (0.2µM) ベスタチン ○ ○ (130µM) ○ EDTA E-64 ○ ○ (14µM) ○ (1.4mM) ○ ロイペプチン ○ (1µM) ○ ペプスタチンA ○ ○ (10µM) ○ (2.2mM) ○ ホスホラミドン ○ ○ (1µM) 1.10- フェナントロリン ○ (500mM) ○ 特長 ・EDTA不含 ･EDTA不含 ･タブレット型 保存温度（未開封時） -20℃ 2-8℃ -20℃ -20℃

精

 

製

タンパク質の精製

従来、タンパク質はその本来の性質（大きさ、荷電、疎水性など）に基づいてクロマトグラフィーにより精製さ れてきました。近年ではエピトープタグを使うことにより、アフィニティークロマトグラフィーで全てのタンパク質 を精製することが出来るようになりました。これにより手順が簡素化され、

1

回の精製操作で高純度の調製液を 得ることができます。 最も一般的な

2

種類のアフィニティー精製法として、金属親和性樹脂を用いる方法（ヒスチジンタグ用）と抗体 樹脂結合体を用いる方法（通称、免疫沈降法）があります。抗体樹脂結合法の代表的なものとして、

FLAG®

タグや

c-Myc

などがあげられます。

FLAGタグによる精製法は巻末のFLAG特集（P.48）をご覧ください。

ヒスチジン-タグ融合タンパク質の精製 ヒスチジン

-

タグ融合タンパク質は、ニッケルイオンに対するヒスチジン反復配列の親和性を使って精製されま す。このプロトコールでは、小規模の調製用に

HIS-Select®

スピンカラム（

CAT.NO. H7787

）を使っていますが、 大規模な調製はアフィニティーゲル（

CAT.NO. P6611

）を使って行うことができます。

 

ヒスチジンタグはタンパク質のフォールディングによって隠され、樹脂への結合が妨げられることがあります。し かしニッケル樹脂は変性剤と適合性があるため、変性条件下で精製を行うことによりこの問題が解決されること があります。変性条件とは、抽出中に

8M

尿素（

CAT.NO. U1250

）でタンパク質を可溶化し、変性バッファー のプロトコールを使うだけです。一般的に一度変性したタンパク質を機能的に畳み直す（

Refolding)

ことは難し いとされています。 使用する試薬 平衡バッファー（Equilibration Buffer） 非変性 変性 Sodium phosphate pH 8.0

50 mM

50 mM

Sodium chloride

0.3 M

̶

Urea

̶

8 M

洗浄バッファー（Wash Buffer） Sodium phosphate pH 8.0

50 mM

50 mM

Imidazole

5 mM

5 mM

Sodium chloride

0.3 M

̶

Urea

̶

8 M

溶出バッファー（Elution Buffer）

Sodium phosphate pH 8.0

50 mM

50 mM

Imidazole

250 mM

250 mM

Sodium chloride

0.3 M

̶

Urea

̶

8 M

1

．

HIS-Select®

スピンカラムを回収チューブ内に置く。

2

．平衡バッファー

600

µ

L

をスピンカラムに加える。

3

．スピンカラムに蓋をし、

1,000rpm

（

823g

）、室温で

1

分間遠心する。注意：

HIS-Select

スピンカラムは精製段階で適切なバキュームマニホールドと使用す ることもできます。

4

．回収チューブからスピンカラムを取り出す。

5

．回収チューブを空にし、スピンカラムを戻す。

6

．調製した細胞抽出液

600

µ

L

をこのカラムで一度に遠心する（

823g

で

1

分間）。

7

．回収チューブからスピンカラムを取り出す。後の解析のためフロースルーを取り 出して保存する（必要があれば）。注意：発現タンパク質が存在した場合、樹脂 への結合に問題があったことが考えられます。

8

．新しい回収チューブを使い、洗浄用バッファー

600

µ

L

によりスピンカラムから非 結合タンパク質を洗浄する（

823g

で

1

分間）。解析のためフロースルーを取り 出して保存する（必要があれば）。注意：発現タンパク質が存在した場合、樹脂 への結合又は洗浄用バッファーの状態に問題があったことが考えられます。

9

．洗浄用バッファー

600

µ

L

で洗浄ステップを繰り返す。

10

．新しい回収チューブを使い、

500

µ

L

以下の溶出用バッファーにより標的タンパ ク質を溶出する（

823g

で

1

分間）。 注意

1

）尿素を含むバッファーは毎日新しく調製してください。ヒスチジンタグが融 合した遺伝子組み換え型タンパク質には、

pH5.0

∼

6.0

で溶出しないものもあるた め、（タンパク質に応じて）溶出用バッファーの

pH4.5

∼

6.0

の間で変化させる必 要があることもあります。タグ融合遺伝子組み換え型タンパク質がこの範囲内で溶 出しない場合は、

pH4.5

まで下げて試してください。

 

注意

2

）平衡バッファーと洗浄用バッファーには

1

∼

10mM

イミダゾールと

0.15

∼

0.5M

塩化ナトリウムを添加し、非特異的タンパク質結合をブロッキングしてくだ さい。このキレート特有の選択性のため、洗浄用バッファーに

5mM

イミダゾール を添加することで、高純度のサンプルを十分得ることができます。その他の試薬を 使用する場合は、データシートにある試薬適合表をご確認ください。 関連製品

CAT.NO.

価格 リン酸ナトリウム一塩基性（リン酸二水素ナトリウム）

S0751-100G

2,700

塩化ナトリウム

for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none

detected, ≥ 98%

S3014-500G

5,500

HIS-Select

溶出バッファー

H5413-250ML

28,700

イミダゾール

I5513-5G

7,700

精

 

製

免疫沈降法 免疫沈降法（

IP

）とその後の

SDS-PAGE

とイムノブロッティングは、次のような様々な用途に日常的に利用され ています。

 

タンパク質／タンパク質相互作用の研究 タンパク質抗原の分子量の決定 翻訳後修飾のモニタリング

 

この手法は基本的に、小規模のアフィニティ―精製法です。タンパク質は抗体結合アガロースで精製されます。 アガロースは不溶性であるため、抗体に結合した相手分子は全て、遠心によって溶液から分離することができま す。

 

エピトープタグに対する抗体が結合したアガロース（樹脂）は市販されていますが、その他にプロテイン

A

や

G,

L

が結合したアガロースも市販されています。プロテイン

A, G, L

はイムノグロブリンに結合する性質があるため、 目的のタンパク質に対する抗体を添加した後にこれらを使うことで、間接的な免疫沈降が可能になります。プロ テイン

A, G, L

のどれを用いるかは、

1

次抗体の由来動物種及びアイソタイプによって異なります（以下表参照）。

Species Immunoglobulin Protein A Protein G Protein L

Human IgG (normal) ++++ ++++ ++++

IgG1 ++++ ++++ ++++ IgG2 ++++ ++++ ++++ IgG3 - ++++ ++++ IgG4 ++++ ++++ ++++ IgM - - ++++ IgA - - ++++ IgE - - ++++ IgD - - ++++ Fab ++ ++ ++++ K light chains - - ++++ L light chains - - -ScFv ++ - ++++ Mouse IgG1 + ++++ ++++ IgG2a ++++ ++++ ++++ IgG2b +++ +++ ++++ IgG3 ++ +++ ++++ Rat IgG1 - + ++++ IgG2a - ++++ ++++ IgG2b - ++ ++++ IgG2c + ++ ++++ Bovine IgG ++ ++++

-Cat IgG ++++ - N/A

Chicken IgG - + ++

Dog IgG ++++ ++++ +

Goat IgG +/- ++

-Guinea Pig IgG ++++ ++ ++

Hamster IgG + ++ ++++

Horse IgG ++ ++++

+/-Pig IgG +++ +++ ++++

Rabbit IgG ++++ +++ +

-使用する試薬

抗体アガロース結合体又は

1

次抗体とプロテイン

A

または

G, L

結合アガロース。

例えば抗

c-Myc

抗体アガロース（

CAT.NO. A7470

）及びプロテイン

G-

アガロース（

CAT.NO. E3403

）など。

直接免疫沈降法（マイクロカラム）

この手順は抗

c-Myc

抗体アガロース（

CAT.NO. A7470

）のプロトコールから引用しています。抗体との相互 作用は往々にしてバッファーの組成の変化に影響を受けます（スーパー抗原も同様ですが、これよりは弱い程度 です）。したがって良好な結果を得るためには、各種抗体製品に添付されるプロトコールに従うことをお勧めしま す。

FLAG®

タグの免疫沈降法に関しては巻末の特集（

P.48

）をご覧ください

1

．

c-Myc

抗体アガロース

50

％懸濁液

40

∼

100

µ

L

を、マイクロ遠心チューブ又は スピンカラムにピペットで移す。

2

．マイクロ遠心チューブ内において最高速度で

10

秒間遠心する。上清を廃棄する。

3

．遠心してアガロースを沈殿させることで、

PBS 1mL

でアガロースを

5

回洗浄する。

4

．透明な細菌ライセート又は細胞抽出液をアガロースペレットに添加する。

5

．必要に応じて

PBS

又は

RIPA

バッファーにより

200

µ

L

以上にする。

6

．ローテーターを使い室温又は

4

℃で

1.5

時間インキュベートする。

7

．

PBS

又は溶解用バッファー

1mL

でアガロースを

4

回洗浄する。

8

．最終洗浄後、上清を吸引し、アガロース上に約

10

µ

L

を残す。

9

．マイクロ遠心チューブ内において最高速度で

10

秒間遠心する。上清を捨てる。 HNTG buffer HEPES, pH 7.5 20 mM NaCl 150 mM TRITON™ X-100 0.1% (w/v) Glycerol 10% (w/v)

Washing buffer (Ice cold): HNTG buffer

or PBS, pH 7.4 (CAT.NO.P4417) or other buffers e.g., RIPA buffer

精

 

製

ラージスケール（

5mL

）の手順 免疫沈降法はラージスケールのアフィニティー精製にも利用できます。この手順は抗

c-Myc

抗体アガロース （

CAT.NO. A7470

）のプロトコールから引用しています。他の樹脂については、これを一部変更して使用でき ます。

1

．空のクロマトグラフィーカラム（

10mL

自然落下式カラム）を固い支持体の上に 置き、

PBS

でリンスする。

2

．カラムからバッファーを流し、樹脂がパッキングされるようカラム内に

PBS

を残す。

3

．アガロースが入っているバイアルを十分に懸濁して均質な懸濁液とし、望ましい 容量を直ちにカラムに移す。

4

．アガロースベッドを静置させる。乾燥させないようにする。

5

．

0.1M

水酸化アンモニウム（

pH 11

∼

12

）

5mL

による洗浄を

3

回連続して行い、 更に

PBS 5mL

による洗浄を

3

回連続して行う。

6

．カラムにライセートを添加し、自然落下させる。注意：融合タンパク質の種類と 流量に応じて、タンパク質が全て結合しないこともあります。カラムに数回かけ る、又は添加したカラムに蓋をしてローテーターで

1

時間インキュベートするこ とで、結合効率が改善することがあります。

7

．非結合タンパク質のフロースルーを解析用に回収する。

8

．フロースルーの

OD280

が

0.01

未満になるまで、カラムを

PBS

で洗浄する。

9

．結合した

c-Myc

タグ融合タンパク質を

0.1M

水酸化アンモニウム（

pH 11

∼

12

）

1mL

（

×10

）でカラムから、中和のため

1N

酢酸

30

∼

50

µ

L

を含むバイアルに 溶出する。注意：低

pH

に長時間曝露されると、カラムで活性が失われることが あります。

間接免疫沈降法

間接免疫沈降法により、更に幅広いタンパク質を精製することができます。抗体複合体を「沈殿させる」ため にはプロテイン

A

または

G, L

結合アガロースが使われるため、必要なものは標的タンパク質に対する抗体だけ です。

2

つの結合反応が生じるため（プロテイン

A

または

G, L

結合アガロース

-

抗体反応と抗体

-

ライセート反応）、 この手法には

2

つのバリエーション、すなわち

Resin first

（レジンが先）と

Lysate first

（ライセートが先）があ ります。

Resin first

法

1

．洗浄用バッファーでアガロース結合体を

2

回 洗浄し、

12,000g

で

10

秒間、室温で遠心する。 上清を捨てる。注意：アガロース結合体が粉 末である場合は、脱イオン水を加えて

5

分間 おいて膨潤させます。

2

．アガロース結合体を洗浄用バッファーで再懸 濁する（

50

％懸濁液）。

3

．アガロース結合体を

50

∼

100

µ

L

に分け（ベッ ド容量あたり

25

∼

50

µ

L

）マイクロ遠心チュー ブに入れる。

4

．適切な希釈倍率（抗体仕様参照）の

1

次抗体

10

µ

L

を各チューブに添加する。

5

．室温で

15

∼

60

分間インキュベートし、ローテー ターでサンプルを穏やかに混和する。

6

．

3,000g

、

4

℃で

2

分間遠心し、上清を捨てる。

7

．洗浄用バッファー

1mL

で少なくとも

3

回サン プルを洗浄し、

3,000g

、

4

℃で

2

分間遠心し て上清を捨てる。

8

．各チューブに細胞ライセート

0.1

∼

1.0mL

を 添加する。

9

．

4

℃で

90

分間から一晩、ローテーターでサン プルを穏やかに混和しながらインキュベートす る。

10

．

3,000g

、

4

℃で

2

分間遠心し、上清を捨てる。

11

．洗浄用バッファー

1mL

で少なくとも

4

回サン プルを洗浄し、

3,000g

、

4

℃で

2

分間遠心し て上清を捨てる。

Lysate First

法

1

．洗浄用バッファーでアガロース結合体を

2

回 洗浄し、

12,000g

で

10

秒間、室温で遠心する。 上清を捨てる。注意：アガロース結合体が粉 末である場合は、脱イオン水を加えて

5

分間 おいて膨潤させます。

2

．アガロース結合体を洗浄用バッファーで再懸 濁する（

50

％懸濁液）。

3

．細胞ライセートのサンプル（

0.1

∼

1.0mL

） を取り出し、適切な希釈倍率（製品仕様書参 照）の抗体

10

µ

L

を添加する。

4

．

4

℃で

90

分間から一晩、ローテーターでサン プルを穏やかに混和しながらインキュベートす る。

5

．アガロース結合体の懸濁液

50

∼

100

µ

L

を添 加する（ベッド容量あたりアガロース

25

∼

50

µ

L

）

4

℃で

15

∼

60

分間、ローテーターでサ ンプルを穏やかに混和しながらインキュベート する。

6

．

3,000g

、

4

℃で

2

分間遠心し、上清を捨てる。

7

．洗浄用バッファー

1mL

で少なくとも

4

回サン プルを洗浄し、

3,000g

、

4

℃で

2

分間遠心し て上清を捨てる。

精

 

製

精製関連製品紹介

HIS

タグ精製 製品名 説明 CAT.NO. 価格(¥)

HIS-Select® Nickel Affinity Gel よく 使われています 小から中スケールのヒスチジンタグ融合タンパク質精製用レジンです。キレ ート基とアガロースが独自の非電荷親水性結合しているため、ヒスチジンタ グ融合タンパク質に対する選択性を高め、他のタンパク質との非特異的結合 を低減させます。選択性が高いため、単一工程で精製できます。アフィニテ ィーゲルは、変性条件と非変性条件のいずれにおいても使用できます。 マトリックス： 6% アガロースビーズ 結合能： >15 mg/mLゲル（約30 kDaのタンパク質の場合） 形 状： 30%のエタノール溶液に50%のアガロースビーズを懸濁 P6611-5ML P6611-25ML P6611-100ML P6611-500ML 17,500 52,800 167,800 722,600

HIS-Select HF Nickel Affinity Gel 大規模での精製およびFPLC™用途に使用できるよう設計されたヒスチジン タグ融合タンパク質精製用のNickel Affinity Gelです。HIS-Select High Flow (HF) は、HIS-Select技術の優れた選択性を高度に架橋したアガロー スに付与することで、加圧下での高流速および機械的安定性を実現しまし た。 マトリックス： 高架橋6%アガロースビーズ 結合能： >15 mg/mLゲル（約30 kDaのタンパク質の場合） 形 状： 30%のエタノール溶液に50%のアガロースビーズを懸濁 H0537-1ML H0537-10ML H0537-25ML H0537-100ML H0537-500ML 9,200 36,800 73,500 233,300 957,100

HIS-Select Cobalt Affinity Gel ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製に、アフィニティー金属としてコバルト をお使いになりたい方にお勧めです。HIS-Select Cobalt Affinity Gel は高 純度、低非特異的結合、高結合容量のレジンです。ヒスチジンタグ融合タ ンパク質を変性条件と非変性条件のいずれにおいても精製できます。 マトリックス：6% アガロースビーズ 結合能： >15 mg/mLゲル（約30 kDaのタンパク質の場合） 形 状：30%のエタノール溶液に50%のアガロースビーズを懸濁 H8162-5ML H8162-25ML H8162-100ML 20,600 74,200 224,800

HIS-Select Nickel Spin Columns HIS-Select Spin Columnはスモールスケールの細胞抽出液からヒスチジン タグ融合タンパク質を高速かつ安定的に精製できるready-to-use のスピン カラムです。低非特異的吸着、高純度タンパク質精製を達成する HIS-Select テクノロジーを用いたシリカ粒子マトリクスが充填されています。15 分以内で精製できます。 結合能: 1カラムあたり500 µg以上 H7787-10EA H7787-50EA 25,90092,500

EZview™ Red HIS-Select HC

Nickel Affinity Gel レジンは無色なため識別しにくいことがあります。プルダウン法のような小量スケールの精製を行う際、マイクロチューブ内のEZview Red Affinity Gel は、レジンが赤色に着色しているため、沈殿と上清を容易に識別できます。 そのため、沈殿を吸引するリスクを劇的に減少させます。EZviewレジンは 通常の無着色レジンと同様の性質を持ちます。目的タンパク質のロスを少な くすることで、より正確なデータを得ることができます。 アガロースビーズ（赤色）の50%懸濁液（PBS, 50%グリセロール、抗菌・ 防腐剤として0.0015% Kathon® CG/IPCII含有） 結合能：＞15 mg/mLゲル E3528-1ML E3528-5X1ML 30,1008,900

HIS-Select iLAP® 5 mL Column HIS-Select iLAP（Integrated Lysis and Affinity Purification：溶解および

アフィニティー一体型精製）カラムは、細胞溶解およびタンパク質精製ステ ップを一度に行えます。 カラムは、ヒスチジンタグ付きタンパク質を5 mL の細菌培養から直接1 ス テップで精製できるようにデザインされています。この1 ステップ法は、 Sigma の特許取得済みiLAP テクノロジーを使用しており、これにより、組 み換えクローン株からのヒスチジンタグ付きタンパク質精製を迅速かつ簡便 に行えます。 ■ カラム1 本で、大腸菌培養液5 mL から1 mg以上のヒスチジンタグ付き タンパク質を1時間未満で精製 ■ 精製タンパク質は、プロテインアッセイ、SDS-PAGE、ウェスタンブロッ ティング、およびMALDIに使用できます H9913-1EA H9913-25EA 81,6009,200

HIS-Select Wash Buffer HIS-Select洗浄バッファーは、10 mMイミダゾール溶液です。非変性条件

において、HIS-Select製品を用いてヒスチジンタグ融合タンパク質を精製す

る際、洗浄ステップで非特異的タンパク質結合の低減に最適です。 組 成： 10 mMイミダゾール, 0.3 M塩化ナトリウム, 50 mMリン酸ナトリウ

ム含有(pH 8.0)。

H5288-500ML 28,700

HIS-Select Elution Buffer HIS-Select溶出バッファーは、250 mMイミダゾール溶液です。HIS-Select 製品やその他の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー製品からヒス チジンタグ融合タンパク質の溶出に最適です。

組 成：250 mMイミダゾール, 0.3 M塩化ナトリウム, 50 mMリン酸ナトリ ウム含有(pH 8.0)

ＨＡタグ精製

製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格(¥)

Anti-HA Agarose Affinity Gel

よく 使われています 特異性： N 末端およびC 末端HA（YPYDVPDYA）タグ融合タ ンパク質 形 状： 0.01M PBS (pH 7.4, 15 mM アジ化ナトリウム含有) との1:1 懸濁液, 抗体/ レジン固定率：2.0 ～ 2.4mg/ mL 結合能力： HA 融合タンパク質 30 ～ 50 nmol/mL ゲル 標　識： アガロースビーズ ■免疫沈降 ■免疫アフィニティ精製 A2095-1MLA2095-5X1ML 330,40091,100 EZview™ Anti-HA Agarose Affinity Gel

よく 使われています 特異性： N 末端またはC 末端HA（YPYDVPDYA）タグ融合 タンパク質 結合能力： HA タグ融合タンパク質約0.4 mg/mL ゲル（27 kDaタンパク質の場合） 形 状： アガロースビーズ（赤色）の50%懸濁液（PBS, 50%グリセロール、抗菌・防腐剤として0.0015% Kathon® CG/IPCII含有） ■免疫沈降 E6779-1ML E6779-5X1ML 256,20061,600 HA Peptide 分子量： 1102.2 形 状： 凍結乾燥粉末

解 説： human influenza virus hemagglutinin (HA)の 98-106 アミノ酸に相当する合成ペプチド アミノ酸配列： Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala ■HA 融合タンパク質の 競合的溶出 標準使用濃度 ■ 5 ～ 10µg/mL I2149-.5MG I2149-1MG 13,70023,000 Anti-HA Immunoprecipitation

Kit Anti-HA Immunoprecipitation KitHAタグ融合タンパク質を最大限に回収します。マイクロ遠心は、免疫沈降において チューブの代わりにミニスピンカラムで全ての処理を行うた め、抗原-抗体結合ビーズの洗浄が簡単で、実験ごとのばら つきは最小限に抑えられます。哺乳動物細胞を迅速・効果的 に溶解する細胞溶解試薬CelLytic™ M Cell Lysis Reagentも キットに含まれています。 ■免疫沈降 ■免疫アフィニティ精製 IP0010-1KT 128,000 その他タグ精製 製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格(¥) Anti-c-Myc Agarose

Affinity Gel 特異性： N 合タンパク質末端およびC 末端 c-Myc タグ(EQKLISEEDL) 融 形 状： 0.01M PBS（pH7.4, 15 mM アジ化ナトリウム含有） との1:1 懸濁液 結合能力： c-Myc 融合タンパク質約2 nmol/mLゲル 標 識：アガロースビーズ ■免疫沈降 ■免疫アフィニティ精製 A7470-1ML 98,200

EZview Red Anti-c-Myc

Affinity Gel 特異性：形 状： c-Myc 赤色アガロースビーズのタグ融合タンパク質PBS懸濁液（50%グリセ ロール、抗菌・防腐剤として0.0015%Kathon CG/ IPCII 含有） ■免疫沈降 E6654-1ML E6654-5X1ML 270,60096,800 c-Myc Peptide 分子量： 1203.3 形 状： 凍結乾燥粉末 解 説：ヒトc-Myc のC 末端の410-419 アミノ酸に相当す る合成ペプチド アミノ酸配列： Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu ■ c-Myc 融合タンパク質 の競合的溶出 標準使用濃度 ■ 5 ～ 10 µg/mL M2435-1MG M2435-4MG M2435-25MG 15,300 38,500 177,500 Anti-c-Myc

Immunoprecipitation Kit 免疫沈降においてきるよう、特別にデザインされたキットです。工程はマイクc-Mycタグタンパク質を最大限に回収で ロチューブではなくミニスピンカラム中で行われるので、抗 原・抗体結合ビーズを簡便に洗浄でき、実験ごとの結果のば らつきも最小限に抑えられます。哺乳動物細胞を迅速・効 果的に溶解する細胞溶解試薬CelLytic M Cell Lysis Reagent もキットに含まれています。1キット50回分。

■免疫沈降

■免疫アフィニティ精製 IP0020-1KT 128,200

Anti-V5, Agarose Affinity

Gel 特異性：します。 V5 タグ(GKPIPNPLLGLDST) 融合タンパク質を認識 形 状： 0.01M PBS（pH 7.4, 15 mM アジ化ナトリウム含有） との1:1 懸濁液 結合能力： V5タグ融合タンパク質約2.5 nmol/mLゲル 標 識：アガロースビーズ ■免疫沈降 ■免疫アフィニティ精製 A7345-1ML 99,400 V5 Peptide 分子量：1524.8 解 説： パラミクソウイルスSV5の非構造タンパク質Vお よびRNAポリメラーゼαサブユニット（Pタンパク 質）の95-108アミノ酸に相当する配列のN末端に システインを付加した合成ペプチド 形 状： 凍結乾燥粉末 アミノ酸配列： Cys-Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr ■ V5 融合タンパク質の 競合的溶出 標準使用濃度 ■ 5 ～ 10 µg/mL V7754-4MG 52,600 Glutathione Agarose lyophilized powder 特異性：結合能力： GST 5～（グルタチオン10 mg（GST）-S- /mL トランスフェラーゼ）レジン 形 状： 凍結乾燥粉末（安定化のためラクトース含有） 粉末1 gを10.5～16.0 mLに膨潤させて使用 標 識：架橋4%アガロースビーズ ■アフィニティ精製 G4510-1ML G4510-5ML G4510-10ML G4510-50ML 9,200 28,700 41,400 142,500 EZview Red Glutathione Affinity

Gel 特異性：結合能： GST 5～（グルタチオン10 mg（GST） /mL -S-トランスフェラーゼ）レジン 形 状：アガロースビーズ（赤色）の50%懸濁液（PBS, 50%グリセロール、抗菌・防腐剤として0.0015% Kathon CG/IPCII含有） 標 識: 架橋4%アガロースビーズ ■アフィニティ精製 E6406-1ML E6406-5X1ML 22,200 83,400

精

 

製

FLAG

タグ精製 製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格(¥)

FLAG®

アフィニティゲル ANTI-FLAG® M1 Agarose Affinity Gel

特異性： N末端FLAG融合タンパク質用（Ca2+依存性）。 Ca2+イオンの欠如で抗原-抗体複合体は解離します。 細胞質内で発現したMet-FLAG融合タンパク質とは 反応しません。プロセッシングされていない細胞質発 現したタンパク質を認識しません。 結合能力：タンパク質>0.6mg/1mL gel、結合にはCa2+が 必要 溶　出： FLAGペプチド、グリシン緩衝液（pH3.5）、EDTA 形　状：アガロースビーズの50%懸濁液（PBS, 50%グリセ ロール, 0.02%（w/v）アジ化ナトリウム含有） ■ 免疫沈降 ■ N末端FLAG融合タンパク質 の精製 A4596-1ML A4596-5ML A4596-10ML A4596-25ML 64,400 139,600 249,700 480,900 ANTI-FLAG M2 Agarose Affinity Gel よく 使われています 特異性：すべての位置のFLAGおよび3xFLAG™ 融合タンパ ク質 結合能力： タンパク質 > 0.6mg/1mL gel 溶　出： FLAGペプチド、3xFLAGペプチド、グリシン（pH 3.5） 形　状：アガロースビーズの50%懸濁液（PBS, 50%グリセ ロール, 0.02%（w/v）アジ化ナトリウム含有） ■ 免疫沈降 ■ FLAG、3xFLAG融合タンパク 質の精製 A2220-1ML A2220-5ML A2220-10ML A2220-25ML 33,000 98,000 198,000 439,000

EZview™ _Red

ANTI-FLAGM2 Affinity Gel 特異性：質すべての位置のFLAG および3xFLAG 融合タンパク 結合能力：≧0.6mg/1mL gel 溶　出： FLAGペプチド、グリシン（pH 3.5）、 3xFLAGペプチド 形　状：赤色アガロースビーズのPBS懸濁液（50%グリセロ ール、抗菌・防腐剤として0.0015% Kathon® CG/ IPCII含有） ■免疫沈降 ■ FLAG、3xFLAG 融合タンパク 質の精製 F2426-1ML F2426-5X1ML 200,00078,000 FLAG ペプチド FLAG Peptide よく 使われています アミノ酸配列： Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 分子量： 1013.0 形　状： 凍結乾燥粉末 ■ FLAG融合タンパク質の ANTI-FLAG M1及びM2 アフ ィニティゲルからの溶出 ■ 標準使用濃度： 100µg/mL F3290-4MG F3290-25MG 111,20021,800 3xFLAG Peptide よく 使われています アミノ酸配列： Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr- Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 解　説： Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp 配列が3回繰り返されて います。C末端の8アミノ酸は標準的なFLAG配列 (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 分子量： 2861.9 形　状：凍結乾燥粉末 ■ 3xFLAG融合タンパク質の ANTI-FLAG M2 アフィニティゲ ルからの溶出 ■ 標準使用濃度： 100µg/mL F4799-4MG F4799-25MG 261,60061,700

FLAG M

精製キット

FLAG M Purification Kit

FLAG M Purification KitではCelLytic™ _{Mを用いて哺乳動物細胞の迅速かつ効果的}

な溶解・タンパク質抽出を行い、ANTI-FLAGM2アフィニティゲルを用いてFLAGタ グ融合タンパク質のアフィニティ精製を行います。特異性の高いモノクローナル抗体を アガロースに共有結合したANTI-FLAG M2 アフィニティゲルにより精製や免疫沈降を 行います。アフィニティゲルを用いることにより、前処理やキャリブレーションしなくて も、効率的にFLAG融合タンパク質を結合させることができます。結合した融合タン パク質は酸性条件や3xFLAGペプチドによる競合で効果的に溶出できます。溶出され たタンパク質は活性、サイズ、翻訳後修飾、相互作用などの分析に用いることができ ます。 1mLアフィニティ精製カラムで3～5回分の試薬が入っています。 ご注文情報 製品名 CAT.NO. 価格(¥)

FLAG M Purification Kit CELLMM2-1KT 146,200

キット構成

CelLytic M 10x Wash Buffer Elution Buffer 3xFLAG Peptide

ANTI-FLAG M2-Agarose Affinity Gel Amino-terminal FLAG-BAP™ Fusion Protein Polypropylene chromatography column